Name: Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Erfahren Sie die Kultur dopaminerger und striataler Explantate aus Maus-Embryonen in Kollagenmatrizen zur Untersuchung axonaler Wachstumsmechanismen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Axonführung in drei Dimensionen.

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Die Kollagen-Matrix-Assay wurde entwickelt und durch die Arbeit von vielen verschiedenen Forschergruppen in den letzten zwei bis drei Jahrzehnten verbessert. Die Ansätze hier für striatalen dopaminergen und Explantate beschriebenen stark aus diesen Studien profitieren. Darüber hinaus möchten die Autoren zu Asheeta Prasad für ihre Hilfe danken, bei der Einrichtung von striatalen Explantatkulturen. Arbeit im Labor wurde von der Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award) gefördert, die Niederländische Organisation für Gesundheitsforschung und Entwicklung (ZonMw-VIDI und ZonMw-TOP), das Europanian Union (MDDA-NeuroDev, FP7/2007-2011 , Grant 222999) (zu RJP) und der Niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (TopTalent; zu ERES).

1. Vorbereitung der Rattenschwanzkollagen <ol><li> Sammle 10.06 erwachsenen Rattenschwänzen (ist es möglich, die Schwänze bei -20 ° C bis zur Verwendung zu speichern). </li><li> Weichen Sie die Schwänze in 95% Ethanol über Nacht bei Raumtemperatur (RT). </li></ol> Dissektion der Rattenschwänzen (in Gewebekulturen Haube): (Halten Sie Ihre Werkzeuge in 70% Ethanol, wenn nicht mit ihnen und stellen Sie sicher, dass alle Lösungen, Tools und Glaswaren im Rahmen dieses Verfahrens benutzt steril sind) <ol start="3"><li> Um Sehnen aus den Schwänzen zu sammeln, schneiden Sie die Spitze des Schwanzes. Halten Sie große Ende des Schwanzes mit einer Pinzette. Verwenden Sie eine andere Zange in der Hand, biegen und brechen den Schwanz in der Nähe der anderen Pinzette. Auseinander ziehen und die Sehnen werden zurückgelassen (Abbildung 1A, B). </li><li> Sammeln Sie die Sehnen in sterilem H 2 O und nach Einholung aller Sehnen verschieben Sie sie auf eine neue Petrischale mit sterilem H 2 O </li><li> Nehmen Sie 2-3 Sehnen und zerkleinern diese mit 2 Paar fürSteinpilze in einem neuen Petrischale mit sterilem H 2 O Entfernen Sie nicht Sehnengewebe wie Venen (Sehnengewebe ist glänzend und reflektierend; 1C). Nach dem Entfernen aller nicht-Sehnengewebe ergibt jede Schwanz etwa 100-150 mg von Sehnen. </li><li> Übertragen Sie die Sehnen zu 300 ml steriler 3% Essigsäure und rühren, langsam über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Fügen Sie eine weitere 200 ml sterile 3% Essigsäure und rühren, langsam über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Zentrifugieren der Essigsäurelösung, enthaltend die Sehnen bei ~ 2700 × g für 120 min bei 4 ° C bis Pellet nicht gelösten Sehnen und nicht Sehnengewebe. </li><li> Während der Zentrifugation vorbereiten Dialyseschlauch: <ul><li> schneiden Stücke von 40 cm </li><li> kochen in 500 uM EDTA für 5 min </li><li> cool in sterilem H 2 O </li></ul></li><li> Verknoten an einem Ende der Dialyseschläuche und füllen den Schlauch mit dem Überstand des zentrifugierten Sehne Lösung auf Eis in der Gewebekulturabzug unter Verwendung eines automatischen abpipettierene und eine 25 ml Pipette. Vermeiden Sie Blasen entstehen. Knoten das andere Ende des Schlauchs und zu speichern Schlauch auf sterile Aluminiumfolie auf Eis, bis alle Schlauchstücke gefüllt (1D). </li><li> Planen 10 l sterile 0,1 × MEM, pH 4,0, in der Gewebekultur Haube. Fügen Sie Floater in Stücke von Schläuchen und fügen Sie diese dem vorgekühlten 0,1 × MEM-Lösung in einem 10-l-Becherglas. Dialysieren über Nacht bei 4 ° C unter langsamem Rühren. Diese Dialyse entfernt überschüssige Säure unter Beibehaltung der pH-Wert niedrig. </li><li> Durch neue vorgekühlten 10 l 0,1 X MEM und rühren über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Wiederholen Sie diesen Schritt durch den Austausch mit neuen vorgekühlten 10 l 0,1 X MEM und rühren, über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Aliquotieren Kollagenlösung in sterile 50 ml Röhrchen. Shop-Aliquots bei 4 ° C Halten Sie 6-12 Monate, nur dann transportieren die Kollagen-Lager in der Gewebekultur Kapuze. </li><li> Es ist wichtig, zu testen, ob das gereinigte Kollagen verdünnt (in 0,1 × MEM) werden muss, um optimale Ergebnisse in dem Collagen zu erhalten matrix-Assay. Daher erzeugen eine Kollagen Verdünnungsreihe (unverdünnt Kollagen, 1:1, 1:2 und 1:5 verdünnt) und führen Kollagenmatrix-Assays, wie unten für die optimale Kollagen Verdünnung zu bestimmen beschrieben. </li></ol> 2. Dissektion des dopaminergen Mittelhirns 7,8 <ol><li> Sezieren E14.5 Maus-Embryonen aus der Gebärmutter der Mutter und halten in L15 Medium auf Eis, bis sie benötigt. </li></ol> Alle nachfolgenden Schritte werden in Dissektion L15 Medium auf Eis durchgeführt. <ol start="2"><li> Herauspräparieren das Gehirn. </li><li> Entfernen Sie das Telencephalon durch Schneiden entlang der medialen Teil jedes telencephalen Vesikel (verwenden Sie die telencephalen Vesikel für striatalen Explantate). </li><li> Entfernen Sie die meningealen Scheide. </li><li> Machen Sie einen dorsoventralen Schnitt nur rostral des mesencephalen Flexur. </li><li> Machen Sie einen anderen dorsoventralen Schnitt unmittelbar kaudal des mesencephalen Flexur. </li><li> Machen Sie einen rostrokaudalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie mit einem microdissection Messer, um die zugrunde liegenden ventralen Mittelhirn Gewebe freizulegen. Achten Sie darauf, den ventralen Mittelhirn Gewebe betroffen, da sie die dopaminergen Neuronen (Abbildung 2) enthält. </li><li> Machen Sie zwei seitliche Schnitte rostrokaudalen und parallel zur ventralen Mittellinie zu dorsalen Mittelhirn Gewebe zu entfernen. </li><li> Teilen Sie die verbleibenden ventralen Mittelhirn Gewebe in Explantate mit einem Messer Mikrodissektion. </li><li> Speichern der Explantate in L15-Medium mit 5% FBS auf Eis bis zur Verwendung. </li></ol> 3. Präparation des Striatum Alle Schritte werden in Dissektion L15 Medium auf Eis durchgeführt. <ol><li> Verwenden Sie telencephalen Vesikel während Mittelhirn Dissektion seziert. </li><li> Entfernen Sie den Thalamus, indem zwischen dem Thalamus und Striatum mit einer Pinzette. </li><li> Machen Sie ein mediolateral Schnitt rostral des Striatum zu rostralen Strukturen wie der Riechkolben zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt für Gewebe kaudal des Striatum gelegen. </li><li> Positiondie restlichen Scheiben, eine koronare Ansicht des Striatum zu erhalten (Abbildung 2). </li><li> Das Striatum kann als etwas weniger dicht (transparenter) Teil des Gewebes erkannt werden. Präparieren Sie das Striatum und Schnitt in Explantate mit einem Messer Mikrodissektion. Vermeiden Sie den etwas dunkleren Gewebe in der Nähe der Mittellinie, die Migration von Neuronen des lateralen und medialen Ganglion Eminenz enthält. </li><li> Speichern der Explantate in L15-Medium mit 5% FBS auf Eis bis zur Verwendung. </li></ol> 4. Montage Kollagen-Matrix-Assays Vorbereitung des Kollagens (alle Schritte auf Eis gekühlt verwenden Pipettenspitzen) <ol><li> Mischen Sie 860 ul verdünnte Kollagen mit 100 ul 10x MEM und 40 ul 1 M Natriumhydrogencarbonat (NaHCO 3) und halten Sie auf dem Eis. Wenn an dieser Stelle das Kollagen wärmt es wird sich verfestigen. </li><li> Einen Tropfen von 20 ul (ca. 5 mm Durchmesser) von vorbereiteten Kollagen zu einem Deckglas in eine Vertiefung einer 4-Well Nunc Gerichtund lassen Sie es in einem CO 2-Inkubator stehen bei 37 ° C und 5% CO 2 für 30 min (Umgebungstemperatur O 2-Konzentration ist ausreichend). Während der Inkubation wird das Kollagen gelatinieren. </li></ol> Setup-Co-Kultur in Kollagen-Gel <ol start="3"><li> Nachdem das Kollagen geliert ist, verwenden Sie eine Pipette mit 200 pl Spitze, eine dopaminerge oder striatalen Explantat an das Kollagen zu übertragen. </li><li> Bewegen der Explantate in enger Nähe zueinander unter Verwendung einer Nadel. Halte sie in einem Abstand von etwa dem Durchmesser einer Explantat (~ 200-300 um) (Abb. 2). </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Medium und fügen 20 ul vorbereiteten Kollagen auf der Oberseite der Explantate. Dadurch entsteht häufig die Explantate zu bewegen. Positionieren Sie die Explantate mit einer Nadel wie in 4.4 beschrieben. </li><li> Lassen Sie die Kollagen verfestigen für 15 min bei RT gefolgt von 30 min bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Nachdem das Kollagen gesetzt hat, fügen Sie 400 ul explant Medium wachsen und für 2-3 Tage in einem CO 2-Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. </li></ol> 5. Die Analyse durch Immunhistochemie und Quantifizierung Immunhistochemie <ol><li> Um Explantate zu beheben, fügen Sie sanft 400 ul von 8% Paraformaldehyd (PFA) in PBS auf 400 ul Medium (und damit Verdünnung des PFA bis 4%) und lassen Sie stehen für 1 Stunde bei RT. </li><li> Waschen 3x 15 min in PBS bei RT. </li><li> Inkubieren in Blocking-Puffer (BB; PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) für 2 Stunden. </li><li> Über Nacht inkubieren mit Primärantikörper in BB bei 4 ° C Für dopaminergen Axonen verwenden Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper (1:1000) 7, für striatalen Axone Anti-DARPP32 Antikörper (1:500) 9 und für die Visualisierung aller Axone Anti-βIII Tubulin (1:3000) 7. </li><li> Waschen 5x 1 Stunde in PBS bei RT. </li><li> Inkubation mit sekundären Antikörpers, der an den entsprechenden Fluorophors (1:500) in BB über Nacht bei 4° C Von diesem Schritt auf Minimierung der Exposition der Explantate auf Licht (zB bedecken Sie sie mit Alufolie). </li><li> Waschen in PBS über Nacht bei 4 ° C, gefolgt von mehreren Wäschen während des nächsten Tages. </li><li> Montieren Sie Explantate auf Objektträgern mit Prolong Antifade Reagenz Eindeckmedium. Einen Tropfen ~ 10 ul auf einem Objektträger. Nehmen Sie das Deckglas und legen Sie sie vorsichtig auf den Tropfen Eindeckmedium mit dem Explantat Seite nach unten. Vermeiden Sie Trapping keine Luft unter de Deckglas durch sehr schonend senken sie auf den Tropfen Eindeckmedium. </li></ol> Die Quantifizierung durch die Berechnung P / D-Verhältnis <ol start="9"><li> Erwerben Sie digitale Bilder der Explantate mit dem Epifluoreszenzmikroskop (Abbildung 3). </li><li> Unter Verwendung dieser Bilder, teilen jedes Explantat in Quadranten, um ein proximales Quadranten (dh ein Teil des Explantats am nächsten zu dem benachbarten Explantat) und ein distales Quadranten (Teil der Explantat von der benachbarten Erläuterungen zu erzeugen weitestennt) (2, 4). </li><li> Die Länge von 20 längsten Neuriten, die aus dem Explantat sowohl in den proximalen und distalen Quadranten. </li><li> Verwendung der durchschnittlichen Länge der 20 längsten Neuriten, die P / D-Verhältnis für jeden einzelnen Explantat berechnen. AP / D-Verhältnis&gt; 1 bedeutet, Axon Attraktion, während ein Verhältnis &lt;1 bedeutet, Axon Abstoßung. </li><li> In einigen Fällen verhindert die dichte Wachstum von Neuriten die Bewertung der einzelnen Neuritenlänge. In diesen Situationen kann die Quantifizierung durch Messen des Abstands zwischen dem Rand des Explantats und dem vorderen vor Axonwachstum in den proximalen und distalen Quadranten werden. </li></ol> 6. Repräsentative Bilder Nach der erfolgreichen Kultur der striatalen dopaminergen und Explantate eine große Anzahl von Axonen sind sichtbar mit Hellfeld-Mikroskopie oder wie visualisiert durch anti-Tubulin βIII Immunzytochemie (nicht dargestellt). Ein Teil dieser Axone dopaminergen oder s.<html> triatal Axone als visualisiert mittels Immunzytochemie (Abbildung 3). Durch die Aufteilung der Explantate in Quadranten wie beschrieben und die Bestimmung P / D-Verhältnissen, kann eine putative Axon anziehende oder abstoßende Wirkung quantifiziert (Abbildung 3E) werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" /> Abbildung 1. Fotos zur Darstellung der Herstellung von Kollagen aus Rattenschwanzsehnen. A) Auseinanderziehen der Rattenschwanz macht die Sehnen. B) Sehnen sind sichtbar als seil-Bundles. C) Die Sehnen sind problemlos von Venen durch ihre glänzend weißes Aussehen unterscheiden. D) Nach Auflösen der Spannglieder in Essigsäure, wird die Lösung in einen Dialyseschlauch übertragen. Um die gelösten Kollagen kalt zu halten, werden die Rohre auf sterile Aluminiumfolie auf Eis gestellt. e 2 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg &quot;/&gt; 2. Schema, das die verschiedenen Schritte des Verfahrens. Entsprechende Hirnregionen werden seziert und geschnitten, um Explantate zu generieren. Eine einzelne Mittelhirn und Striatum Explantat in unmittelbarer Nähe in einer Kollagenmatrix angeordnet und dann für 48-72 Stunden bei 37 ° C wachsen Axone werden visualisiert durch Fluoreszenz Immunhistochemie und ein P / D-Verhältnis wird berechnet, um chemotropische Antworten zu quantifizieren. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" /> 3. Repräsentative Ergebnisse zeigen Axonwachstum in einer Kollagenmatrix Kultur. A) Mittelhirn Explantat mit Anti-Tyrosin-Hydroxylase Antikörper enthüllt Axon Auswuchs gefärbt. Gepunktete Linie zeigt neben Explantat. B) Vergrößerung eines einzelnen Neuriten zeigen und das Wachstum Kegel (Pfeile). C) Striatale Explantat mit Anti-DARPP32 gefärbt. D) Vergrößerung der einzelnen Neuriten C zeigt. E) BeispielP / D-Verhältnis Quantifizierung. Explantate werden in gleiche Sektoren eingeteilt. Das proximale Quadrant wird mit Blick auf den angrenzenden Explantat während das distale Quadranten weg von ihm zugewandt ist. Scale-Balken zeigen 100 um.

<ol><li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+connected+in+the+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li>
<li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li>
<li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation%2C+channeling%2C+rostral+growth%2C+and+intracortical+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li>
<li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li>
<li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li>
<li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Kollagenmatrix hier beschriebenen Assay verwendet wurde und von vielen verschiedenen Labors in den letzten Jahrzehnten verbessert, um eine Vielzahl von Axonen Molekülen und neuronalen Systemen untersuchen (zB siehe Referenzen 5-8). Diese Studien haben gezeigt, dass dieser Test ein mächtiges Werkzeug zur Untersuchung der Wirkungen und Regulation der axonale Wegfindung Moleküle, die durch verschiedene (Zwischen-) Ziel-Geweben sezerniert wird. Es sollte jedoch angemerkt, dass die Kollagenma...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Fetalem Kälberserum </td><td> BioWhittaker </td><td> 14-801F </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin (200mm) </td><td> PAA </td><td> M11-004 </td><td></td></tr><tr><td> Hepes </td><td> VWR International </td><td> 441476L </td><td></td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Merck </td><td> 444203 </td><td></td></tr><tr><td> Minimum Essential Medium (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 61100-087 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium </td><td> Gibco </td><td&gt; 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15070-063 </td><td></td></tr><tr><td> Verlängern Sie Gold-Reagenz Antifade </td><td> Invitrogen </td><td> P36930 </td><td></td></tr><tr><td> Dialyseschlauch </td><td> Spectrum Labs </td><td> 132660 </td><td></td></tr><tr><td> Rabbit anti-Tyrosin-Hydroxylase </td><td> Pel-Freez </td><td> P40101-0 </td><td></td></tr><tr><td> Kaninchen anti-Darpp32 (H-62) </td><td> Santa-Cruz </td><td> Sc-11365 </td><td></td></tr><tr><td> Maus anti-Tubulin βIII </td><td> Sigma </td><td> T8660 </td><td></td></tr><tr><td> Alexa Fluor markierte sekundäre Antikörper </td><td> Invitrogen </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dissection und kultur von maus-dopaminergen und striatale explantate in dreidimensionalen kollagen-matrix-assays

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Mittelhirn Dopamin (MDDA) Neuronen Projekt über die mediale Vorderhirnbündel gegen mehrere Bereiche im Telencephalon, einschließlich des Striatum ein. Umgekehrt innervieren Medium stachelige Neuronen im Striatum, die Anlass zur striatonigralen (direkten) Weg geben, die Substantia nigra 2. Die Entwicklung dieser Axonen des ZNS ist abhängig von den Aktionen der kombinatorischen einer Fülle von Axon Wachstum und Führung Cues einschließlich Moleküle, die von Neuriten oder durch (Zwischen-) Ziel-Regionen 3,4 freigesetzt werden. Diese löslichen Faktoren können in vitro durch Kultivieren MDDA und / oder striatalen Explantate in einem Kollagenmatrix, die eine dreidimensionale Substrat für die Axone Nachahmen der extrazellulären Umgebung bietet untersucht werden. Darüber hinaus ermöglicht die Kollagenmatrix für die Bildung von relativ stabilen Gradienten von Proteinen durch andere Explantate oder Zellen in der Umgebung (z. B. siehe Referenzen 5 und 6) angeordnet ist freigegeben. Hier beschreiben wir Verfahren für die PURifizierung von Rattenschwanzkollagen, Mikrodissektion von dopaminergen und striatalen Explantate, ihre Kultur in Kollagen-Gelen und anschließender immunhistochemische und quantitative Analyse. Erstens sind die Gehirne von E14.5 Maus Embryonen isoliert und dopaminerge und striatalen Explantate mikrodissezierten. Diese Explantate werden dann (Co) in Kollagengelen auf Deckgläsern gezüchtet für 48 bis 72 Stunden in vitro. Anschließend sind axonale Projektionen visualisiert mit neuronalen Marker (zB Tyrosin-Hydroxylase, DARPP32 oder βIII Tubulin) und Axon-Wachstum und anziehend oder abstoßend Axon Antworten werden quantifiziert. Diese neuronale Zubereitung ist ein nützliches Werkzeug für die in vitro-Untersuchungen der zellulären und molekularen Mechanismen von mesostriatal und striatonigralen Axonwachstum und Beratung bei der Entwicklung. Mit diesem Test ist es auch möglich, andere (Zwischen-) Ziele für die striatalen dopaminergen und Axonen zu beurteilen oder zu spezifischen molekularen Signale zu testen.

Explantate aus dem Mittelhirn Dopamin und Striatum in einer Kollagenmatrix Assay für die Verwendung<em&gt; In-vitro-</em&gt; Analyse der mesostriatal und striatonigralen Weg der Entwicklung. In diesem Test axonalen Wachstums und Anleitung können manipuliert und quantifiziert werden. Es kann auch für die Beurteilung der anderen Regionen oder Signalstoffe geändert werden.

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

Midbrain-Dopamin-Neuronen (mdDA) projizieren über den medialen Vorderhirnbündel zu mehreren Arealen im Telencephalon, einschließlich des Striatums1. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dopaminerge und striatale Exzisate zu kultivieren, um die Entwicklung der mesosalischen und striatonigralen Bahnen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Striatum und das dopaminerge Mittelhirn von E14,5-Maus-Embryonen mikrodisseziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, passend dimensionierte Exzisate aus dem präparierten Gewebe herauszuschneiden.Anschließend werden die Explantate in einem Kollagengel in unmittelbarer Nähe zueinander positioniert. Im letzten Schritt werden diese Explantate über einen Zeitraum von zwei bis drei Tagen kultiviert, um das Auswachsen von Axonen zu ermöglichen. Abschließend kommt eine Immunhistochemie mit spezifischen neuronalen Markern zum Einsatz, um attraktive oder repulsive Axonreaktionen sichtbar zu machen und zu quantifizieren.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dissoziierten Kulturen oder zwei DX-Explantatkulturen besteht darin, dass die Kollagenmatrix ein dreidimensionales Substrat für die Exone bereitstellt, das die extrazelluläre Umgebung nachahmt. Außerdem ermöglicht die Kollagenmatrix die Bildung relativ stabiler Gradienten von Proteinen, die von X-Explantaten oder in der Nähe platzierten Zellen freigesetzt werden. Den Ablauf des Verfahrens werden Ava Smith und Francesca, zwei weitere Doktorandinnen aus meinem Labor, demonstrieren.Um dieses Verfahren zu beginnen, dissezieren Sie die E 14,5-Maus-Embryonen aus dem Uterus der Mutter. Bewahren Sie sie in L 15-Medium auf Eis auf, bis sie benötigt werden. Übertragen Sie anschließend einen Embryo unter das Mikroskop und isolieren Sie das Gehirn aus dem Embryo.Entfernen Sie anschließend das Cephalon, indem Sie entlang des medialen Teils jeder zephalischen Vesikel schneiden. Danach entfernen Sie die meningeale Hülle. Führen Sie einen dorsoventralen Schnitt unmittelbar kaudal der mesozephalen Beugung durch.Anschließend führen Sie einen weiteren dorsoventralen Schnitt direkt kaudal der mittleren zephalen Flexur durch. Danach führen Sie einen rastroskaudalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie mit einem Mikrodissektionsmesser durch, um das darunterliegende ventrale Mittelhirngewebe freizulegen. Achten Sie darauf, das ventrale Mittelhirngewebe nicht zu verletzen, da es die dopaminergen Neurone enthält.Anschließend zwei Rost-Coddle-Schnitte lateral und parallel zur ventralen Mittellinie durchführen, um das dorsale Mittelhirngewebe zu entfernen. Danach das verbleibende ventrale Mittelhirngewebe mit einem Mikrodissektionsmesser am Ende des Lagerraums in X-Explanten teilen. Die X-Explanten in L-15-Medium mit 5 % FBS auf Eis lagern, bis sie verwendet werden.Übertragen Sie nun die zuvor während der Mittelhirndissektion gewonnenen Talamus-zyphoiden Vesikel auf das Mikroskop. Entfernen Sie den Thalamus, indem Sie mit einer Pinzette zwischen Thalamus und Säule schneiden. Führen Sie anschließend einen mediolateralen Schnitt kaudal zum Striatum durch, um vordere Strukturen wie die Riechbülbe zu entfernen.Als Nächstes wiederholen Sie diesen Schritt für das Gewebe, das lateral zum Striatum liegt. Danach positionieren Sie den verbleibenden Schnitt, um eine koronare Ansicht des Striatums zu erhalten. Das Striatum kann als ein leicht transparenterer Bereich des Gewebes erkannt werden.Danach das Striatum isolieren und es mit einem Mikrodissektionsmesser in Implantate schneiden. Vermeiden Sie das leicht dunklere Gewebe nahe der Mittellinie, das wandernde Neurone des lateralen und medialen Ganglienleibes enthält. Geben Sie einen Tropfen vorbereitete Kollagenlösung auf ein Deckglas in der Vertiefung einer Viererkammer-Platte.Belassen Sie es 30 Minuten lang im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Während dieser Inkubation wird das Kollagen gelatinieren. Nachdem das Kollagen gelatinisiert ist, überführen Sie die dopaminergen oder sal-Explantate mit einer Pipette und einer 200-Mikroliter-Spitze in das Kollagen.Verschieben Sie die Explantate dann mit einer Nadel nahe zueinander. Halten Sie sie in einem Abstand von etwa dem Durchmesser eines Explantats auseinander. Entfernen Sie anschließend das überschüssige Medium.Geben Sie 20 Mikroliter des hergestellten Kollagens auf das Explantat. Dadurch bewegen sich die Explantate häufig. Bringen Sie die Explantate mit einer Nadel erneut in die richtige Position.Lassen Sie das Kollagen 15 Minuten bei Raumtemperatur gerinnen. Danach überführen Sie es für 30 Minuten in den mit 5 % Kohlendioxid versorgten Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nachdem das Kollagen erstarrt ist, geben Sie 400 Mikroliter Explantmedium hinzu und lassen es zwei bis drei Tage im Inkubator bei 37 Grad Celsius wachsen.Um das Explan vorsichtig zu fixieren, 4 % Paraformaldehyd hinzufügen und eine Stunde bei Raumtemperatur belassen. Nach einer Stunde die Proben dreimal für jeweils 15 Minuten bei Raumtemperatur mit PBS waschen.Danach nach dem Entfernen des PBS für zwei Stunden in Blockierpuffer inkubieren. Anschließend über Nacht mit primärem Antikörper in Blockierpuffer bei vier Grad Celsius inkubieren. Am folgenden Tag fünfmal mit PBS bei Raumtemperatur waschen, jedes Mal eine Stunde lang. Danach mit sekundärem Antikörper, der mit der entsprechenden Fluorophor markiert ist, inkubieren.Vier in Blockierpuffer über Nacht bei vier Grad Celsius. Ab diesem Schritt die Explantate mit Aluminiumfolie abdecken, um ihre Belichtung zu minimieren. Über Nacht in PBS bei vier Grad Celsius waschen, gefolgt von mehreren Waschschritten am nächsten Tag. Als Nächstes montieren Sie die Explantate auf dem Objektträger mit einem langwirkenden Anti-Fade-Montagemedium, wobei die Explantatseite nach unten zeigt. Legen Sie vorsichtig ein Deckglas auf das Montagemedium, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Erwerben Sie anschließend digitale Bilder der x Explantate mit einem Epi-Fluoreszenzmikroskop.Unter Verwendung dieser Bilder wird jeder X-Explant in vier Quadranten unterteilt, um einen proximalen und einen distalen Quadranten zu erzeugen. Danach wird die Länge der 20 längsten Neuriten gemessen, die aus dem X-Explant in den proximalen und distalen Quadranten hervortreten. Mithilfe der durchschnittlichen Länge der 20 längsten Neuriten wird das proximal-distale Verhältnis für jeden einzelnen Explanten berechnet.Ein proximaler distaler Quotient größer als eins weist auf eine Axonattraktion hin. Ein Quotient kleiner als eins weist auf eine Axonabstoßung hin. Gezeigt ist eine Mitthirnexplante, die mit einem Antikörper gegen Tyrosinhydroxylase gefärbt wurde und das Axonwachstum zeigt.Die gestrichelte Linie zeigt die angrenzenden Explantate an. Die Pfeile hier weisen auf einzelne Neuriten und Wachstumskonen hin. Hier sehen Sie ein Beispiel der Quantifizierung des proximalen zu distalen Verhältnisses. Sie werden in gleiche Quadranten unterteilt. Der proximale Quadrant zeigt in Richtung des benachbarten X-Explantats, während der distale Quadrant davon wegzeigt. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dopaminerge und strato-Explantate koinkubieren kann, um die Entwicklung der misalen und nigro-striatalen Bahnen zu untersuchen, und um die molekularen Mechanismen zu erforschen, die an der Bildung dieser Bahnen beteiligt sind.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieser Test bewertet die Fähigkeit eines Signalmolekül, hier Bone Morphogenetic Protein 7 (BMP7), um kommissuralen Axone neu zu orientieren. Eine Explantation von embryonalen Rückenmark kultiviert wird neben einem Aggregat von COS-Zellen sekretieren der Kandidat Wachstumsfaktoren. Umorientiert kommissuralen Axone wachsen innerhalb der Explantation werden visualisiert durch Immunhistochemie.

Testen der Fähigkeit des diffusiblen Signalmoleküle zu embryonalen Spinal kommissuralen Axone neu ausrichten

Wir zeigen, wie zu sezieren und Kultur chick E4 statoacoustic Ganglion und E6 Rückenmark Explantate. Explantate unter serumfreien Bedingungen in 3D-Kollagen-Gele für 24 Stunden kultiviert. Neuriten Reaktionsfähigkeit ist mit Wachstumsfaktor-ergänzt mittel-und mit Protein-beschichteten Beads getestet.

Dissection und Kultur von Chick Statoacoustic Ganglion und Rückenmark Explantate in Kollagengelen für Neuritenwachstum Assays

Dieses Video beschreibt eine Methode zur Kultivierung dopaminerger Neuronen aus embryonalem Hirngewebe von Mäusen. Der Prozess umfasst die Behandlung des Mittelhirns mit einem proteolytischen Enzym, die Ablösung der Zellen und die Kultivierung auf polymerbeschichteten Deckgläsern in einem nährstoffreichen Medium mit Antibiotika für ihr Wachstum und ihre langfristige Lebensfähigkeit.

Kultivierung und Erhaltung dopaminerger Neuronen aus embryonalem Hirngewebe der Maus

Das Video zeigt den Prozess der Isolierung und Kultivierung von Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn von Mausembryonen. Die isolierten ventralen Mittelhirnböden werden mit Hilfe von Enzymen dissoziiert. Die resultierenden Dopamin-Neuronen werden geerntet und in Mikroinseln in Multi-Well-Platten übertragen. Die Zellen werden mit einem Dopamin-Neuronenmedium inkubiert, um die Zellen in den Mikroinseln auf einer hohen Dichte zu halten.

Isolierung und Kultivierung von primären embryonalen Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn der Maus

Hier beschreiben wir eine detaillierte Protokoll für die gleichzeitige Erzeugung von neuralen Vorläuferzellkulturen, entweder als Mono-oder haftNeuroSphären, aus der Subventrikularzone und Gyrus dentatus der einzelnen erwachsenen Mäusen.

Eine Maus, zwei Kulturen: Isolierung und Kultur von adulten neuralen Stammzellen aus dem Zwei Neurogene Zonen der einzelnen Mäuse

Dopaminerge Neuronen spielen eine wichtige regulatorische Rolle im Gehirn. Ihr Verlust wird mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. In diesem Video zeigen wir, wie Primärkulturen von zentralen dopaminergen Neuronen aus embryonalem Mausmesencephalon erzeugt werden können. Solche Kulturen sind nützlich, um die extreme Anfälligkeit dieser Neuronen gegenüber verschiedenen Belastungen zu untersuchen.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Einblicke in die komplexen Aktionen des Gehirns erfordern fortschrittliche Forschungswerkzeuge. Hier demonstrieren wir ein neuartiges, auf Seidenkollagen basierendes 3D-Modell von neuronalem Gewebe, das einer gehirnähnlichen Architektur ähnelt. Das Modell kann verwendet werden, um die Assemblierung neuronaler Netzwerke, die axonale Führung, Zell-Zell-Interaktionen und die elektrische Aktivität zu untersuchen.

Engineered 3D Silk-Kollagen-basierten Modell von polarisiertem Neural Tissue

Bei der Parkinson-Krankheit (PD), Substantia Nigra (SNC) dopaminergen Neuronen degenerieren, was zu Motorstörungen. Hier berichten wir über ein Protokoll zur Kultivierung von ventralen Mittelhirns Neuronen aus einer Maus eGFP durch eine Tyrosinhydroxylase (TH) Promotorsequenz angetrieben exprimieren, Ernten einzelnen fluoreszierenden Neuronen aus den Kulturen, und die Messung ihrer Transkriptom RNA-seq verwenden.

Zuverlässige Identifikation von Wohn dopaminerge Neurone in Mittelhirns Kulturen unter Verwendung von RNA-Sequenzierung und TH-Promotor getriebene eGFP Expression

In diesem Bericht werden die Vorteile des organotypischen Kulturen und dissoziierten Primärkulturen von Maus-abgeleitete Dorsal Root Ganglien hervorgehoben, um eine Vielzahl von Mechanismen, die Neuron-Glia-Interaktion, Neuroplastizität zugeordnet zu nehmen, Neuroinflammation und Antwort auf virale Infektion.

Erwachsenen Maus DRG Explant und distanzierte Zellmodelle um Neuroplastizität und Antworten auf ökologische Beleidigungen einschließlich Virusinfektion zu untersuchen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur 3D-Kultur-Systeme selbst Montage Peptid Gerüste zur Förderung der Differenzierung der entdifferenzierten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten Knorpel-ähnliches Gewebe zu erhalten.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

Hier bieten wir eine Methode zur Analyse des Verhaltens wachsender Axone in 3D-Matrizen, die ihre natürliche Entwicklung imitieren.

Generation von 3-D-Kollagen-basierten Hydrogelen zur Analyse des axonalen Wachstums und Verhaltens während der Entwicklung des Nervensystems

Erfahren Sie die Kultur dopaminerger und striataler Explantate aus Maus-Embryonen in Kollagenmatrizen zur Untersuchung axonaler Wachstumsmechanismen. Diese Methode ermöglicht die quantitative Analyse von Axonführung in drei Dimensionen.

Dissection und Kultur von Maus-dopaminergen und Striatale Explantate in dreidimensionalen Kollagen-Matrix-Assays

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