Name: Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 41 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Charakterisierung von HPV-spezifischen T-Zell-Klonen mittels Interferon-γ-ELISpot-Assay. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer T-Zell-Epitope für Immuntherapien.

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Diese Studie wurde durch einen American Cancer Society Scholars Award (RSG-06-180-01-MBC) und NIH-Zuschüsse (R01 CA143130 und UL1RR029884) unterstützt.

<ol><li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+favorable+clinical+trend+is+associated+with+CD8+T-cell+immune+responses+to+the+human+papillomavirus+type+16+e6+antigens+in+women+being+studied+for+abnormal+pap+smear+results%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Low.+Genit.+Tract+Dis%22%5BJournal%5D)">A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results.</a> J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).</li>
<li>Walls, E., Crawford, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalls%2C+E+%22Lymphocytes%3A+A+practical+approach%22">Lymphocytes: A practical approach</a>. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+CD8+T-cell+epitopes+within+the+human+papillomavirus+type+16+%28HPV+16%29+E6+protein+among+young+women+whose+HPV+16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).</li>
<li>Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+CD4+T-cell+epitope+described+from+one+of+the+cervical+cancer+patients+vaccinated+with+HPV+16+or+18+E7-pulsed+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol.+Immunother%22%5BJournal%5D)">A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells.</a> Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).</li>
<li>Larsson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+vaccinia+virus+based+ELISPOT+assay+detects+high+frequencies+of+Pol-specific+CD8+T+cells+in+HIV-1-positive+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals.</a> AIDS. 13, 767-777 (1999).</li>
<li>Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+T+lymphocyte+responses+to+E6+and+E7+proteins+of+human+papillomavirus+type+16%3A+relationship+to+cervical+intraepithelial+neoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia.</a> J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).</li>
<li>Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+T+cells+specific+for+novel+human+papillomavirus+type+16+%28HPV16%29+E6+epitopes+in+women+whose+HPV16+infection+has+become+undetectable%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable.</a> Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).</li>
<li>Evans, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+processing+defects+in+cervical+carcinomas+limit+the+presentation+of+a+CTL+epitope+from+human+papillomavirus+16+E6%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6.</a> J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).</li>
<li>Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+CD8%2B+T+cells+recognize+EBV+antigen+but+poorly+kill+autologous+EBV-infected+B+lymphoblasts%3A+immunodominance+is+elicited+by+a+peptide+epitope+that+is+presented+at+low+levels+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro.</a> J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).</li>
<li>Varadarajan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+single-cell+analysis+of+human+CD8%2B+T+cell+functions+reveals+discordance+for+cytokine+secretion+and+cytolysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis.</a> The Journal of Clinical Investigation. , (2011).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+methods+of+identifying+new+antigenic+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+and+E7+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Diagn.+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins.</a> Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).</li>
<li>Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HLA+class+I+binding+promiscuity+of+the+CD8+T-cell+epitopes+of+human+papillomavirus+type+16+E6+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein.</a> J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).</li>
<li>Brown, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+epitope+%22hotspots%22+on+the+HIV+Type+1+gp120+envelope+protein+overlap+with+tryptic+fragments+displayed+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).</li>
<li>Masemola, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+promiscuous+CTL+epitopes+in+conserved+regions+of+Gag+targeted+by+individuals+with+early+subtype+C+HIV+type+1+infection+from+southern+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa.</a> J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).</li>
<li>Walker, B. D., Korber, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+control+of+HIV%3A+the+obstacles+of+HLA+and+viral+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity.</a> Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Traditionell versuchten Immunologen, neuartige T-Zell-Epitope zu charakterisieren, indem sie die betreffenden T-Zellen in vitro stimulierten und einen Grenzverdünnungsversuch durchführten, um die epitopspezifischen T-Zellklone zu isolieren. Anschließend wurden die T-Zellklone mittels Chromfreisetzungsassay charakterisiert8,9. Viele Versuche blieben jedoch erfolglos, da die Frequenz der T-Zellen möglicherweise zu gering war, um sie isolieren zu können, oder weil nicht genügend T-Zellklonzellen zur Verf...

<table><tbody><tr><td>CD8-T-Zell-Isolationskit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-156</td><td></td></tr><tr><td>Phytohämaggglutinin</td><td>Remel, Thermo Fisher Scientific</td><td>R-30852801</td><td>2 mg/Fläschchen</td></tr><tr><td>Yssel&amp;rsquo;s Medium</td><td>Gemini Bio Products</td><td>400-102</td><td>1 % humanes gepooltes Serum</td></tr><tr><td>Rundboden-96-Well-Platte</td><td>BD Biosciences</td><td>08-772-17</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes IL-2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>202-IL-050</td><td>50&amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>24-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>07-200-84</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Cellgro</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Primärer monoklonaler Anti-IFN-&amp;#947;-Antikörper (D1K)</td><td>Mabtech</td><td>3420-3-1000</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-konjugierter monoklonaler Anti-IFN-&amp;#947;-Antikörper (7B-6)</td><td>Mabtech</td><td>3420-6-1000</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HA ELISPOT-Platte</td><td>EMD Millipore</td><td>MAHA S45 10</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>100-ml-Flasche</td></tr><tr><td>Gepooltes Serum, human</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S40510H</td><td>Hitzeinaktivierung</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Cellgro</td><td>MT-10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>NC9313719</td><td></td></tr><tr><td>Stabiles Diaminobenzidin</td><td>Open Biosystems</td><td>MBI 1241</td><td></td></tr><tr><td>AID EliSpot Reader Classic</td><td>Autoimmun Diagnostika GmbH</td><td>ELR06</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung von interferon-γ enzyme-linked immunospot assay zur novel t-zell-epitope des humanen papillomvirus charakterisieren

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Es wurde ein Protokoll entwickelt, um die Schwierigkeiten bei der Isolierung und Charakterisierung seltener, auf Krankheitserreger spezifischer T-Zellen zu überwinden, wie beispielsweise humanes Papillomavirus (HPV), das lokal begrenzte Infektionen verursacht. Die beteiligten Schritte umfassen die Identifizierung von Region(en) in HPV-Proteinen, die T-Zell-Epitop(e) von einem Probanden enthalten, die Selektion peptidspezifischer T-Zellen basierend auf der Sekretion von Interferon-γ (IFN-γ) sowie das Anzüchten und die Charakterisierung der T-Zell-Klone (Abb. 1). Proband 1 war ein Patient, bei dem kürzlich mittels Biopsie eine hochgradige intraepitheliale Plattenepithelläsion diagnostiziert worden war und der am Tag der T-Zell-Gewinnung eine elektrische Schlingenexzision zur Behandlung erhalten hatte1. Eine Region innerhalb der Proteine E6 und E7 des humanen Papillomavirus Typ 16 (HPV 16) wurde identifiziert, die ein T-Zell-Epitop enthält, und zwar mithilfe eines IFN-γ-Enzyme-Linked-Immunospot-(ELISPOT)-Assays, der mit überlappenden synthetischen Peptiden durchgeführt wurde (Abb. 2). Die Daten aus diesem Assay wurden nicht nur zur Identifizierung einer Region mit einem T-Zell-Epitop verwendet, sondern auch zur Abschätzung der Anzahl epitopspezifischer T-Zellen und zur Isolierung dieser Zellen anhand ihrer IFN-γ-Sekretion unter Verwendung kommerziell erhältlicher magnetischer Partikel (CD8-T-Zell-Isolationskit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Die ausgewählten IFN-γ-sekretierenden T-Zellen wurden verdünnt und einzeln in Gegenwart eines bestrahlten Futterzellen-Gemischs kultiviert, um das Wachstum einer einzelnen T-Zelle pro Mulde zu ermöglichen. Diese T-Zell-Klone wurden mittels eines IFN-γ-ELISPOT-Assays getestet, wobei Peptide verwendet wurden, die die identifizierte Region abdecken, sowie autologe, mit Epstein-Barr-Virus transformierte B-Lymphoblastoide Zellen (LCLs, wie von Walls und Crawford beschrieben beschafft)2, um die benötigte Anzahl an T-Zell-Klon-Zellen zu minimieren. Anstelle der üblicherweise im ELISPOT-Assay verwendeten 1 × 105 Zellen pro Mulde1,3 kamen 1.000 T-Zell-Klon-Zellen in Gegenwart von 1 × 105 autologen LCLs zum Einsatz, wodurch die benötigte Anzahl an T-Zell-Klon-Zellen drastisch reduziert wurde. Die autologen LCLs dienten nicht nur der Präsentation von Peptidantigenen an die T-Zell-Klon-Zellen, sondern sorgten auch für eine hohe Zelldichte in den Mullen, wodurch die epitopspezifischen T-Zell-Klon-Zellen IFN-γ sezernieren konnten. Dies gewährleistet eine erfolgreiche Durchführung des IFN-γ-ELISPOT-Assays. Ebenso wurden IFN-γ-ELISPOT-Assays verwendet, um die minimale und optimale Aminosäuresequenz des CD8-T-Zell-Epitops (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) und sein HLA-Klasse-I-Restriktionselement (B58) zu charakterisieren. Der IFN-γ-ELISPOT-Assay wurde außerdem mit autologen LCLs durchgeführt, die mit Vaccinia-Virus infiziert waren, das das HPV-16-E6- oder E7-Protein exprimierte. Das Ergebnis zeigte, dass das E6-T-Zell-Epitop endogen prozessiert wurde. Die Kreuzerkennung homologer T-Zell-Epitope anderer hochriskanter HPV-Typen wurde nachgewiesen. Diese Methode kann ebenfalls zur Beschreibung von CD4-T-Zell-Epitopen verwendet werden4.

Die Charakterisierung von T-Zell-Epitopen von Krankheitserregern, die lokalisierte Infektionen wie das humane Papillomvirus verursachen, ist aufgrund der begrenzten Anzahl von T-Zellen im Umlauf eine Herausforderung. Es wird eine Methode beschrieben, bei der seltene T-Zellen isoliert und charakterisiert wurden, ausgehend von einer sehr geringen Anzahl von Zellen.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

Es wurde ein Protokoll entwickelt, um die Schwierigkeiten bei der Isolierung und Charakterisierung seltener, pathogenspezifischer T-Zellen zu überwinden, wie beispielsweise solche gegen humane ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, HPV-Antigen-spezifische T-Zellklone aus Patienten zu isolieren, zu kultivieren und zu analysieren. Zunächst wird eine CD8+-T-Zelllinie etabliert, ein SBOT-Assay durchgeführt und die Häufigkeit antigen-spezifischer T-Zellen geschätzt. Nach der Isolierung der antigen-spezifischen T-Zellklone anhand der Sekretion von Interferon Gamma wird ein Hochdurchsatz-Screening-Interferon-Gamma-SBOT-Assay durchgeführt, um epitopspezifische T-Zellklone zu identifizieren.Charakterisieren Sie weiterhin die T-Zellklone hinsichtlich des minimalen optimalen Peptids. Epitopsequenzen bestimmen ebenfalls, ob das Epitop endogen verarbeitet wird. Identifizieren Sie das HLA-Restriktionselement und bewerten Sie Kreuzreaktivitäten gegenüber anderen Hochrisiko-HPV-Typen.Letztendlich besteht das Ziel darin, neuartige und klinisch relevante HPV-T-Zell-Epitope durch die Untersuchung und Charakterisierung antigenspezifischer T-Zellen aus spezifischen T-Zellen von Patienten zu beschreiben. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie dem LY-Assay zur Identifizierung antigenspezifischer T-Zellen liegt darin, dass die Erfolgswahrscheinlichkeit deutlich höher ist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, beispielsweise, welche Abschnitte des HPV von T-Zellen erkannt werden. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie oder Diagnose von Zervixkarzinomen, da Impfstoffe und Immuntherapien auf Grundlage des Wissens über T-Zell-spezifische Erkennungsmuster entwickelt werden können.Diese Methode kann Einblicke in CD8-T-Zell-Epitope liefern und kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie zum Beispiel CD4-T-Zell-Epitope. Ein Interferon-gamma-SPO-Assay mit einer aus Proband 1 etablierten CD8-T-Zelllinie zeigte, dass die Region H PV six 16 E 6 46 bis 70 ein T-Zell-Epitop enthält. Diese epitopspezifischen T-Zellen wurden basierend auf der Sekretion von Interferon gamma ausgewählt. Bereiten Sie die Fütterungszellmischung aus bestrahlten allogenen peripheren mononukleären Blutzellen, B-Lymphoblasten und Phytohämagglutinin in vollständigem E-Zell-Medium vor.Jetzt durch serielle Verdünnung der isolierten, epitopspezifischen T-Zellen in der Futterzellenmischung mit einem Mehrkanalpipettierer eine Konzentration von fünf Zellen pro Milliliter herstellen. 100 Mikroliter pro Vertiefung verdünnte, epitopspezifische T-Zellen in 96-Loch-Rundbodenplatten geben. Fünf Tage bei 37 °C und 5 % CO₂ kultivieren und die Zellen am Tag 11 bis 14 mit rekombinantem humanem Interleukin-2 stimulieren.Identifizieren Sie wachsende T-Zellklone visuell anhand großer Pellets am Boden der Plattenmulden. Manchmal verfärbt sich das Medium gelb. Bereiten Sie eine neue Fütterungszellmischung und komplettes ecel-Medium vor und pipettieren Sie jeweils einen Milliliter pro Mulde in eine 24-Mulden-Platte. Ein erfolgreicher Versuch hängt davon ab, T-Zell-Klone mit dem 200 µL-Mikropipettierer isolieren und vermehren zu können. Übertragen Sie die T-Zell-Klone einzeln in getrennte Vertiefungen der gefalteten Fütterungszellen. Wiederholen Sie dies, bis alle T-Zell-Klone übertragen wurden.Bestreichen Sie die Vertiefungen steriler sbot-Platten mit 50 Mikrolitern einer Fünf-Mikrogramm-pro-Milliliter-Lösung der primären monoklonalen Anti-Interferon-gamma-Antikörper nach einer einstündigen Inkubation bei vier Grad Celsius. Waschen Sie dreimal mit jeweils 200 Mikrolitern PBS.Dann blockieren Sie die unspezifische Bindung mit 50 Mikrolitern 5 % menschlichem Poolspeiserum in RPMI 1640. Entfernen Sie stets große Luftblasen, indem Sie sie mit einer sterilen Nadel platzen lassen. Inkubieren Sie eine Stunde bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2.Fügen Sie anschließend einmal 10 hoch 5 autologe LCLs in 50 Mikrolitern RPMI 1640 mit 5 % menschlichem Serum hinzu. Mischen Sie die Zellen jedes T-Zellklons mit einer Ein-Milliliter-Pipette und überführen Sie jeweils hundert Mikroliter in ein steriles Eppendorf-Röhrchen. Verdünnen Sie mit 500 Mikrolitern RPMI 1640, das 5 % gepooltes menschliches Serum enthält.Anschießend Zellen durch Zentrifugation pelletieren, das Überstand entfernen und die Zellen in 110 Mikrolitern RPMI 1640, das 5 % menschliches Serum enthält, resuspendieren. Nun jeweils 50 Mikroliter jeder klonalen Zellsuspension für eine schnelle Analyse in entsprechend positionierten Vertiefungen der beiden Ellis-Platten für die PHA-positiven Kontrollvertiefungen auftragen. Verbleibendes Medium aus mehreren Einor-Röhrchen vereinigen und jeweils 50 Mikroliter in die nächsten entsprechend positionierten Vertiefungen auftragen.Bereiten Sie außerdem Negativkontrolllöcher mit 50 Mikroliter Medium vor. Fügen Sie nun für die Testplatte 50 Mikroliter Peptide, die sich in der positiven Region befinden, in die Positivkontrolllöcher hinzu. Geben Sie 10 Mikroliter PHA-Stammlösung und 40 Mikroliter RPMI 1640 in die reine Mediumplatte.Fügen Sie 50 µL RPMI 1640 mit 5 % gepooltem menschlichem Serum hinzu und inkubieren Sie die Ellis-Platten über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2. Bewegen Sie die Platten während der gesamten Inkubationszeit nicht. Gießen Sie das Medium ab und waschen Sie die Vertiefungen dreimal mit jeweils 200 µL PBS, das 0,05 % Tween 20 enthält.Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter des biotinmarkierten anti-Interferon-gamma monoklonalen Antikörpers hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden lang. Waschen Sie dreimal mit jeweils 200 Mikrolitern PBS, der 0,1 % Tween 20 enthält. Geben Sie dann 50 Mikroliter frisch zubereiteten Avidin- und biotinylierten Meerrettichperoxidase-Konjugat hinzu und inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, der 0,1 % Tween 20 enthält, fügen Sie 50 Mikroliter stabiles Substrat hinzu.Dino Benzine ermöglicht die Farbentwicklung für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie nun dreimal mit 200 Mikrolitern entionisiertem Wasser. Lassen Sie die Platte vollständig trocknen.Zählen Sie die Spots mit einem automatisierten Ellis-Spot-Reader. Wählen Sie T-Zellklone zur Bestätigung der Epitopspezifität aus. Führen Sie dann den Ellis-Spot-Assay mit 10³ klonalen T-Zellen auf Reaktivität gegenüber jeweils einem der drei Peptide im Epitopbereich durch.Bereiten Sie autologe LCLs vor, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vom Wildtyp infiziert wurden, sowie autologe LCLs, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert wurden, das das HPV-16-E6- oder E7-Protein exprimiert. Führen Sie erneut den Ellis-Bot-Assay an ausgewählten T-Zellklonen durch, um die Reaktivität gegenüber autologen LCLs, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus vom Wildtyp infiziert wurden, mit der Reaktivität gegenüber autologen LCLs zu vergleichen, die mit dem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert wurden, das das HPV-16-E6- oder E7-Protein exprimiert, und zwar unter Verwendung ausgewählter T-Zellklone. Führen Sie zunächst einen Ellis-Spott-Assay mit einer Serie überlappender Neuner-Peptide durch, die den Epitopbereich abdecken.Führen Sie anschließend einen LY-Punktest zur Reaktivität gegenüber einer Reihe von Peptiden unterschiedlicher Länge durch. Fahren Sie mit einem Lie-Punktest mit einem Konzentrationsbereich weniger Peptide fort, die am ehesten die minimale und optimale Aminosäuresequenz enthalten.Stellen Sie allogene LCLs her, die von dem betreffenden menschlichen Probanden isoliert wurden und ein oder zwei HLA-Klasse-I-Moleküle teilen. Wählen Sie gut proliferierende T-Zellklone aus. Führen Sie einen ELISpot-Assay mit 105 allogenen LCLs und 103 T-Zellklon-Zellen sowie mit der minimalen und optimalen Peptidkonzentration von 10 Mikromolar durch.Nach der Charakterisierung der epitopspezifischen T-Zellklone können diese auf Kreuzreaktivität gegenüber anderen Hochrisiko-HPV-Typen getestet werden. Untersuchen Sie ausgewählte klonale T-Zellen mittels eines ELISpot-Assays auf Reaktivität mit Peptiden, die homologe Aminosäuresequenzen der anderen Hochrisiko-HPV-Typen enthalten. Probandin 1 ist eine 22-jährige afroamerikanische Frau mit einer kürzlich mittels Biopsie diagnostizierten hochgradigen squamösen intraepithelialen Läsion.Am Tag der Behandlung mittels elektrischer Exzision an der LU wurden T-Zellen von der Patientin gewonnen. Die Ergebnisse des Ellis-Spot-Assays ihrer CD8-T-Zelllinie zeigen, dass die HPV16-E6-Region 46 bis 70 ein T-Zell-Epitop enthält, basierend auf Interferon-gamma-Sekretionswerten von 1,2 × 10⁵. Epitopspezifische T-Zellen wurden nach limitierender Verdünnung auf ein Fünftel der ausgewählten Zellen angereichert.Es wurden 262 T-Zellklone gewonnen. Die verbleibenden ausgewählten Zellen wurden nicht verwendet, da der erste Versuch der T-Zellklonierung erfolgreich war. Der an 94 dieser Klone durchgeführte Hiro-put-Screening-Ellis-Fleck-Test identifizierte 62 positiv getestete Klone.Die verbleibenden T-Zellklone wurden nicht getestet, da der erste Ellis-Spott-Assay peptidspezifische T-Zellklone identifiziert hatte. Die epitopspezifische Natur von acht gut wachsenden, im Screening positiven Klonen wurde mit den drei einzelnen 15-MER-Peptiden, die den Bereich abdecken, bestätigt.Alle der T-Zellklone zeigten Positivität gegenüber den HPV 16 E6 51 bis 65 Peptiden. Sechs von acht Klonen waren positiv gegenüber dem E6 46 bis 60 Peptid, und keiner der Klone war positiv gegenüber dem E6 56 bis 70 Peptid. Dargestellt sind hier ELISpot-Assays mit autologen LCLs, die mit einem rekombinanten Vaccinia-Virus infiziert wurden, das das HPV 16 E6-Protein oder das E7-Protein exprimiert.Diese Ergebnisse zeigen, dass T-Zellklone ein endogen verarbeitetes E6-Epitop erkennen, und eine Reihe überlappender 9-mer-Peptide, die den HPV16 46–65-Bereich abdecken, ermöglichte die Charakterisierung der minimalen und optimalen Sequenz des T-Zellepitops. Die stärkste Antwort wurde mit dem E6 53–61-Peptid erzielt; überlappende Peptid-Epitope identifizierten das 10-mer-Peptid E6 52–61 als die minimale und optimale Sequenz, und zwar am konsistentesten. Interessanterweise zeigte das E6 53–61-Peptid eine ebenso starke Reaktion mit der T-Zellklon.Die Dosis-Wirkungs-Kurven Nummer 79 zeigen, dass das Peptid E 6 52 bis 61 die Positivität bei niedrigeren Peptidkonzentrationen deutlich effektiver beibehielt als das Peptid E 6 53 bis 61. In diesem Beispiel wurde Proband A, bei dem eine minimale und optimale Erkennung der Sequenz E 6 75 bis 83 festgestellt wurde, hinsichtlich der Restriktion durch ein HLA-Klasse-I-Molekül des CD8-T-Zell-Epitops analysiert. Eine hohe Positivität ist mit einer LCL sichtbar, die die Moleküle B 62 und CW 3 exprimiert. Während eine Hintergrundpositivität mit einer LCL gezeigt wird, die CW 3 exprimiert, sind einige Bereiche des HPV-Genoms gut konserviert.Beispielsweise waren homologe Sequenzen zu den HPV 16, E 6 52 bis 61 Regionen, die bei Proband eins identifiziert wurden, in 13 weiteren Hochrisiko-HPV-Typen vorhanden. Dementsprechend wurde eine starke Kreuzerkennung für acht der 13 Hochrisiko-HPV-Typen nachgewiesen. Wird die Technik einmal beherrscht, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von sieben Wochen ab dem Tag der Blutentnahme durchgeführt werden. Denken Sie daran, während des gesamten Verfahrens sterile Technik anzuwenden.Beachten Sie, dass die Arbeit mit Viren gefährlich sein kann, und ergreifen Sie stets Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Schutzkleidung, während Sie das Verfahren durchführen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man neuartige T-Zell-Es charakterisiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Identifizierung von mikrobiellen Ziele der adaptiven Immunität bei idiopathischer Krankheiten können durch die Verwendung des enzyme-linked immunospot Test durchgeführt werden.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): Quantifizierung von Th-1 zelluläre Immunantworten gegen mikrobielle Antigene

Dieses Video zeigt einen Immunfluoreszenz-Assay, der zur Messung der Neutralisation des humanen Cytomegalievirus (HCMV) entwickelt wurde. Virusspezifische Antikörper werden mit dem Virus gemischt und mit menschlichen Fibroblastenzellen inkubiert. Die Antikörper neutralisieren das Virus, so dass es die Wirtszellen nicht infizieren kann, während nicht neutralisierte Viren die Zellen infizieren. Nach der Inkubation wird das Ausmaß der Neutralisation durch Quantifizierung der virusinfizierten...

Eine Immunfluoreszenzmethode zur Messung der Neutralisation des humanen Cytomegalievirus

Dieser Artikel konzentriert sich auf die Identifizierung von High-Interaktion zuversichtlich Datensätze zwischen Wirt und Pathogen-Proteine ​​mit einer Kombination aus zwei orthogonal Methoden: Hefe-Zwei-Hybrid von einem High-Throughput-Assay Interaktion in Säugerzellen namens HT-GPCA gefolgt.

Komparativen Ansatz, um die Landschaft von Wirt-Pathogen-Protein-Protein-Wechselwirkungen charakterisieren

Neue Generationen von Funktionstests, wie Gamma-Interferon (IFN-γ) ELISpot, die Zytokin-Produktion zu erkennen an der Einzelzellebene und bieten sowohl quantitative und qualitative Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen können zum Zell-vermittelten Immunantworten gegen Varicella-Zoster-gerichtet zu bewerten Virus (VZV).

Entwicklung eines IFN-γ ELISPOT-Assay zu beurteilen, Varicella-Zoster-Virus-spezifische Zellvermittelte Immunität nach Nabelschnurblut-Transplantation

Langzeit-kultivierten Interferon-γ enzymgebundenen immunospot Assay wird als Maß der zentralen Speicher-Antworten verwendet, und korreliert mit Schutz antimykobakteriellen Impfstoff Antworten. Mit diesem Test werden die peripheren mononukleären Blutzellen mit mycobakteriellen Antigene und IL-2 für 14 Tage, so dass die Differenzierung und Expansion des zentralen Gedächtnis-T-Zellen stimuliert.

Anwendung von Langzeit kultiviert Interferon-γ Enzyme-linked Immunospot Assay zur Beurteilung Effektor und Gedächtnis-T-Zell-Antworten in Cattle

Wir beschreiben hier eine Isolierungsmethode zur Gewinnung humaner endozervikaler intraepithelialer Lymphozyten für die Analyse von intraepithelialen gamma delta T-Zellen. Dieses Protokoll kann für die Aufreinigung von endozervikalen Gamma-Delta-T-Zellen durch magnetische Beads oder durch Zellsortierung erweitert werden.

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie der Menschen Endozervikale Gamma-Delta-T-Zellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll um die Entwicklung und Validierung eines einzelnen Moleküls Array digitale ELISA Assays, ermöglicht ultra-sensitive Detektion von allen IFN-α-Subtypen in humanen Proben zu beschreiben.

Entwicklung und Validierung eines empfindsamen Einzelmolekül Array digitale Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay für menschliche Interferon-α

Die Entwicklung der Interferon-Gamma ELISpot Assay für Meerschweinchen PBMCs ermöglicht die Charakterisierung der T-Zell-Reaktionen in diesem hochaktuellen Modell für die Untersuchung von Infektionskrankheiten. Wir haben den Test zur Messung der T-Zell-Antworten intradermale Bereitstellung von DNA-Impfstoffen angewandt.

Optimierte Interferon-Gamma ELISpot Assay zur Maßnahme T-Zell-Antworten im Meerschweinchen-Modell nach der Impfung

Basierend auf einer von hepatitis-B-Virus (HBV) abgeleiteten Peptidmatrix konnten HBV-spezifische CD4-T-Zell-Reaktionen parallel zur Identifizierung von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Epitopen ausgewertet werden.

Analyse von HBV-spezifischen CD4-T-Zell-Reaktionen und Identifizierung von HLA-DR-beschränkten CD4-T-Zell-Epitopen auf Basis einer Peptidmatrix

Dieses Manuskript beschreibt, wie die In-vivo-Immunogenität von extrazellulären Vesikeln (EVs) aus Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. EVs, die von Tumoren stammen, die einem behandlungsinduzierten immunogenen Zelltod unterzogen werden, scheinen in der Tumorimmunüberwachung besonders relevant zu sein. Dieses Protokoll veranschaulicht die Beurteilung von Oxaliplatin-induzierten immunstimulierenden Tumor-EVs, kann aber an verschiedene Einstellungen angepasst werden.

Im lebenden Organismus Immunogenitätsscreening von tumorabgeleiteten extrazellulären Vesikeln durch Durchflusszytometrie von Milz-T-Zellen

Hier stellen wir ein Protokoll zum Nachweis von Neutralisationsepitopen auf antigenanzeigenden virusähnlichen Partikeln (VLPs) vor. Die Immunpräzipitation der aus dem humanen Immundefizienzvirus (HIV) abgeleiteten VLPs erfolgt unter Verwendung von Hüllglykoproteinen-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die an Protein G-konjugierte magnetische Kügelchen gekoppelt sind. Gefangene VLPs werden anschließend einer SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse unter Verwendung viraler...

Nachweis neutralisationsempfindlicher Epitope in Antigenen, die auf VLP-basierten Impfstoffen (Virus Like Particle) mit einem Capture-Assay angezeigt werden

Lernen Sie die Isolierung und Charakterisierung von HPV-spezifischen T-Zell-Klonen mittels Interferon-γ-ELISpot-Assay. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung neuer T-Zell-Epitope für Immuntherapien.

Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

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