Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dopaminerge und striatale Exzisate zu kultivieren, um die Entwicklung der mesosalischen und striatonigralen Bahnen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Striatum und das dopaminerge Mittelhirn von E14,5-Maus-Embryonen mikrodisseziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, passend dimensionierte Exzisate aus dem präparierten Gewebe herauszuschneiden.

Anschließend werden die Explantate in einem Kollagengel in unmittelbarer Nähe zueinander positioniert. Im letzten Schritt werden diese Explantate über einen Zeitraum von zwei bis drei Tagen kultiviert, um das Auswachsen von Axonen zu ermöglichen. Abschließend kommt eine Immunhistochemie mit spezifischen neuronalen Markern zum Einsatz, um attraktive oder repulsive Axonreaktionen sichtbar zu machen und zu quantifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dissoziierten Kulturen oder zwei DX-Explantatkulturen besteht darin, dass die Kollagenmatrix ein dreidimensionales Substrat für die Exone bereitstellt, das die extrazelluläre Umgebung nachahmt. Außerdem ermöglicht die Kollagenmatrix die Bildung relativ stabiler Gradienten von Proteinen, die von X-Explantaten oder in der Nähe platzierten Zellen freigesetzt werden. Den Ablauf des Verfahrens werden Ava Smith und Francesca, zwei weitere Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstrieren.

Um dieses Verfahren zu beginnen, dissezieren Sie die E 14,5-Maus-Embryonen aus dem Uterus der Mutter. Bewahren Sie sie in L 15-Medium auf Eis auf, bis sie benötigt werden. Übertragen Sie anschließend einen Embryo unter das Mikroskop und isolieren Sie das Gehirn aus dem Embryo.

Entfernen Sie anschließend das Cephalon, indem Sie entlang des medialen Teils jeder zephalischen Vesikel schneiden. Danach entfernen Sie die meningeale Hülle. Führen Sie einen dorsoventralen Schnitt unmittelbar kaudal der mesozephalen Beugung durch.

Anschließend führen Sie einen weiteren dorsoventralen Schnitt direkt kaudal der mittleren zephalen Flexur durch. Danach führen Sie einen rastroskaudalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie mit einem Mikrodissektionsmesser durch, um das darunterliegende ventrale Mittelhirngewebe freizulegen. Achten Sie darauf, das ventrale Mittelhirngewebe nicht zu verletzen, da es die dopaminergen Neurone enthält.

Anschließend zwei Rost-Coddle-Schnitte lateral und parallel zur ventralen Mittellinie durchführen, um das dorsale Mittelhirngewebe zu entfernen. Danach das verbleibende ventrale Mittelhirngewebe mit einem Mikrodissektionsmesser am Ende des Lagerraums in X-Explanten teilen. Die X-Explanten in L-15-Medium mit 5 % FBS auf Eis lagern, bis sie verwendet werden.

Übertragen Sie nun die zuvor während der Mittelhirndissektion gewonnenen Talamus-zyphoiden Vesikel auf das Mikroskop. Entfernen Sie den Thalamus, indem Sie mit einer Pinzette zwischen Thalamus und Säule schneiden. Führen Sie anschließend einen mediolateralen Schnitt kaudal zum Striatum durch, um vordere Strukturen wie die Riechbülbe zu entfernen.

Als Nächstes wiederholen Sie diesen Schritt für das Gewebe, das lateral zum Striatum liegt. Danach positionieren Sie den verbleibenden Schnitt, um eine koronare Ansicht des Striatums zu erhalten. Das Striatum kann als ein leicht transparenterer Bereich des Gewebes erkannt werden.

Danach das Striatum isolieren und es mit einem Mikrodissektionsmesser in Implantate schneiden. Vermeiden Sie das leicht dunklere Gewebe nahe der Mittellinie, das wandernde Neurone des lateralen und medialen Ganglienleibes enthält. Geben Sie einen Tropfen vorbereitete Kollagenlösung auf ein Deckglas in der Vertiefung einer Viererkammer-Platte.

Belassen Sie es 30 Minuten lang im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Während dieser Inkubation wird das Kollagen gelatinieren. Nachdem das Kollagen gelatinisiert ist, überführen Sie die dopaminergen oder sal-Explantate mit einer Pipette und einer 200-Mikroliter-Spitze in das Kollagen.

Verschieben Sie die Explantate dann mit einer Nadel nahe zueinander. Halten Sie sie in einem Abstand von etwa dem Durchmesser eines Explantats auseinander. Entfernen Sie anschließend das überschüssige Medium.

Geben Sie 20 Mikroliter des hergestellten Kollagens auf das Explantat. Dadurch bewegen sich die Explantate häufig. Bringen Sie die Explantate mit einer Nadel erneut in die richtige Position.

Lassen Sie das Kollagen 15 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen. Danach überführen Sie es für 30 Minuten in den mit 5 % Kohlendioxid versorgten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nachdem das Kollagen erstarrt ist, geben Sie 400 Mikroliter Explantmedium hinzu und lassen es zwei bis drei Tage im Inkubator bei 37 Grad Celsius wachsen.

Um das Explan vorsichtig zu fixieren, 4 % Paraformaldehyd hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Nach einer Stunde die Proben dreimal für jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur mit PBS waschen.

Danach nach dem Entfernen des PBS für zwei Stunden in Blockierpuffer inkubieren. Anschließend über Nacht mit primärem Antikörper in Blockierpuffer bei vier Grad Celsius inkubieren. Am folgenden Tag fünfmal mit PBS bei Raumtemperatur waschen, jedes Mal eine Stunde lang. Danach mit sekundärem Antikörper, der mit der entsprechenden Fluorophor markiert ist, inkubieren.

Vier in Blockierpuffer über Nacht bei vier Grad Celsius. Ab diesem Schritt die Explantate mit Aluminiumfolie abdecken, um ihre Belichtung zu minimieren. Über Nacht in PBS bei vier Grad Celsius waschen, gefolgt von mehreren Waschschritten am nächsten Tag.

Als Nächstes montieren Sie die Explantate auf dem Objektträger mit einem langwirkenden Anti-Fade-Montagemedium, wobei die Explantatseite nach unten zeigt. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf das Montagemedium, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Erwerben Sie anschließend digitale Bilder der x Explantate mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop.

Unter Verwendung dieser Bilder wird jeder X-Explant in vier Quadranten unterteilt, um einen proximalen und einen distalen Quadranten zu erzeugen. Danach wird die Länge der 20 längsten Neuriten gemessen, die aus dem X-Explant in den proximalen und distalen Quadranten hervortreten. Mithilfe der durchschnittlichen Länge der 20 längsten Neuriten wird das proximal-distale Verhältnis für jeden einzelnen Explanten berechnet.

Ein proximaler distaler Quotient größer als eins weist auf eine Axonattraktion hin. Ein Quotient kleiner als eins weist auf eine Axonabstoßung hin. Gezeigt ist eine Mitthirnexplante, die mit einem Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase gefärbt wurde und das Axonwachstum zeigt.

Die gestrichelte Linie zeigt die angrenzenden Explantate an. Die Pfeile hier weisen auf einzelne Neuriten und Wachstumskonen hin. Hier sehen Sie ein Beispiel der Quantifizierung des proximalen zu distalen Verhältnisses.

Sie werden in gleiche Quadranten unterteilt. Der proximale Quadrant zeigt in Richtung des benachbarten X-Explantats, während der distale Quadrant davon wegzeigt. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dopaminerge und strato-Explantate koinkubieren kann, um die Entwicklung der misalen und nigro-striatalen Bahnen zu untersuchen, und um die molekularen Mechanismen zu erforschen, die an der Bildung dieser Bahnen beteiligt sind.