Einfach und robust In-vivo- Und In-vitro- Ansatz für das Studium Virusassemblierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Virusassemblierung in vivo und in vitro zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst RNAs des Bro-Mosaikvirus in Bakterien exprimiert und diese mithilfe einer Agroinfiltration Pflanzenzellen ausgesetzt werden. Anschließend werden die BMV-Virionen aus den infiltrierten Blättern gereinigt.

Anschließend werden Kapsidproteinsubunits für die in-vitro-Assemblierung präpariert. Schließlich werden BMV-Varianten in vitro unter Verwendung des Kapsidproteins und des Indocyaningrün-Farbstoffs assembliert. Letztendlich zeigen die Ergebnisse die in vitro assemblierten Bro-Mosaic-Varianten durch die Bildung optischer Geisterstrukturen, die anhand der Absorption und Emission von Fluoreszenz bestimmt werden können.

Heute werden wir eine Technik namens Filtration vorstellen, die nützlich ist, um virale Komponenten an Pflanzen abzugeben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, die Herstellung von in-vitro-Transkripten zu vermeiden und gleichzeitig mehrere Komponenten in dieselbe Zelle einzubringen, was eine synchronisierte Infektion ermöglicht. Die Arbeit, die wir derzeit durchführen, beinhaltet die Verwendung des Broccoli-Mosaikvirus in Kombination mit einem von der FDA zugelassenen Chromophor im Cyanid-Grün, um eine Art neuartiges Nanopartikel für biomedizinische Anwendungen herzustellen.

Und insbesondere ist es unsere Absicht, diese Konstrukte – die wir als optische Draht-Geister oder OB gs bezeichnen – für optische Bildgebungsverfahren einzusetzen, einschließlich der Fluoreszenzbildgebung und der photoakustischen Bildgebung, sowie als Trägersystem für die Lasertherapie. Eine konkrete klinische Anwendung, mit der wir uns derzeit beschäftigen, ist der Einsatz dieser Konstrukte zur Bildgebung von Eierstockkrebs in Kombination mit intraoperativen Verfahren. Die Idee dabei ist, dass wir diese Konstrukte funktionalisieren können.

Die OBG mit der spezifischen Zielstrukturmotiv, das residuelle Tumorzellen erkennen kann, die im Fall von Ovarialkarzinom insbesondere in der Bauchhöhle lokalisiert sein können. Von einer Platte zuvor vorbereiteter Agrobacterium-Stämme, die das RNA-Molekül des Brown-Mosaic-Virus enthalten, eine einzelne Kolonie auswählen, um 2 Milliliter LB-Medium, das 50 Mikrogramm pro Milliliter Kanamycin und 100 Mikrogramm pro Milliliter Rifampicin enthält, zu beimpfen. Die Kultur einen Tag lang bei 28 °C in einem Rüttelinkubator bei 250 U/min inkubieren. Am folgenden Tag 50 Milliliter LB in einem 500-Milliliter-Erlenmeyerkolben mit 1 Milliliter der Kultur beimpfen und 16 Stunden bei 28 °C in einem Rüttelinkubator bei 250 U/min inkubieren. Sobald die Kulturen einen OD600 von 1,0 erreicht haben, sie in sterile 30-Milliliter-Röhrchen überführen und 10 Minuten lang zentrifugieren.

Bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius die Pellets in 10 Milliliter 10 Millimolar Magnesiumchlorid auflösen und 10 Minuten bei 5.000 U/min und vier Grad Celsius zentrifugieren. Diesen Schritt noch einmal wiederholen, um eine vollständige Entfernung des Antibiotikums sicherzustellen. Anschließend die Pellets in 10 Milliliter Puffer, der 10 Millimolar MES und 10 Millimolar Magnesiumchlorid enthält, suspendieren.

Messen Sie den OD 600 für jede Kultur und stellen Sie diesen mit 10 Millimolar Magnesiumchlorid und 10 Millimolar MES auf einen OD 600 von 0,1 ein. Kombinieren Sie anschließend je 10 Milliliter der drei Kultur-Suspensionen mit einem OD 600 von 0,1. Fügen Sie Acetophenon bis zu einer Endkonzentration von 100 Millimolar hinzu.

Vorsichtig mischen und die Mischung drei Stunden lang ungestört bei Raumtemperatur belassen. Nach der Inkubation die Kultur in eine Ein-Milliliter-Spritze ohne Nadel aufziehen. Die Kultursuspension in die adaxiale Seite von zwei bis drei gut entfalteten Blättern von N. benthamiana infiltrieren, indem die Spritze sanft auf jeweils eine Hälfte der abaxialen Oberfläche jedes Blattes gedrückt wird.

Die infiltrierten Pflanzen drei bis vier Tage lang im Gewächshaus bei 24 Grad Celsius aufbewahren, bevor die Blätter geerntet werden. Nach der Reinigung der BMV-Virionen ein Liter einfacher Virus-Dissociationspuffer herstellen. Danach Dialysemembran vorbereiten.

Nach der Methode von Sambrook et al. werden fünf bis 10 Milligramm pro Milliliter gereinigtes Virus in einen Dialysebeutel pipettiert und der Beutel in einen Kolben mit 1× Virus-Dissociationspuffer gegeben. Das Virus wird 24 Stunden bei vier Grad Celsius unter Rühren dialysiert.

Sammeln Sie die Lösung aus dem Dialysebeutel und zentrifugieren Sie sie bei 30.000 U/min 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius, um nicht assoziierte Viruspartikel zu pelletieren. Zentrifugieren Sie das Überstand bei 30.000 U/min drei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Nach der Herstellung der RNA-Transkripte, die zu Virionen reassembliert werden sollen, mischen Sie die Kapsidproteinsubunits und die RNA-Transkripte im Verhältnis von eins zu fünf.

Geben Sie die Mischung in einen Dialysebeutel und verschließen Sie ihn ordnungsgemäß, um Leckagen zu vermeiden. Nachdem Sie einen Liter 1x RNA-Assemblierungspuffer hergestellt haben, dialysieren Sie die Reassemblierungsreaktionsmischung am folgenden Tag 24 Stunden lang bei vier Grad Celsius im Puffer, entnehmen Sie die Mischung aus dem Dialysebeutel und geben Sie 1,5 Milliliter RNA-Assemblierungspuffer hinzu. Zentrifugieren Sie anschließend erneut bei 30.000 U/min für drei Stunden bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie danach den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet.

Als Nächstes schätzen Sie die Virionenkonzentration bei 260 Nanometern OD ein. Bestimmen Sie anschließend die Konzentration der Kapsidproteinsubuniten bei 280 Nanometern OD oder mit anderen Methoden wie dem Bradford-Assay, um die Integrität der dissoziierten Kapsidproteinsubuniten zu überprüfen. Führen Sie eine 12 bis 15 %ige SDS-Gelelektrophorese durch, gefolgt von einer Western-Blot-Analyse. Schließlich befolgen Sie das in der schriftlichen Anleitung beschriebene Verfahren, um optische virale Geister oder ov-Käse herzustellen.

Hier ist ein transmissions­elektronen­mikroskopisches Bild einer negativ kontrastierten BMV-Variante dargestellt, die aus Enden von Hamana-Pflanzen gereinigt wurde, welche mit einer Mischung aus allen drei wildtypischen BMV-Agri-Konstrukten agroinfiltriert worden waren. Dieses TEM-Bild zeigt negativ kontrastierte, optische virale Geisterpartikel, die Indocyaningrün enthalten. Hier werden Absorptions- und Fluoreszenzspektren für optische virale Geisterpartikel gezeigt, sobald diese beherrscht sind.

Diese Technik kann pro Probe innerhalb von fünf Minuten durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie virale oder nicht-virale Komponenten in Kapsidproteinsubunits eingeschlossen werden können.