Name: Erstellen Transient Zelle Membranporen Mit einem Standard-Inkjet-Drucker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie einen Standard-Inkjet-Drucker in einen Bioprinter umwandeln, um transienten Poren in Zellmembranen zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht die Inkorporation von fluoreszierendem G-Actin in lebende Zellen mit hoher Zellviabilität.

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Die Autoren bedanken sich bei Dr. Thomas Boland für die Idee, die HP DeskJet-Drucker für die Zell-Druck bestätigen. Finanzierung für dieses Projekt von NSF RII-EPS-0903795 und NIH-K25 HL0922280.

1. Die Umwandlung des HP DeskJet 500 Es sei darauf hingewiesen, dass diese Technik sollte mit vielen kommerziell Tintenstrahldrucker arbeiten. Allerdings neigen ältere Drucker besser zu funktionieren, wie sie Tintenpatronen mit größerem Durchmesser Düsen, die nicht verstopfen nicht so leicht zu benutzen. Darüber hinaus neigen ältere Drucker mechanische Papierzuführung Sensoren, die leichter zu umgehen können verwendet werden. Drucker mit optischen Sensoren kann ausgetrickst werden, aber mit einem kleinen Streifen Papier auf dem äußersten Rand des Druckers bei jedem Zyklus, ist aber ein bisschen schwieriger als das mechanische System zu &quot;Trick&quot;. Die derzeit im Handel erhältlichen Drucker, die die beste Arbeit haben niedrige Auflösung (DPI). Höhere Auflösung Drucker tendenziell leichter verstopfen. Die Auflösung des HP Deskjet 500 von 300 dpi. Es gibt viele im Handel erhältlichen Drucker (HP Deskjet Serie und andere), die eine Auflösung von 600 DPI haben. Diese Art von Drucker kann mit nur einem geringen Anstieg der Düse verwendet werdenFragen, die Verstopfung lindern mit sorgfältiger Reinigung werden (Abschnitt 3) können. <ol><li> Entfernen Sie die obere Plastikgehäuse des Druckers durch das Entriegeln mehrerer Kunststoff-Clips von der unteren Boden des Druckers und langsam Heben Sie die Spitze. </li><li> Abschrauben Taste / Anzeige Leuchtplatte von der Oberseite des Druckers, so dass es an den Drucker der Hauptplatine verbunden. </li><li> Reinigen Sie das Innere des Druckers, vor allem die Bereiche, in denen die Tintenpatrone ruht und wo Druck auftritt. </li><li> Suchen Sie die Kabel Stromversorgung der Papiertransportmechanismen und ziehen Sie sie aus dem Motherboard. <ol><li> In der HP DeskJet 500, werden diese direkt unter der Papierkassette auf die linke Seite der Vorderseite. </li></ol></li><li> Suchen Sie Papier Erkennungsmechanismus. Umgehen Sie den Mechanismus, durch Anbringen einer Schnur oder Drahtschlinge als Handzuggriff dienen. <ol><li> In der HP DeskJet 500 ist das Papier Mechanismus zur Erkennung einer grauen Kunststoff-Hebel oberhalb und hinter dem Druck / Papier Zuführmechanismus gefunden. </li></ol></li><li> Erstellen Sie eine Bühne vor den Papiereinzug (wo das Papier aus würde gefüttert werden und abgelagert), um die gewünschten Druck-Folien auf ein Niveau knapp unterhalb der Patronen-Druckkopf bringen. <ol><li> Für unsere Experimente wurde der Schaum Versandkosten Halter für 15 ml Zentrifugenröhrchen mit mehreren Objektträger in in dem Druckbereich mit Klebeband an die letzte Stufe der Folien auf die gewünschte Höhe zu bringen verwendet. </li></ol></li><li> Um aseptische Technik zu halten, kann der Drucker in einem Standard-biohazard Schrank oder auf dem Tisch Sterilbank platziert werden. </li><li> Es ist wichtig zu beachten, dass die Modifizierung eines handelsüblichen Tintenstrahl-Drucker wird in der Regel Schäden sind von der Herstellergarantie. </li></ol> 2. Konvertieren Stock HP Tintenpatronen (Schwarz HP 26 Tintenpatronen) <ol><li> Nehmen Sie die Patrone aus der Verpackung, so dass die schützende Schutzstreifen von den Kontakten und Drucker Druckkopf für den Augenblick. </li><li> Stabilisieren den Körperder Kartusche (schwarz Portion) entweder mit einer Klammer oder Schraubstock (einfach fest Greifen Sie die Patrone mit der Hand gearbeitet als auch in der Regel), so dass die grüne Spitze frei von jedem Hindernis. </li><li> Mit einer Zange oder einem verstellbaren Schraubenschlüssel, fassen Sie die grüne Oberseite der Patrone und drehen hin und her, einige Male, bis er bricht frei. <ol><li> Dies sollte nicht viel Kraft, aber die Spitze wird nicht mehr benötigt, so ist es okay, wenn es beim Entfernen sie bricht. </li></ol></li><li> Mit Schraubendreher, abhebeln durchsichtigen Kunststoff Stück jetzt ausgesetzt. <ol><li> Auch dies dürfte sich nicht viel Kraft, aber es wird nicht nötig sein, so ist es okay, wenn es während der Entfernung bricht. </li></ol></li><li> Restlicher aus dem Reservoir. </li><li> Entfernen Sie die Kunststoff-Schutz-Schutzstreifen von den Drucker-Kontakte und Druckkopf. </li><li> Gründlich spülen die Reservoirs mit Wasser. <ol><li> Verwenden Sie eine Pipette oder Spritze, um Wasser durch die Kanäle schieben. </li><li> Wasser wird wahrscheinlich aus dem Druckkopf lecken währendDieses Verfahren, das akzeptabel ist, und nicht nachteilig auf die Funktionalität der Patrone. </li></ol></li><li> Bei klarem Wasser läuft, lassen Sie die Patrone, um zu trocknen. </li></ol> 3. Reinigung Tintenpatrone <ol><li> Um eine saubere Druckumgebung zu halten, ist die Tintenpatrone vor und nach Gebrauch gereinigt werden. <ol><li> Dies hilft auch mit der Vermeidung Kristallisation von Salzen und anderen biologischen Materials in der Kartusche, die Verstopfungen führen kann. </li></ol></li><li> Voll tauchen die Patrone in ein Becherglas voll von de-ionisiertem Wasser, und beschallen für 15 Minuten vor und nach dem Druck. </li><li> Nach der Beschallung, entfernen Sie die Patrone aus dem Wasser, und schütteln Sie überschüssiges Wasser ab. </li><li> Spray 70% Ethanol in die Patrone, um eine keimfreie Umgebung zu schaffen. <ol><li> Sicherstellen, dass das Ethanol wurde vor Aufnahme des bioink Drucklösung getrocknet. </li></ol></li></ol> 4. Machen Zellsuspension - &quot;BioTinte &quot; <ol><li> Kultur-Zellen erst unmittelbar vor der Passage. <ol><li> Für 3T3-Fibroblasten: Samen Zellen auf T-75-Kolben bei etwa 1.3x10 4 Zellen / cm 2 in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS). Kultur Zellen für zwei Tage in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol></li><li> Machen fluoreszierenden G-Aktin-Stammlösung mit einer Konzentration 50 ug / ml in Phosphatpuffer (PBS). </li><li> Passage-Zellen. <ol><li> Für 3T3 Fibroblasten: Entfernen Sie das Medium aus Kolben und zweimal mit PBS spülen. Decken-Zellen mit 5 ml 0,25% Trypsin + EDTA und Inkubation für 5 Minuten. </li><li> 5 ml frisches Medium pipettieren und die Zellsuspension in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 1000 rpm für 5 min. Saugen Sie verbrauchte Medium. </li></ol></li><li> Die Zellen in PBS mit fluoreszierenden G-Actin-Stammlösung zu bioink erstellen. <ol><li> Bioink sollte eine Endkonzentration von G-Aktin von 10 pg / ml und einer Zelle concentration von 1x10 5 Zellen / ml. Diese Konzentration wurde optimiert, um Anzahl von Zellen pro Tropfen und Verstopfen des Druckkopfes zu begrenzen. 8 </li><li> Beachten Sie, dass 250 ul bioink drei Deckgläser mit dem Muster in Abbildung 2 dargestellt druckt. </li></ol></li></ol> 5. Bioprinting <ol><li> Power on und damit der Drucker sich aufzuwärmen. </li><li> Die gewünschte Druckoberfläche (hier verwenden wir 22 mm x 22 mm-Deckgläschen) auf der Mitte der Bühne im Schritt 1.6 hergestellt. </li><li> Erstellen Sie ein Druckmuster-Datei. <ol><li> Öffnen Sie Microsoft Word (oder ein anderes Zeichen-Programm), und ziehen Sie das gewünschte Muster. </li><li> Wählen Sie einen gewünschten Druckmuster für die Zell-Druck in der vorgefertigten Datei. </li></ol></li><li> Legen Sie das vorbereitete Kartusche mit gewünschten Zellsuspension. <ol><li> Pipette Suspension in die kleine kreisförmige auch an der Unterseite der Kartuschenkammer. Verwenden Sie etwa 100-120 ul Lösung. Die gedruckte Tropfengröße ist etwa 130Picoliter. 8 </li></ol></li><li> Drucken Sie die Datei mit dem HP Deskjet 500 Drucker. <ol><li> Für beste Ergebnisse ausdrucken kleinere Muster mehrfach (5), durch Änderung der Anzahl von Kopien im Textverarbeitungsprogramm gewünscht. </li></ol></li><li> Drucker wird wieder aufwärmen, dann Kartusche wird auf die &quot;ready position&quot; zu bewegen. </li><li> Als Patrone in die Ausgangsposition (leicht nach links von der Tinte tropft deutlich unter und bleibt dort) bewegt, ziehen Sie den Papiereinzug Draht und Drucken beginnen sollte. <ol><li> Für mehrere Kopien des Druckens wird die Papiervorschubmechanismusabschnitt müssen nach jedem Zyklus oder gedruckt erscheinen. Die Kassette wird dann an den &quot;ready&quot;-Position zurück, und der Papiereinzug Draht sollte wieder angehoben werden. </li></ol></li><li> Der Drucker wird auf das Deckglas auf die Mitte der Druckphase in Schritt 5.2 gesetzt (siehe Abbildung 2) zu drucken. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse &lt;/ P&gt; Die repräsentativen Ergebnisse der gesamten Umwandlungsprozess von einem Standard, off-the-shelf HP Deskjet 500, werden Standard-Patronen HP 26 Serie einen Drucker mit der Möglichkeit des Druckens Zelle Lösungen für viele Arten der Analyse, wie oben angegeben. Die fertige Drucker nach der Umwandlung wird in 3 gezeigt, mit einem Druck bis das Mikroskop Deckglas auf platzieren. Der Drucker kann in der Analyse nützlich in vielen Bereichen, einschließlich aber nicht beschränkt auf: einzelne Zelle Mechanik, Tissue Engineering, Gentransfektion, Biosensor Mikrostrukturierung und direkte Zelltherapien 1-10, 16-22. In diesem Beispiel wurden ein HP Deskjet 500 Drucker und HP 26 Serie Tintenpatronen für Bioprinting geändert. Mit Hilfe dieser Einrichtung des Druckers mit einem bioink bestehend aus einem Fibroblasten-Zell-Suspension in einem G-Aktin Monomer-Lösung wurden die Zellen auf Glas-Mikroskop-Deckgläsern gedruckt. Abbildung 1 zeigt repräsentative res<html> ultate von gedruckten Fibroblasten-Zellen, die eingearbeitet fluoreszierende Aktin Monomere zeigen. Die Ergebnisse wurden in einer kontrollierten aseptischen Umgebung, in der die Zellen in gestaltbare Mustern bedruckt wurden erhalten. Das Muster in diesem Beispiel verwendet wurde in Microsoft Word (2) erstellt. Dieses Muster erzeugt eine durchgehende Linie von der Druck-Lösung über die Mehrheit der Objektträger. Abbildung 4 zeigt die gerade Linie, in der die Zellen gegenseitig bioink und abgelagert werden. Es sei darauf hingewiesen, dass unmittelbar nach dem Drucken, gibt es eine Zunahme der Hintergrund-Fluoreszenz, da die bioink Lösung, in der die Zellen suspendiert sind, enthält freie überschüssigen fluoreszierenden Actinmonomeren werden. Diese Hintergrundfluoreszenz signifikant abnimmt nach der Zugabe von Wachstumsmedium auf die Zellen (Abbildung 1), die überschüssige Monomer wäscht aus dem Substrat. <html> ad/3681/3681fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Repräsentative Bilder 3T3 Fibroblasten 3 Stunden nach dem Druck mit dem modifizierten Tintenstrahldrucker. Das Innere der Zellen zeigen eingearbeitet fluoreszierend markierten Aktin-Monomeren. Maßstabsbalken repräsentieren 50 um. <img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig2.jpg" /> Abbildung 2. Verwendet werden, um bioink Printdesign. <img alt="Abbildung 3." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig3.jpg" /> Abbildung 3. Drucker nach der Konvertierung mit Styrofoam Bühne. Das orange Kabel in der Mitte umgeht den Papiervorschub Hebel-Sensor. <img alt="Abbildung 4." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig4.jpg" /> 4. Repräsentatives Bild-3T3-Fibroblasten in einem lokalisierten Druckzone gedruckt. Mikroskopie aufgenommene Bild 5 Minuten nach dem Druck bei 20-facher Vergrößerung. / Files/ftp_upload/3681/3681fig5.jpg &quot;/&gt; Abbildung 5. Fluoreszenzbild (40fache Vergrößerung) 3 Stunden nach dem Druck, die einen Fibroblasten mit verinnerlichten fluoreszierende Actinmonomeren genommen. Maßstabsbalken repräsentiert 50 um. <img alt="Abbildung 6." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig6.jpg" /> 6. Fluoreszenzmikroskopie (20-facher Vergrößerung) einer Zelle 15 Minuten nach dem Druck gemacht. Das Bild zeigt sowohl g-Aktin (grün) und den Kern (blau). Von links nach rechts: G-Aktin mit Alexa Fluor 488, Kern mit DAPI, und einem Overlay aus beidem. <img alt="Abbildung 7." src="/files/ftp_upload/3681/3681fig7.jpg" /> 7. Fluoreszenzmikroskopie zeigt zwei Fibroblasten in einem Linienmuster 3 Stunden nach dem Drucken. Bild links zeigt fluoreszenzmarkierten Actinmonomeren innerhalb der Zellen. Bild rechts ist eine Überlagerung der Fluoreszenz-Kanal mit dem Hintergrundbild zu zeigen, dass obwohles können einige Rückstände auf der Folie (unten links) sein, ist das nicht fluoresziert. Maßstabsbalken repräsentieren 50 um, wenn Größe nicht angegeben Ganz rechts ist eine Kontrollgruppe von nicht bedruckten Zellen für 3 Stunden mit fluoreszierend markierten Monomeren inkubiert. Diese Kontrolle soll zeigen, dass Monomere konnte nicht die Zellmembran zu durchdringen, ohne Membranpermeabilisierung Zelle durch Druck.

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Der Prozess um einen handelsüblichen Tintenstrahl-Desktop-Drucker für Bioprinting konvertieren ist nicht besonders schwierig. Die größte Herausforderung Schritt ist die Bestimmung, wie man den Papiereinzug, die abhängig von der Marke und Modell des Druckers verwendet wird, ist zu umgehen. Dies ist jedoch relativ einfach, wenn die Papierzuführung Sensor mechanische wie hier beschrieben. Bei Modellen mit optischen Sensoren Feeds können auch andere Techniken müssen eingesetzt werden, um den Drucker zu denken, es wird die Verwendung von Papier Trick sein, zum Beispiel, kann man ein kleines Stück Papier durch den Drucker laufen, während es auf dem Objektträger druckt. Umgehen der Papiereinzug ist wahrscheinlich der schwierigste Schritt bei der Anwendung dieser Verfahren auf verschiedene Druckermodelle zu sein. Wenn er eine Bühne, um die Deckgläser zum Drucken zu halten, ist es wichtig, die richtige Ausrichtung und Höhe festzulegen. Die Phase sollte das Deckglas in der Mitte des Druckbereichs gebracht werden können. Darüber hinaus sollte es plACE das Deckglas in ausreichender Höhe, damit Freiraum für die Druckpatrone zu übergehen die Folie ohne Unterbrechung es. Die genaue Höhe der Bühne wird vom Druckermodell ab. Um sicherzustellen, dass Zellen nicht gedruckten weggewaschen zu werden, wurden die Objektträger in einem Inkubator sofort nach dem Druck für etwa 30 Minuten, um die Zellanheftung zu ermöglichen, bevor zusätzliche Wachstumsmedium zugegeben angeordnet. Da die Zellen wurden in einer Lösung, die große Mengen PBS werden die Zellen nicht austrocknen und lebensfähig geblieben sind gedruckt. Die Zellen wurden unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie abgebildet, um die Verteilung der markierten Aktinmonomere innerhalb der Zelle (Fig. 1, 5-7) zu visualisieren. Beim Drucken mit 3T3-Fibroblasten, zeigt 5 ein repräsentatives Ergebnis, wobei die Aktin was viel der Zelle zu fluoreszieren, aber präsentiert Linien erhöhter Helligkeit. Der Einbau von fluoreszenzmarkierten G-Aktin in das Zytoskelett istnützlich für das Studium der Zytoskelett-Dynamik und zelluläre Mechanik. 12-15 Ein Problem bei dieser Vorgehensweise ist, dass es nur für Moleküle und Proteine, die einen Durchmesser kleiner als etwa 10 nm ist. Um sicherzustellen, dass die Zellen tatsächlich wurden durch die umgewandelte Drucker verarbeitet wurde DAPI (1:5000 in PBS) an die bioink anstelle von Hälfte des Volumens an reinem PBS gegeben. Die Fluoreszenzfarbstoff DAPI bindet an Amino Säure-reichen Abschnitten der DNA im Kern lokalisiert. Deshalb DAPI ist ein nützliches Fleck in fluoreszierend bildgebenden Kerne der gedruckten Zellen. Abbildung 6 zeigt ein repräsentatives Bild einer Zelle angezeigt werden sowohl Alexa Fluor 488 (Aktin) und DAPI (Nukleus) mit einem Fluoreszenz-Overlay-Bild von beiden. Abbildung 7 zeigt auch, wie die Zellen werden einmal fluoreszieren die Aktinmonomere aufgenommen wurden, während nicht-biologische Material, das in der Probe abgeschieden wurde nicht aufgrund der Fluoreszenz absence von G-Aktin-Monomeren. Eine wichtige Überlegung für Bioprinting ist das wässerige Medium wird für die bioink verwendet. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von Standard-Zellwachstum Medien mit Serum ergaben widersprüchliche Ergebnisse. Dies ist höchstwahrscheinlich aufgrund einer Verstopfung der Düsen-Druckkopf durch Serumproteine. Die Verwendung von PBS erhöht die Konsistenz der gedruckten Muster, und die Anzahl der Zellen abgeschieden. Ein Nachteil bei der Benutzung PBS ist, dass Zellen nicht in die Suspension für längere Zeit bleiben. Jedoch waren Fibroblasten in diesen Beispielen können die bioink Bedingungen für mindestens eine Stunde ohne Änderung der Lebensfähigkeit der Zellen zu tolerieren. Dies steht im Einklang mit mehreren vorherigen Befunden, wonach Zellen über Thermo-Inkjet-Mechanismen gedruckt wurde gezeigt, dass hohe Überlebensraten haben berichten. 8.2 Dieser modifizierte Drucker-Setup kann für andere Anwendungen als Zell-Druck verwendet werden. 16-22 Matrixproteine, wie Kollagen oder fibronectin, kann problemlos auf Substraten mit dieser Technik, die nützlich sein können für Zell-Musters gedruckt werden. Zum Beispiel, Kollagen Typ I in Linienmuster wird in Kollagen ausgerichtet Substrate, die für In-vitro-Untersuchungen an Zellkulturen. 17 verwendet werden Zusätzlich zu Matrixproteine, anderen Molekülen, einschließlich Wachstumsfaktoren führen kann gedruckt werden, können zuverlässig auf Substrate werden für die Zell-Studien lokalisiert und Potenzial für therapeutische Anwendungen. 18 Eine wesentliche Einschränkung des Designs in den oben beschriebenen Schritte ist, dass der Drucker nicht drucken kann in mehr als einer Dimension. Dies begrenzt das Potential für die Verwendung in Anwendungen wie strukturiert Gerüst Druck. Um 3D-Druck zu ermöglichen, muss eine spezielle Stufe verwendet werden. Die Bühne muss inkrementelle Höhenverstellungen für Schicht-für-Schicht-Abscheidung von bioink haben. Bioprinting hat Versprechen als effizientes und kostengünstiges Verfahren für das Tissue Engineering gezeigt, Gentransfektion, Mikrostrukturierung und Microarray-Fertigung 1-12, 16-22 Die zukünftige Anwendungen dieser Art von Gerät es zahlreiche, unter anderem:. Schaffung gesteuert und strukturiert zelluläre Mikroumgebung, die Aufnahme von Makromolekülen in Zytoplasma, und die Ablagerung von Zellen auf Gerüsten und Strukturen, die natürlicherweise nicht vorkommen oder effizient.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> HP DeskJet 500 </td><td> Hewlett-Packard </td><td> C2106A </td><td> Nicht mehr vom Hersteller. Gekaufte refurbished Dezember Trader. </td></tr><tr><td> HP 26 Black Ink Cartridge </td><td> Hewlett-Packard </td><td> 51626A </td><td></td></tr><tr><td> Aktin aus Kaninchen-Muskel, Alexa Fluor 488 konjugiert, 200 ug </td><td> Invitrogen </td><td> A12373 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td><td> MP Biomedicals </td><td> ICN1860454 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3002201 </td><td></td></tr><tr><td> Fötalem Rinderserum </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> F4135 </td><td></td></tr><tr><td> Amphotericin B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Einsatz bei 0,5% in Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Einsatz bei 0,5% in Zellkulturmedien </td></tr><tr><td> Unidirektionalen Fluss Reinluftarbeitsplatz </td><td> Envirco </td><td> VLF-797 </td><td> Optional Gehäuse für die Aufbewahrung Drucker aseptische </td></tr></tbody></table>

erstellen transient zelle membranporen mit einem standard-inkjet-drucker

Creating Transient Cell Membrane Pores Using a Standard Inkjet Printer

Bioprinting verfügt über eine breite Palette von Anwendungen und die Bedeutung, einschließlich Tissue Engineering, direkte Zell-Therapien Anwendung, und Biosensor-Mikrofabrikation. 10.1 Vor kurzem hat Thermo-Inkjet-Druck auch für die Gen-Transfektion verwendet worden. 8,9 Der Thermo-Inkjet-Druckverfahren wurde gezeigt, zeitweilig den Zellmembranen ohne Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen. Die transiente Poren in der Membran verwendet werden, um Moleküle, die ansonsten zu groß, um durch die Membran hindurchgehen, würde in das Cytoplasma der Zelle. 8,9,11 einzuführen Die Anwendung, die hier gezeigt ist die Verwendung von thermischen Tintenstrahldruck für den Einbau von fluoreszenzmarkierten Aktinmonomere in Zellen. Der Vorteil der Verwendung thermischen Tintenstrahldruck, um Moleküle in Zellen zu injizieren ist, dass die Technik relativ gutartigen für Zellen ist. 8, 12 Lebensfähigkeit der Zellen nach dem Drucken wurde gezeigt, dass ähnlich wie Standard-Zelle PLAting-Methoden 1,8. Darüber hinaus können Tintenstrahldrucksystem Tausende von Zellen in Minuten verarbeiten, der viel schneller, als wenn die Mikroinjektion. Die Poren, die durch Druck erstellt wurde gezeigt, dass innerhalb von zwei Stunden zu schließen. Es gibt jedoch eine Grenze für die Größe der Poren erzeugt (~ 10 nm) mit dieser Drucktechnik, die die Technik begrenzt, um die Injektion von Zellen mit kleiner Proteine ​​und / oder Partikel. 8,9,11 Ein Standard-Drucker HP DeskJet 500 wurde modifiziert, um für die Zell-Druck zu ermöglichen. 3, 5, 8 Die Abdeckung des Druckers wurde entfernt und der Papiereinzug war umgangen werden mit Hilfe eines mechanischen Hebels. Eine Bühne wurde geschaffen, um für die Platzierung von Objektträgern und Deckgläsern direkt unter dem Druckkopf zu ermöglichen. Tintenpatronen geöffnet wurden, wurde die Tinte entfernt und sie wurden vor ihrer Verwendung mit Zellen gereinigt. Die Druckmuster wurde erstellt unter Verwendung von Standard-Software Zeichnung, die dann kontrolliert den Drucker über einen einfachen Befehl print. 3T3-FibroBlasten wurden bis zur Konfluenz gezüchtet, mit Trypsin behandelt, und dann in Phosphat-gepufferter mit löslichen fluoreszenzmarkierten Aktinmonomere Kochsalzlösung. Die Zellsuspension wurde in die Tintenpatrone pipettiert und Zeilen-Zellen wurden auf Glas-Deckgläschen gedruckt. Die Live-Zellen wurden aufgenommen mit Fluoreszenzmikroskopie und Aktin wurde während der gesamten Zytoplasma gefunden. Der Einbau von fluoreszierenden Aktin in die Zelle ermöglicht zum Abbilden der Kurzzeit-Zytoskeletts und wurde für eine breite Palette von Anwendungen nützlich. 13-15

Eine Beschreibung der Methoden benutzt, um einen HP DeskJet 500 Drucker in einen bioprinter konvertieren. Der Drucker verarbeiten kann lebende Zellen, die transiente Poren in der Membran bewirkt. Diese Poren können verwendet werden, um kleine Moleküle, einschließlich fluoreszierender G-Actin, in die gedruckte Zellen einzubauen.

Erstellen Transient Zelle Membranporen Mit einem Standard-Inkjet-Drucker

Das Bioprinting weist ein breites Spektrum an Anwendungen und Bedeutungen auf, darunter das Tissue Engineering, Therapien zur direkten Zellapplikation und Biosensoren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, mithilfe von Tintenstrahldruck vorübergehende Poren in Zellmembranen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein handelsüblicher Tintenstrahldrucker modifiziert wird. Im zweiten Schritt wird eine herkömmliche Druckertintenpatrone entleert und gereinigt, um die Zugabe der Bio-Tinte zu ermöglichen.Anschließend werden die Zellen von Interesse in einer Lösung aus fluoreszenzmarkierten Aktin-Monomeren und PBS suspendiert, um die Bio-Tintenlösung herzustellen. Im letzten Schritt wird die Bio-Tinte mithilfe des modifizierten Druckers und der Kartusche auf Objektträger aufgedruckt. Letztendlich kann mittels Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass die mit Fluor vier konjugierten G-Aktin-Monomere durch vorübergehende Membranporen in die gedruckten Zellen aufgenommen wurden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Transfektions- und Zellmikroinjektionsmethoden liegt darin, dass diese Drucktechnik einfach anzuwenden ist und eine hohe Zellviabilität ergibt. Obwohl diese Technik Einblicke in die Genetik ermöglichen kann, ist sie auch auf andere Forschungsbereiche wie die Zellbiophysik und das Gewebeengineering in der Zellbiophysik anwendbar. Mithilfe dieser Technik lässt sich das Cytoskelett einer Zelle während der Zellmigration einfach beobachten.Die Idee zu dieser Methode entstand ursprünglich aus dem Wunsch heraus, Veränderungen in der Zytoskelettanordnung aufgrund von auf Zellen wirkenden Kräften sichtbar machen zu können. Entfernen Sie zunächst die Kunststoffklammern von der unteren Basis des Druckers und heben Sie dann langsam das obere Kunststoffgehäuse ab. Trennen Sie anschließend die Anzeigeleuchte des Buttons von der Oberseite des Druckers, wobei sie weiterhin mit dem Motherboard des Druckers verbunden bleibt.Unter Verwendung von Kim-Tüchern und Ethanol. Reinigen Sie das Innere des Druckers, insbesondere die Bereiche, in denen die Tintenpatrone ruht und wo der Druckvorgang stattfindet. Suchen Sie anschließend das Kabel, das die Papierzuführmechanik des HP DeskJet 500 mit Strom versorgt.Sie befinden sich direkt unter dem Papierfach auf der linken Seite der Vorderseite; ziehen Sie nun die Kabel von der Hauptplatine ab. Suchen Sie anschließend den Papiererkennungsmechanismus und befestigen Sie eine Drahtschlaufe an dem grauen Kunststoffhebel, der oberhalb und hinter dem Papierzuführmechanismus angebracht ist, um als manueller Griff zu dienen; platzieren Sie hier eine Plattform. Der Schaumstoff-Transporthalter für 15 Zentrifugenröhrchen wird zusammen mit mehreren Mikroskopobjektträgern verwendet, die mit Klebeband an der Druckposition im Bereich vor dem Papierzuführmechanismus befestigt sind, um die gewünschten Druckobjektträger auf eine Höhe direkt unterhalb des Druckkopfes der Kartusche zu bringen.Um schließlich die aseptische Technik beizubehalten, stellen Sie den Drucker in eine laminare Luftströmungskabine. Beginnen Sie damit, die Kartusche aus der Verpackung zu nehmen, wobei das Schutzband, das die Druckerkontakte und den Druckkopf bedeckt, belassen wird. Stabilisieren Sie den Kartuschenkörper mit einer Klammer, sodass die grüne Oberseite frei von Hindernissen bleibt, unter Verwendung eines handgeführten rotierenden Schneidwerkzeugs.Schneiden Sie die grüne Abdeckung der Kartusche ab, leeren Sie die restliche Tinte aus dem Reservoir und entfernen Sie anschließend das Schutzfolie aus Kunststoff, die die Druckerkontakte und den Druckkopf bedeckt. Dabei kann Wasser aus dem Druckkopf austreten, was der Kartusche jedoch keinen Schaden zufügt. Wenn das ablaufende Wasser klar ist, lassen Sie die Kartusche trocknen.Um eine saubere Druckumgebung zu gewährleisten, tauchen Sie die Kartusche zunächst vollständig in einen Becher mit entionisiertem Wasser ein und behandeln Sie sie 15 Minuten lang mit Ultraschall. Nach der Ultraschallbehandlung nehmen Sie die Kartusche heraus und schütteln das überschüssige Wasser ab. Sprühen Sie 70 % Ethanol in die Kartusche, um eine bessere aseptische Umgebung zu schaffen.Nach der Gewinnung der gewünschten Zellen zentrifugieren Sie die Zellen in fünf Milliliter frischem Medium in einem 15-Milliliter-Konischzentrifugenröhrchen fünf Minuten lang bei 250 × g bei Raumtemperatur. Danach aspirieren Sie das Medium und resuspendieren die Zellen in frisch zubereiteter fluoreszenter G-Aktin-Standardlösung bei einer Dichte von 1 × 10⁵ Zellen pro Milliliter. Um die Bio-Tinte herzustellen, beachten Sie, dass 250 Mikroliter Bio-Tinte drei Deckgläser mit dem hier gezeigten Linienmuster bedrucken. Nachdem der Drucker eingeschaltet und aufgewärmt wurde, platzieren Sie die gewünschte Druckoberfläche hier; 22 Millimeter × 22 Millimeter große Deckgläser werden in die Mitte der zuvor montierten Halterung gelegt.Öffnen Sie als Nächstes ein Zeichenprogramm und wählen Sie das gewünschte Muster aus. Pipettieren Sie nun etwa 100 bis 120 Mikroliter der Zellsuspension in das kleine runde Bohrloch am Boden des Kartuschenfachs. Drucken Sie die Datei aus, während sich der Drucker erneut aufwärmt; dabei bewegt sich die Kartusche in die Bereitschaftsposition.Wenn sich die Kartusche leicht links von der Tintenaustrittsöffnung bewegt und dort verharrt, ziehen Sie am Papierzuführmechanismus nach oben, woraufhin der Draht und der Druckvorgang starten. Der Drucker druckt auf den Deckgläsern, die in der Mitte der Druckplattform platziert sind, unter Verwendung eines HP Deskjet 500 Druckers mit einer Bio-Tinte, die aus einer Fibroblastenzellsuspension in einer G-Aktin-Monomerlösung besteht.In einer HP 26-Serie wurden Tintenpatronenzellen auf Glasobjektträgern aufgebracht. Diese Abbildung zeigt ein repräsentatives Ergebnis aufgebrachter Fibroblastenzellen, die fluoreszierende Aktin-Monomere eingebaut haben. Dieses Muster wurde in der vorherigen Abbildung verwendet, um eine durchgehende Linie der Auftragslösung über den größten Teil des Objektträgers zu erzeugen.In dieser Abbildung ist die gerade Linie dargestellt, entlang derer Biolink und Zellen gemeinsam abgeschieden wurden. Beachten Sie, dass unmittelbar nach dem Drucken die Hintergrundfluoreszenz ansteigt, da die Biolink-Lösung, in der die Zellen suspendiert sind, freie überschüssige fluoreszierende Aktin-Monomere enthält. Eine Inkubation der Zellen für etwa 10 Minuten nach dem Drucken fördert die Adhäsion an dem Objektträger und ermöglicht es, die überschüssige Monomerlösung durch frisches Wachstumsmedium vom Substrat zu waschen, wodurch die Hintergrundfluoreszenz deutlich verringert wird. Hier ist ein repräsentatives Bild von drei T3-Fibroblasten, die in einer lokalisierten Druckzone gedruckt wurden. Wie dieses fluoreszenzmikroskopische Aufnahmefoto einer Zelle 15 Minuten nach dem Drucken zeigt, erscheint F-Aktin grün, der Zellkern blau und die Überlagerung beider, des G-I-Aktins und des Kernfarbstoffs.Die nächsten beiden Bilder zeigen die Fluoreszenzmikroskopie von zwei Fibroblasten in einem Linienmuster drei Stunden nach dem Druck. Dieses erste Bild zeigt fluoreszenzmarkierte Aktin-Monomere innerhalb der Zellen. Dieses zweite Bild ist eine Überlagerung des Fluoreszenzkanals mit dem Hintergrundbild und zeigt, dass, obwohl etwas Trümmermaterial auf der Objektträgerfläche in der unteren linken Ecke vorhanden sein mag, dieses nicht fluoresziert.Als Kontrollgruppe werden hier nicht gedruckte Zellen gezeigt, die drei Stunden mit fluoreszenzmarkierten Monomeren inkubiert wurden, um zu demonstrieren, dass Monomere ohne Membranpermeabilisierung durch das Zell-Druckverfahren nicht in die Zelle eindringen können. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, mehrere gereinigte Kartuschen bereitzuhalten, da Verstopfungen der Druckdüsen eines der Probleme sind, die diese Technik verlangsamen. Nach Anschauen dieses Videos sollten Sie gut verstehen, wie ein handelsüblicher Tintenstrahldrucker für den Druck lebender Zellen umgerüstet werden kann, was zur Erzeugung transiente Membrankräfte beiträgt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Diese 3D-Mikrofluidik-Drucktechnologie druckt Arrays von Zellen auf untergetauchte Oberflächen.  Wir beschreiben, wie Arrays von Zellen mikrofluidisch in 3D-Durchflusszellen auf untergetauchte Oberflächen gebracht werden.  Durch das Bedrucken von submersen Oberflächen wurden Zell-Microarrays hergestellt, die ein Wirkstoffscreening und die Beurteilung der Zytotoxizität in einer Vielzahl von Bereichen ermöglichen.

Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

Die in diesem Beitrag beschriebenen Methoden zeigen, wie ein Handels Tintenstrahldrucker in eine Bioprinter mit gleichzeitiger UV-Polymerisation zu konvertieren. Der Drucker ist in der Lage, 3D-Konstruktion von Gewebestruktur mit Zellen und Biomaterialien. Die Studie zeigte hier konstruierte eine 3D neocartilage.

Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Mikrofluidik-Strahl gegen eine Tröpfchen Schnittstelle Lipid-Doppelschicht bietet eine zuverlässige Möglichkeit, die Kontrolle über Vesikel mit Membran-Asymmetrie, die Aufnahme von Transmembranproteinen und Kapselung von Material zu erzeugen. Diese Technik kann angewandt werden, um eine Vielzahl von biologischen Systemen, in denen unterteilte Biomolekülen gewünscht studieren.

Lipiddoppelschicht Vesicle Erzeugung anhand Mikrofluidik Jetting

Ein kartesischer Biodrucker wurde entworfen und hergestellt, um die Abscheidung mehrerer Materialien in präzisen, reproduzierbaren Geometrien zu ermöglichen und gleichzeitig die Kontrolle von Umweltfaktoren zu ermöglichen. Unter Verwendung des dreidimensionalen Biodruckers können komplexe und lebensfähige Konstrukte gedruckt und leicht reproduziert werden.

Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Dieses Protokoll beschreibt eine Bioprinting-Methodik, die ein automatisiertes robotergestütztes Abscheidesystem verwendet, das geätzte topographische Leitfäden mit der präzisen Abscheidung einer Zelle mit Hydrogel-Biotinte verbindet. Die gedruckten Zellen werden direkt auf die geätzten Merkmale aufgebracht und sind in der Lage, diese zu erfassen und sich daran zu orientieren.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

Dieser Bericht beschreibt eine einfache, leicht durchzuführende Technik, die Niederdruckvakuum verwendet, um mikrofluidische Kanäle mit Zellen und Substraten für die biologische Forschung zu füllen.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Hier wird eine milde 3D-Drucktechnik vorgestellt, die durch abwechselnd viskos-inertiale Kräfte angetrieben wird, um den Bau von Hydrogel-Mikroträgern zu ermöglichen. Hausgemachte Düsen bieten Flexibilität und ermöglichen einen einfachen Austausch für verschiedene Materialien und Durchmesser. Zellbindende Mikroträger mit einem Durchmesser von 50-500 μm können erhalten und für die weitere Kultivierung gesammelt werden.

3D-Druck von In-vitro-Hydrogel-Mikroträgern durch abwechselnd viskos-inertiales Kraft-Jetting

Dieses Protokoll hebt eine Methode zur schnellen Bewertung der Biokompatibilität einer kristallinen Nanocellulose (CNC)/Agarose-Verbundhydrogel-Biomaterialtinte mit aus dem Knochenmark der Maus gewonnenen Mastzellen in Bezug auf die Zelllebensfähigkeit und die phänotypische Expression der Zelloberflächenrezeptoren Kit (CD117) und des hochaffinen IgE-Rezeptors (FcεRI) hervor.

Herstellung einer kristallinen Nanocellulose Embedded Agarose Biomaterial Tinte für Knochenmark-abgeleitete Mastzellkultur

Dieses Papier bietet eine Technik zur Herstellung von chipbasierten Superkondensatoren mit einem Tintenstrahldrucker. Die Methoden werden detailliert beschrieben, um Tinten zu synthetisieren, Softwareparameter anzupassen und die elektrochemischen Ergebnisse des hergestellten Superkondensators zu analysieren.

Aufwändige Steuerung von Tintenstrahldruckern zur Herstellung von chipbasierten Superkondensatoren

Erfahren Sie, wie Sie einen Standard-Inkjet-Drucker in einen Bioprinter umwandeln, um transienten Poren in Zellmembranen zu erzeugen. Diese Methode ermöglicht die Inkorporation von fluoreszierendem G-Actin in lebende Zellen mit hoher Zellviabilität.

Erstellen Transient Zelle Membranporen Mit einem Standard-Inkjet-Drucker

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