Generierung von Organotypische Floßkulturen aus primären humanen Keratinozyten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, organotypische Raft-Kulturen aus primären Keratinozyten oder etablierten epithelialen Zelllinien zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst Fibroblasten-Kollagen-Stopfen hergestellt werden. Anschließend werden epitheliale Zellen auf die Stopfen aufgebracht.

Anschließend werden die Plugs auf die Raft-Gitter übertragen und 10 bis 14 Tage lang an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche kultiviert. Im letzten Schritt werden die Rafts geerntet. Letztendlich können Veränderungen in der epithelialen Differenzierung durch histologische oder immunhistochemische Analyse bewertet werden. Diese Methode kann Einblicke in die epitheliale Differenzierung liefern.

Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, wie beispielsweise Viren, die im Rahmen ihres Lebenszyklus das kutane oder das Mukosepithel infizieren. Die Durchführung der Methode wird von Dan Anneker, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Gießen Sie zunächst Chromschwefelsäure in ein Glasbecherglas und tauchen Sie die Metallrähmchen darin eine Stunde lang ein.

Danach die Gitter kontinuierlich über Nacht mit Leitungswasser spülen. Nach dem nächtlichen Spülen die Gitter weitere drei bis fünf Stunden mit doppelt destilliertem Wasser spülen und die Floßgitter trocknen lassen. Anschließend drei Seiten des Floßes um etwa 0,5 Zentimeter nach oben biegen, wobei der Abstand zwischen den gebogenen Seiten gleich sein sollte, und die Floßgitter autoklavieren.

Nach der Herstellung des Kollagengels wird Trypsin zugegeben, um die beiden Fibroblasten zu lösen, und anschließend wird das Trypsin mit Medium neutralisiert. Überführen Sie die Fibroblasten in ein 50-Milliliter-Konikalfläschchen und zählen Sie die Zellen, um die Anzahl der herstellbaren Rafts zu bestimmen. Nachdem die Zellen vier Minuten bei 244 ×g bei Raumtemperatur zentrifugiert wurden, aspirieren Sie das Medium vom Fibroblasten-Pellet und resuspendieren die Zellen in einer geeigneten Menge Rekonstitutionspuffer aus DMEM und Kollagen entsprechend der berechneten Anzahl an Rafts.

Das Kollagen zuletzt hinzufügen, um zu verhindern, dass das Gel zu schnell gerinnt. Sobald das Kollagen hinzugefügt wurde, die Lösung schnell, aber vorsichtig mischen, um die Bildung von Blasen im Gel zu vermeiden. Falls die Gel-Mischung zu gelb ist, einige Tropfen filtersterilisiertes hinzufügen.

Eine normale Natriumhydroxidlösung. Vorsichtig mischen, bis das Gel eine rötlich-orangefarbene Färbung annimmt, die auf den korrekten pH-Wert hinweist. Nun pipettieren Sie langsam drei Milliliter der Kollagen-Fibroblasten-Mischung an der Wand jeder Vertiefung einer sechswelligen Kulturschale entlang, wobei die Bildung von Blasen vermieden werden sollte, und inkubieren die Platte anschließend 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, damit das Gel gerinnen kann.

Wenn das Gel fest ist, drei Milliliter E-Medium mit EGF auf das erhärtete Kollagengel geben und die Platte in den Inkubator zurückstellen. Nachdem die Keratinozyten niedriger Passage etwa 70 % Konfluenz erreicht haben, werden die Keratinozyten mit Trypsin abgelöst und anschließend das Trypsin mit EED neutralisiert. In Anwesenheit von EGF die Zellen zählen, um die Anzahl der herstellbaren Rafts zu bestimmen.

Nachdem die Zellen abzentrifugiert wurden, resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter eed mit EGF pro berechnete Raft-Kultur. Entfernen Sie nun das Medium von den Kollagengelen, indem Sie die 6-Loch-Platte zur Seite kippen, und geben Sie anschließend zwei Milliliter frisches eed mit EGF zu jedem Gel hinzu. Fügen Sie danach vorsichtig ein Milliliter der resuspendierten Keratinozyten zu den zwei Millilitern eed hinzu, die bereits in jedem der Löcher vorhanden sind.

Pipettieren Sie die Keratinozyten zusammen mit den zwei Millilitern Medium vorsichtig und lassen Sie die Lösung tropfenweise auf den Kollagenpfropfen fallen. Stellen Sie die Platte zwei bis vier Tage lang in den 37 °C-Inkubator, damit die Zellen bis zur Konfluenz wachsen können. Die Zellen sind bereit, wenn das Medium einen Tag nach dem Mediumwechsel gelb wird, oder spätestens am vierten Tag. Verwenden Sie sterile Pinzette, um ein steriles metallenes Rastergitter mit den gebogenen Seiten nach unten in eine 10 cm-Dish zu legen.

Aspirieren Sie das Medium von einem Kollagengel und bewegen Sie dann einen sterilen Spatel im Auf-und-ab-Hebewechsel vorsichtig entlang des Randes des Gels, um das Gel von den Seiten der Vertiefung zu lösen. Das Übertragen des Kollagenpfropfens von der 6-Loch-Platte auf das Gitter ist der schwierigste Teil dieses Verfahrens. Achten Sie darauf, den Spatel vorsichtig unter den Pfropfen zu schieben, ohne ihn zu zerteilen, und legen Sie ihn flach auf das Gitter, ohne Luftblasen zwischen Pfropfen und Gitter entstehen zu lassen.

Anschließend können Sie mit einem Spatel Bereiche glätten, die während dieses Vorgangs nach unten gefaltet wurden. Um das Gel zu entfernen, kippen Sie die Platte leicht und schieben den Spatel unter das Gel, um es anzuheben. Legen Sie das Kollagengel blasenfrei auf das Metallgitter.

Um eine Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche herzustellen, fügen Sie EED ohne EGF langsam an den Boden der Petrischale hinzu, sodass das Raft-Gitter das Medium berührt, das Kollagen-Gel jedoch nicht. Inkubieren Sie die Rafts abschließend bei 37 Grad Celsius. Bewahren Sie die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche auf und gewinnen Sie die Rafts nach 14 Tagen. Wie in dieser Abbildung zu sehen ist, sind Rafts, die aus mit HPV 31 immortalisierten primären humanen Keratinozyten oder H fk, 30 ones hergestellt wurden, deutlich dicker als Rafts, die aus normalen humanen Haut-Keratinozyten oder hks stammen.

Daher besitzen HPV-Proteine die Fähigkeit, differenzierende Zellen im Zellzyklus aktiv zu halten. Hier wurde eine immunhistochemische Analyse an Querschnitten von organotypischen Raft-Kulturen durchgeführt, die aus HK 30 sowie normalen HKS generiert wurden, unter Verwendung eines Antikörpers gegen Cytokeratin 10 oder K 10 in grün. K 10 wurde in der basalen Schicht, die hier durch die Pfeile markiert ist, nicht exprimiert, sondern fand sich ausschließlich in den suprabasalen Schichten, die aus fortschreitend differenzierenden Zellen bestehen.

In dieser Abbildung ist die Expression des HPV-Proteins E eins, E vier, eines späten Proteins, das auf die obersten Schichten des Epithels beschränkt ist und hier grün dargestellt wird, wie erwartet zu sehen. In Schwimmkulturen von normalen hks wird, wie in der vorherigen Abbildung, keine Färbung beobachtet.

Die Pfeile zeigen erneut die basale Schicht des Epithels nach seiner Entwicklung an. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Krebsbiologie den Weg, die Pathogenese von humanen Papillomviren mithilfe eines Systems zu untersuchen, das der epithelialen Differenzierung in vivo nachempfunden ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man organotypische Raft-Kulturen aus primären Keratinozyten oder etablierten epithelialen Zelllinien herstellt.