Erstellen Transient Zelle Membranporen Mit einem Standard-Inkjet-Drucker

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, mittels Tintenstrahldruck transiente Poren in Zellmembranen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Standard-Tintenstrahldrucker modifiziert wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Standardtintenpatrone für den Drucker zu leeren und zu reinigen, um das Einsetzen der Bio-Tinte zu ermöglichen.

Als nächstes werden die interessierenden Zellen in einer Lösung aus fluoreszenzmarkierten Aktonmonomeren und PBS suspendiert, um die Biotintenlösung herzustellen. Der letzte Schritt besteht darin, die Bio-Tinte mit dem modifizierten Drucker und der Patrone auf Objektträger zu drucken. Letztendlich kann die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um zu zeigen, dass die Fluor-Vier-konjugierten G-Aktin-Monomere von den gedruckten Zellen durch transiente Membranporen internalisiert wurden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Transfektions- und Zellmikroinjektionstechniken besteht darin, dass diese Drucktechnik einfach anzuwenden ist und eine hohe Zellviabilität ermöglicht. Obwohl diese Technik Einblicke in die Genetik geben kann, kann sie auch auf andere Studienbereiche wie die Zellbiophysik und das Tissue Engineering in der Zellbiophysik angewendet werden. Mit dieser Technik kann das Zytoskelett einer Zelle während der Zellmigration leicht beobachtet werden.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir in der Lage sein wollten, Veränderungen in der Anordnung des Zytoskeletts durch auf Zellen ausgeübte Kräfte sichtbar zu machen. Entriegeln Sie zunächst die Kunststoffklammern von der unteren Unterseite des Druckers und heben Sie dann langsam das obere Kunststoffgehäuse ab. Nehmen Sie dann die Anzeigeblende der Taste von der Oberseite des Druckers ab und lassen Sie sie mit der Hauptplatine des Druckers verbunden.

Mit Kim-Tüchern und Ethanol. Reinigen Sie das Innere des Druckers, insbesondere die Bereiche, in denen die Tintenpatrone aufliegt und in denen gedruckt wird. Suchen Sie als Nächstes das Kabel, das die Papiereinzugsmechanismen des HP Jet 500 mit Strom versorgt.

Sie befinden sich direkt unter dem Papierfach links von der Vorderseite und ziehen Sie die Kabel von der Hauptplatine ab. Suchen Sie nun den Papiererkennungsmechanismus und befestigen Sie eine Drahtschlaufe an dem grauen Kunststoffhebel, der sich über und hinter dem Druckpapiereinzugsmechanismus befindet, um als Handgriff zu dienen, und platzieren Sie hier eine Bühne. Der Schaumstoff-Versandhalter für 15 Zentrifugenröhrchen wird mit mehreren Objektträgern verwendet, die im Druckbereich vor dem Papiereinzugsmechanismus befestigt sind, um die gewünschten Objektträger auf eine Ebene direkt unter dem Patronendruckkopf zu bringen.

Um die aseptische Technik aufrechtzuerhalten, platzieren Sie den Drucker in einer Laminar-Flow-Haube. Nehmen Sie zunächst die Patrone aus der Verpackung und lassen Sie das Schutzband auf den Druckerkontakten und dem Druckkopf belassen. Stabilisieren Sie den Körper der Patrone mit einer Klemme und lassen Sie die grüne Oberseite mit einem tragbaren rotierenden Schneidwerkzeug frei von Hindernissen.

Schneiden Sie die grüne Oberseite von der Patrone ab, leeren Sie die verbleibende Tinte aus dem Behälter und entfernen Sie dann das Plastikschutzband, das die Druckerkontakte und den Druckkopf abdeckt. Das Wasser tritt während dieses Vorgangs wahrscheinlich aus dem Druckkopf aus, aber es wird der Patrone keinen Schaden zufügen. Wenn das Wasser klar ist, lassen Sie die Kartusche trocknen.

Um eine saubere Druckumgebung zu gewährleisten, tauchen Sie die Patrone zunächst vollständig in ein Becherglas mit entionisiertem Wasser und beschallen Sie die Patrone dann 15 Minuten lang. Entfernen Sie nach der Beschallung die Kartusche und schütteln Sie das überschüssige Wasser aus. Sprühen Sie 70 % Ethanol in die Kartusche, um eine aseptischere Umgebung zu schaffen.

Nach der Ernte der interessierenden Zellen zentrifugieren Sie die Zellen in fünf Millilitern frischem Medium in einem konischen 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen fünf Minuten lang bei 250-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur. Als nächstes aspirieren Sie das Medium und resuspendieren dann die Zellen einmal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in frisch zubereiteter fluoreszierender G-Aktin-Stammlösung. Um Bio-Tinte herzustellen, beachten Sie, dass 250 Mikroliter Bio-Tinte drei Deckgläser mit dem hier gezeigten Linienmuster drucken. Nachdem der Drucker eingeschaltet und aufgewärmt ist, platzieren Sie hier die gewünschte Druckfläche, 22 Millimeter x 22 Millimeter große Deckgläser werden in der Mitte des zuvor montierten Tisches verwendet.

Öffnen Sie als Nächstes eine Zeichensoftware und wählen Sie das gewünschte Muster aus. Pipettieren Sie nun etwa 100 bis 120 Mikroliter der Zellsuspension in die kleine kreisförmige Vertiefung am Boden des Kartuschenfachs. Drucken Sie die Datei, während sich der Drucker wieder aufwärmt, die Patrone bewegt sich in die Bereitschaftsposition.

Wenn sich die Patrone leicht nach links bewegt, tropft die Tinte gut ab und bleibt dort. Ziehen Sie den Papiereinzugsmechanismus nach oben, der Draht und der Druck beginnen. Der Drucker druckt auf das Deckblatt, das sich in der Mitte des Drucktisches befindet, mit einem HP Desk Jet 500 Drucker mit einer Bio-Tinte, die aus einer Fibroblastenzellsuspension in einer G-Aktin-Monomer-Lösung besteht.

Im Inneren einer HP 26 Serie wurden Tintenpatronenzellen auf Glasabdeckfolien für Mikroskope gedruckt. Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Ergebnis von gedruckten Fibroblastenzellen, die eingebaute fluoreszierende Aktinmonomere aufweisen. Dieses Muster wurde in der vorherigen Abbildung verwendet, um eine durchgehende Linie der Drucklösung über den größten Teil des Objektträgers zu erzeugen.

In dieser Abbildung ist die Gerade dargestellt, in der sich der Biolink und die Zellen gegenseitig abgelagert haben. Beachten Sie, dass unmittelbar nach dem Drucken eine Zunahme der Hintergrundfluoreszenz auftritt, da die Biolink-Lösung, in der die Zellen suspendiert sind, freie überschüssige fluoreszierende Aktinmonomere enthält, die die Zellen etwa 10 Minuten nach dem Drucken inkubieren, was die Adhäsion am Objektträger erleichtert, so dass überschüssige Monomerlösung mit frischen Wachstumsmedien vom Substrat gewaschen werden kann, wodurch die Hintergrundfluoreszenz erheblich reduziert wird. Hier zeigt ein repräsentatives Bild von drei T-3-Fibroblasten, die in einer lokalisierten Druckzone gedruckt wurden, wie diese Fluoreszenzmikroskopie-Mikroaufnahme einer Zelle, die 15 Minuten nach dem Druck aufgenommen wurde, Giin in Grün, den Zellkern in Blau und die Überlagerung sowohl des GI-Aktins als auch des Kernfarbstoffs.

Die nächsten beiden Bilder zeigen die Fluoreszenzmikroskopie von zwei Fibroblasten in einem Linienmuster drei Stunden nach dem Druck. Dieses erste Bild zeigt fluoreszenzmarkierte Aktinmonomere im Inneren von Zellen. Dieses zweite Bild ist eine Überlagerung des Fluoreszenzkanals mit dem Hintergrundbild, um zu zeigen, dass sich auf dem Objektträger in der unteren linken Ecke zwar etwas Schmutz befinden kann, dieser aber nicht fluoresziert.

Schließlich wird hier eine Kontrollgruppe von nicht-gedruckten Zellen vorgestellt, die drei Stunden lang mit fluoreszenzmarkierten Monomeren inkubiert wurden, um zu zeigen, dass Monomere die Zellmembran nicht ohne Membranpermeation durch Zelldruck durchdringen können. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, mehrere Patronen zu reinigen und einsatzbereit zu haben, da das Verstopfen des Druckers eines der Probleme ist, die diese Technik verlangsamen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Standard-Desktop-Drucker umrüsten, um lebende Zellen zu drucken, was zur Erzeugung einer transienten Membrankraft beiträgt.