Name: Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und In Vivo T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-29T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Induktion von Graft-versus-Host-Krankheit und die In-vivo-Überwachung von T-Zellen in einem MHC-kompatiblen Mausmodell. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Visualisierung immunologischer Mechanismen.

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Wir danken Alice Gaughan und Jiao-Jing Wang, dessen hervorragende technische Unterstützung, geistigen Input und moralische Unterstützung waren maßgeblich an der Bewegung dieser Studien vor. Diese Studien wurden von der NIH AI036532 zur GAH unterstützt.

Ein. Lethal Bestrahlung <ol><li> Platzieren bis 10 Empfängermäuse in einen Käfig Mikroisolator kompatibel mit dem Bestrahler verwendet werden. </li><li> Strahlen in 2 gleich große Dosen Summierung Gesamtdosis (Gesamtdosis = 9 cGy für BALB.B Empfänger). Zweiten Bestrahlung sollte 3 h nach der ersten. Die Injektion sollte zwischen 4-6 Stunden nach der letzten Bestrahlung auftreten. Bestrahlen Mäuse in beiden Cs 137 Quelle oder RS2, 000, Strahler. </li><li> Im Anschluss an die zweite Strahlungsdosis, speichern Mäuse in Mikroisolator Käfig mit angesäuertem Wasser bis zum Zeitpunkt der Transplantation. </li></ol> 2. Splenozyten Vorbereitung <ol><li> Einschläfern einem Spender Maus nach den Richtlinien des Instituts. Jeder Spender in der Regel ergibt 75x10 6 - 125x10 6 Splenozyten. Mit CD8 Aufreinigungskits, jede Maus in der Regel ergibt 6x10 6 - 12x10 6 CD8 T-Zellen. </li><li> Entfernen der Milz, indem man zuerst eine vertikale 2 cm lange Inzision 2 cm rechts von der Mittellinie direktunter dem Brustkorb. Schnitt durch das Fell, Haut und viszeralen Membran. </li><li> Entfernen der Milz und erstellen Einzelzellsuspension indem Milz in 40 ul Sieb in eine Petrischale mit 1640 RPMI mit 5% FBS. Verwenden Sie einen Spritzenkolben auseinander zu brechen, die Milz, bis die gesamte Milz durch Sieb verabschiedet worden. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden WT und L2G85.B6 Spender. Sammeln Sie alle WT einzelnen Zellsuspensionen in 1-50 ml konischen Röhrchen, und sammeln Sie alle L2G85.B6 einzelnen Zellsuspensionen in einem separaten 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 1.200 Upm für 10 min bei 4 ° C. Resuspendieren Pellets in 1640 RPMI mit 5% FBS und Graf Zellen. </li></ol> 3. Bone Marrow Vorbereitung <ol><li> Entfernen Sie die Haut von einem Hinterbein eines Spenders Maus. </li><li> Vorsichtig weggeschnitten so viel Muskelgewebe wie möglich von Femur und Tibia / Fibula. </li><li> Entfernen Hinterbein indem Femur derzeit Hüftgelenk. Schneiden Sie Hinterpfote knapp unter Tibia / Fibula Kreuzung. Alle Knochenschnitte sollte durch robuste Schere werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig restlichen Muskelgewebe. Abgeschnitten Wadenbein-relativ wenig Knochenmark in Fibula gefunden und die Mühe nicht wert. </li><li> Zeigen Hinterbein in kaltem 1640 RPMI 5% FBS und wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Hinterbein. 40x10 6 Knochenmarkszellen - Jede Maus sollte zwischen 20x10 6 ergeben. </li></ol> 4. Bone Marrow Removal <ol><li> Entfernen ein Hinterbein von Medien und in großen Petrischale mit einer kleinen Menge kaltem Medium (~ 1 ml). </li><li> Schneiden Sie das Kniegelenk. Verwendung einer Spritze (Volumen&gt; 5 ml), Insert subkutanen Nadel in Tibia und niederdrücken Spritze bis das gesamte Material von roten Inneren Tibia entfernt wird. Wiederholen Sie den Vorgang mit Femur. Verbleibende Knochen frei von Knochenmark. Wiederholen Sie den Vorgang mit dem zweiten Hinterbein. </li><li> Erstellen einzigen Zellsuspension durch Pipettieren Medien mit Knochenmark in großen Petrischale und Nutzung Spritzenkolben und 40 ulMaschensieb. Pipette einzigen Zellsuspension in 50 ml konischen Röhrchen und auf Eis. </li></ol> 5. CD3 Depletion Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, CD3 +-Zellen aus dem Knochenmark abzureichern. Unser Labor verwendet ein Set von Miltenyi Biotec (CD3-Biotin - 130-093-021) hergestellt. Abzureichern CD3 +-Zellen aus dem Knochenmark nach Herstellers bestimmt. Der Puffer für Miltenyi Kits wird fortan als MACS-Puffer (2 mM EDTA, 0,5% BSA in PBS, pH 7,2) werden. <ol><li> Waschen der Zellen durch Zentrifugation Splenozyten und Knochenmarkszellen bei 1200 UpM für 10 min bei 4 ° C und Zählung Zellen. </li><li> Entfernen Sie alle Überstand. Resuspendieren Knochenmarkzellen in 100 ul pro 10 Millionen Knochenmarkszellen in MACS-Puffer. </li><li> Fahren Sie mit CD3 Depletion mit fertigt &#39;Protokoll. </li><li> Waschen CD3 verarmte Knochenmarkzellen 3 mal in sterilem PBS. Graf CD3 abgereichert Knochenmarkzellen und resuspendieren in einem geeigneten Volumen auf 10 7 Zellen zu injizieren. </li></ol> Es gibt eine Vielzahl von Möglichkeiten, um CD8 + T-Zellen von Mäusen L2G85.B6 reinigen. Auch gibt es mehrere Möglichkeiten, um CD8 + T-Zellen aus Splenocyten WT Spendern führen. Unser Labor verwendet Kits von Miltenyi Biotec (CD8 Depletion - 130-049-401, CD8 Reinigung - 130-095-236). <ol><li> Resuspendieren des WT Pellet in 90 ul MACS Puffer pro 10 7 Zellen. Fahren Sie mit CD8 T-Zell-Depletion nach Hersteller &#39;Protokoll (CD8 Depletion - 130-049-401). </li><li> Resuspendieren L2G85.B6 Pellet in 40 ul MACS Puffer pro 10 7 Zellen. Fahren Sie mit CD8 T-Zell-Reinigung nach Hersteller &#39;Protokoll (CD8 Reinigung - 130-095-236). </li><li> Zählen Sie jeden Zellpopulation und waschen jeder Population 3 mal mit sterilem PBS. Resuspendieren jeder Population in ausreichender Menge, um 18x10 6 WT (CD8 abgereichertes) Splenozyten und 2x10 6 L2G85.B6 gereinigt CD8 T Zellen zu injizieren. </li></ol>7. Injection Vorbereitung <ol><li> Kombinieren Sie 10 7 CD3 erschöpft Knochenmarkszellen, 18x10 6 WT (CD8 abgereichertes) Splenozyten und 2x10 6 L2G85.B6 gereinigt CD8 T-Zellen in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen mit sterilem PBS und resuspendieren in 300 ul. </li><li> Inject Zellpräparation in die Schwanzvene von Empfängermäuse. Injektionen sollte mit 28 Gauge-Nadeln werden. </li><li> Shop Mäuse in Mikroisolator Käfig mit angesäuerten Wasser. Ergebnis Mäuse täglich mit Scoring GVHD Scoring-System von Cooke et al 1 entwickelt. </li></ol> 8. Bioluminescent Imaging <ol><li> Sechs Tage nach der Transplantation, injizieren Empfängermäuse mit 4 mg D-Luciferin. Lassen Sie 5 min zur Luciferin mit Luciferase reagieren. </li><li> Anesthetize Maus in Isofluran Kammer des Biolumineszenz-Imager und Bild Empfänger für 5 min mit kleinen Binning. Dadurch wird eine hohe Auflösung beim Sammeln so viele Veranstaltungen wie möglich. </li><li> Analysieren von Daten mit WohnzimmerImage-Software. Der Maßstab der Pseudo-Farbbildes verändert werden, um die besten Ergebnisse zu ergeben. Allerdings ist es unabdingbar, dass die gleiche Größenordnung in Experimenten verwendet werden. </li><li> Interessierenden Regionen können mit Lebend Image Software und Licht Emittanz kann durch Berechnen des Flusses (Photonen / sec) von jedem interessierenden Bereich emittiert quantifiziert werden kann. </li></ol> 9. Repräsentative Ergebnisse Etwa 7-10 Tage nach der Transplantation beginnen Mäusen klinischen Anzeichen von GVHD. Mäuse erscheinen scruffy wegen des Mangels an Pflege. Die Empfänger werden auch damit beginnen, Gewicht zwischen 7-10 Tage nach der Transplantation zu verlieren. Aktivität und Haltung Empfängermäuse bleibt relativ normal, bis ca. Tag 12-14 nach der Transplantation. Kumulierte GVHD Partituren wird stetig durch den ersten 2-3 Wochen nach der Transplantation (Abbildung 1A) erhöhen. Krankheitsverlauf ist sehr variabel zwischen Mäusen, aber Empfänger sollten gleichmäßig erliegen um 30-40 d GVHDays nach der Transplantation (Abbildung 1B). Abbildung 2 zeigt Empfängermäuse, die 6 Tage nach der Transplantation abgebildet wurden. Pseudo-farbigen Skala zeigt variierende Licht Emittanz während des Körpers mit der höchsten Lichtstärke in der Milz und dem Darm emittiert. CD8 T-Zell-Anreicherung im Darm ist konsistent mit früheren Feststellungen 6. Empfängermäuse kann wieder in Mikroisolator Käfig platziert werden, um zu einem späteren Zeitpunkt abgebildet werden euthanasiert oder zur ex vivo Bildgebung. <table border="1"><tbody><tr><td> Kriterien </td><td> Grade 0 </td><td> Grade 1 </td><td> Grade 2 </td></tr><tr><td> Gewichtsverlust (wkly.) </td><td> &lt;10% </td><td> &gt; 10% - &lt;25% </td><td> &gt; 25% </td></tr><tr><td> Haltung </td><td> Normal </td><td> Gebeugt nur in Ruhe </td><td> Mehrere gebeugt; beeinträchtigt movement </td></tr><tr><td> Aktivität </td><td> Normal </td><td> Leichte bis Abnahme der Aktivität moderieren </td><td> Stationäre es sei denn, stimuliert </td></tr><tr><td> Fur texture </td><td> Normal </td><td> Leichte bis mäßige zerzauste </td><td> Schwere Kräuseln / schlechte Pflege </td></tr><tr><td> Hautstruktur </td><td> Normal </td><td> Skalierung der Pfoten / tail </td><td> Offensichtliche Bereichen entblößt Haut </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Cooke et al entwickelte diese Scoring-System in 1996 1. Mäuse sollten täglich auf jedes der Kriterien auf der linken gewertet. Jede Maus wird eine Punktzahl von 0-2 für jedes Kriterium gegeben und die Gesamtpunktzahl ist die Summe aller einzelnen Noten. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig1.jpg" /> Abbildung 1. Letal bestrahlten BALB.B wurden mit 10 7 Knochen transplantiertKnochenmarkzellen allein oder mit 18x10 6 CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und 2x10 6 gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen. A) Clinical Score-Daten von Empfängern von Knochenmark allein oder mit CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen. B) Survival Daten von Empfängern von Knochenmark allein oder mit CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3697/3697fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig2.jpg" /> Abbildung 2. Letal bestrahlten BALB.B Mäuse wurden mit 10 7 Knochenmarkzellen allein oder mit 18x10 6 CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und 2x10 6 gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen transplantiert. Empfänger wurden mit 4 mg D-Luciferin über intraperitoneale Injektion injiziert und wurden unter Verwendung Xenogen IVIS 5 min bei kleinen Binning. PsEudo-farbigen Bilder werden gezeigt, wo Purpur stellt geringer Intensität und Rot steht für hohe Intensität Regionen von Interesse rund um die gesamte Maus und Gesamtfluss (Photonen / sec) gezogen wurden quantifiziert. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3697/3697fig3.jpg" /> Abbildung 3. Letal bestrahlten BALB.B Mäuse wurden mit 10 7 Knochenmarkzellen allein oder mit 18x10 6 CD8 T-Zell-Depletion WT Splenozyten und 2x10 6 gereinigt L2G85.B6 CD8 T-Zellen transplantiert. Empfänger wurden mit 4 mg D-Luciferin über intraperitoneale Injektion injiziert und wurden unter Verwendung Xenogen IVIS 5 min bei kleinen Binning. Pseudo-farbigen Bilder werden gezeigt, wo Purpur stellt geringer Intensität und Rot steht für hohe Intensität. Die Empfänger wurden auf A) Tag 4, B) Tag 6 und C) Tag 8 nach der Übertragung abgebildet.

<ol><li>Cooke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+model+of+idiopathic+pneumonia+syndrome+after+bone+marrow+transplantation%3A+The+roles+of+minor+H+antigens+and+endotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: The roles of minor H antigens and endotoxin.</a> Blood. 88, 3230-3239 (1996).</li>
<li>Berger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+subsets+involved+in+lethal+graft-versus-host+disease+directed+to+immunodominant+minor+histocompatibility+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">T cell subsets involved in lethal graft-versus-host disease directed to immunodominant minor histocompatibility antigens.</a> Transplantation. 57, 1095-1102 (1994).</li>
<li>Nimer, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+depletion+of+CD8%2B+cells+for+prevention+of+graft-versus-host+disease+after+bone+marrowtransplantation.+A+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Selective depletion of CD8+ cells for prevention of graft-versus-host disease after bone marrowtransplantation. A randomized controlled trial.</a> Transplantation. 57, 82-87 (1994).</li>
<li>Korngold, R., Sprent, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+markers+of+T+cells+causing+lethal+graft-vs-host+disease+to+class+I+vs+class+II+H-2+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Surface markers of T cells causing lethal graft-vs-host disease to class I vs class II H-2 differences.</a> Journal of Immunology. 135, 3004-3010 (1985).</li>
<li>Cao, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+using+labeled+donor+tissues+reveals+patterns+of+engraftment%2C+rejection%2C+and+survival+in+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging using labeled donor tissues reveals patterns of engraftment, rejection, and survival in transplantation.</a> Transplantation. 80, 134-139 (2005).</li>
<li>Asady, R. E. l <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%7Bbeta%7D-dependent+CD103+expression+by+CD8%28%2B%29+T+cells+promotes+selective+destruction+of+the+host+intestinal+epithelium+during+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">TGF-{beta}-dependent CD103 expression by CD8(+) T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versus-host disease.</a> J. Exp. Med. 201, 1647-1657 (2005).</li>
<li>Larson, R. S., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+leukocyte+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure and function of leukocyte integrins.</a> Immunol Rev. 114, 181-217 (1990).</li>
<li>Karecla, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+E-cadherin+on+epithelial+cells+by+the+mucosal+T+cell+integrin+alpha+M290+beta+7+%28alpha+E+beta+7%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recognition of E-cadherin on epithelial cells by the mucosal T cell integrin alpha M290 beta 7 (alpha E beta 7).</a> Eur. J. Immunol. 25, 852-856 (1995).</li>
<li>Cepek, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+between+epithelial+cells+and+T+lymphocytes+mediated+by+E-cadherin+and+the+alpha+E+beta+7+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin.</a> Nature. 372, 190-193 (1994).</li>
<li>Malarkannan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+functional+characterization+of+a+dominant+minor+H+antigen%2C+H60%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The molecular and functional characterization of a dominant minor H antigen, H60.</a> J. Immunol. 161, 3501-3509 (1998).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll zur Induktion bei Mäusen hier vorgestellten GVHD stellt eine klinisch relevante Modell der murinen GvHD. Zitat von Berger et al. Im Jahr 1994, ist die C57Bl / 6 in BALB.B Stammkombination MHC abgestimmt, mit GVHD Sterblichkeit durch CD4 abhängig, CD8 T-Effektoren 2, sehr ähnlich zu den häufigsten klinischen Szenario 3 vermittelt. Es ist bekannt, dass die Transplantation CD8 T-Zellen allein verursacht keine GVHD in diesem Modell, jedoch ist Krankheitsprogression deutlich schle...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 12633-012 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Calf Serum </td><td> Invitrogen </td><td> 10439016 </td><td></td></tr><tr><td> 40 uM Zellsieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> CD3e-Biotin </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-093-021 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-Biotin Microbeads </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-091-147 </td><td></td></tr><tr><td> CD8a Microbeads </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-049-401 </td><td> Verwendet werden, um CD8 T-Zellen aus der Milz führen. </td></tr><tr><td> CD8a Reinigung Antikörper Cocktail </td><td> Miltenyi Biotech </td><td> 130-095-236 </td><td> Gebrauchte zu reinigenCD8 T-Zellen aus der Milz. </td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> 122796 </td><td></td></tr></tbody></table>

induktion der graft-versus-host-krankheit und<em&gt; in vivo</em&gt; t-zell-Überwachung mit einem mhc-matched mausmodell

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Graft-versus-host disease (GVHD) der limitierende Barriere für den breiten Einsatz von Knochenmarktransplantation als kurative Therapie für eine Vielzahl von hämatologischen Mängel. GVHD wird durch reife alloreaktiven T-Zellen im Knochenmark Transplantat, das in den Empfänger infundiert werden verursacht und verursachen Schäden an Host Organe. Jedoch in Mäusen, muß T-Zellen des Knochenmarks Inoculum zugegeben werden, um GVHD bewirken. Obwohl umfangreiche Arbeit getan ist, um T-Zell-Reaktionen nach der Transplantation charakterisieren, ist biolumineszierenden Bildgebungstechnologie eine nicht-invasive Methode zur T-Zell-Trafficking Mustern in vivo zu überwachen. Nach tödlichen Bestrahlung werden Empfängermäuse mit Knochenmarkzellen und Splenozyten von Spender-Mäusen transplantiert. T-Zell-Teilmengen aus L2G85.B6 (transgene Mäuse konstitutiv exprimieren Luciferase) in dem Transplantat enthalten. Mit nur Transplantation bestimmte T-Zell-Untergruppen, ist man in der Lage, spezifische T-Zell-Untergruppen in vivo zu verfolgen,und basierend auf ihren Standort, entwickeln Hypothesen über die Rolle von spezifischen T-Zell-Untergruppen bei der Förderung GVHD zu verschiedenen Zeitpunkten. In vorgegebenen Intervallen nach der Transplantation sind Empfängermäuse abgebildet mit einem Xenogen IVIS CCD-Kamera. Lichtintensität kann quantifiziert unter Verwendung Lebend Image Software, um eine Pseudo-Farbbildes auf Photonenintensität (rot = hoher Intensität, violett = geringer Intensität) basierend zu generieren. Zwischen 4-7 Tage nach der Transplantation beginnen Empfängermäuse klinischen Anzeichen von GVHD zu zeigen. Cooke et al. 1 entwickelt ein Scoring-System bis zur Krankheitsprogression auf der Empfängermäuse Fell Textur, die Integrität der Haut, Aktivität, Gewichtsverlust, und die Haltung der Basis zu quantifizieren. Mäuse werden täglich bewertet und eingeschläfert, wenn sie moribund werden. Empfängermäuse Regel geworden moribund 20-30 Tage nach der Transplantation. Murine Modelle sind wertvolle Werkzeuge für das Studium der Immunologie der GVHD. Selektiv Transplantation insbesondere T-Zell-Untergruppen alTiefs für sorgfältige Identifikation der Rollen jede Teilmenge spielt. Nicht-invasiv Tracking T-Zell-Antworten in vivo fügt eine weitere Schicht von Wert murine GVHD Modelle.

Murine Knochenmark-Transplantation ist eine weit verbreitete Technik, um immunologische Mechanismen für Graft-versus-Host-Krankheit beim Menschen zu studieren. Die Fähigkeit zur T-Zell-Trafficking-Muster zu überwachen<em&gt; In vivo</em&gt; Ermöglicht eine detaillierte Analyse der Entwicklung und Aufrechterhaltung der T-Zell-Reaktionen während der Graft-versus-Host-Krankheit.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und<em&gt; In Vivo</em&gt; T-Zell-Überwachung mit einem MHC-matched Mausmodell

Die Graft-versus-Host-Krankheit (GvHD) stellt die einschränkende Barriere für den breiten Einsatz von Knochenmarktransplantationen als kurative Therapie für eine Vielzahl hämatologischer ...

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wanderung und Ansammlung von T-Zellen während einer Graft-versus-Host-Erkrankung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Knochenmark und Zellen von Spendermäusen isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Populationen der gewünschten Zellen zu reinigen und sie für die Transplantation vorzubereiten.Anschließend werden die gereinigten Zellpopulationen kombiniert und in bestrahlte Empfängermäuse transplantiert. Im letzten Schritt werden die Verlagerungs- und Anreicherungsmuster der T-Zellen in den Empfängermäusen sichtbar gemacht. Letztendlich wird die biolumineszente Bildgebung verwendet, um die Verlagerungs- und Anreicherungsmuster der T-Zellen während der GVHD darzustellen.Der Hauptvorteil der biolumineszenten Bildgebung gegenüber bestehenden Technologien liegt darin, dass sie eine Detektion von Lymphozyten im gesamten Mausorganismus ermöglicht, im Gegensatz zu bestehenden Technologien, bei denen nur eine bestimmte Stelle untersucht werden kann. Die Empfängermäuse müssen vor der Knochenmark- und Zelltransplantation einer letalen Bestrahlung unterzogen werden. Stellen Sie bis zu 10 Empfängermäuse in einen Mikroisolator-Käfig, der mit dem verwendeten Bestrahlungsgerät kompatibel ist. Als Nächstes bestrahlen Sie die Mäuse entweder mit einer Cäsium-137-Quelle oder einem RS 2000, einem Bestrahlungsgerät mit einer Anfangsdosis von 4,5 Gray. Drei Stunden später bestrahlen Sie die Mäuse erneut mit 4,5 Gray, sodass insgesamt eine Strahlendosis von neun Gray erreicht wird. Nach der zweiten Dosis stellen Sie die empfängenden Mäuse in einen Mikroisolatorkäfig mit sauerstoffhaltigem Wasser mit einem pH-Wert von drei, bis zum Zeitpunkt der Transplantation.Säurehaltiges Wasser hilft, fakultative Infektionen bei Empfängern zur Gewinnung von PLE-Zellen zu kontrollieren. Durchtrennen Sie die Haut eines euthanasierten Spendermäuschens, indem Sie einen vertikalen zwei Zentimeter langen Schnitt etwa zwei Zentimeter rechts der Mittellinie direkt unterhalb des Rippenbogens machen, um die Milz zu lokalisieren. Entfernen Sie anschließend die Milz und legen Sie sie in ein 40-Mikroliter-Mesh-Grün in einer Petrischale, die 1640 RPMI mit 5 % FBS enthält.Um Einzelzell-Suspensionen herzustellen, verwenden Sie den Kolben eines Spritzen, um die Milz aufzubrechen, bis die gesamte Milz durch den Netzfilter hindurchgegangen ist. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Wildtyp- und jede luxe-positive Spendertauze. Sammeln Sie alle Einzelzell-Suspensionen vom Wildtyp in einem 50-Milliliter-Konischgefäß und alle luxe-positiven Einzelzell-Suspensionen in einem separaten 50-Milliliter-Konischgefäß.Nachdem die Suspensionen in ihren jeweiligen Röhrchen gesammelt wurden, zentrifugieren Sie die Zellen und suspendieren die Pellets anschließend in 1640 RPMI mit 5 % FBS. Anschließend die Zellen zählen.Entfernen Sie die Haut von einem Hinterbein einer Spendemaus und schneiden Sie vorsichtig mit einer robusten Schere so viel Muskelgewebe wie möglich vom Femur und vom Tibia-Fibula-Komplex ab. Trennen Sie den Femur am Hüftgelenk ab, um das Hinterbein zu entfernen. Schneiden Sie anschließend die Hinterpore direkt unterhalb der Insertionsstelle von Tibia und Fibula ab.Entfernen Sie vorsichtig das restliche Muskelgewebe und schneiden Sie die Fibula ab. Da in der Fibula nur wenig Mark vorhanden ist, kann sie weggeworfen werden. Legen Sie danach das Hinterbein in kalte 1640-RPMI-Lösung mit 5 % FBS und wiederholen Sie den Vorgang für das zweite Hinterbein.Die Hintergliedmaßen im Medium lagern, bis alle Hintergliedmaßen entfernt sind. Jede Maus sollte zwischen 20 × 10⁶ und 40 × 10⁶ Knochenmarkzellen liefern. Um die Entnahme des Knochenmarks vorzubereiten, entnehmen Sie eine Hintergliedmaße aus dem kalten R-PMI-FBS-Medium und legen sie in eine große Petrischale, die ein Milliliter kaltes Medium enthält.Schneiden Sie die Kniegelenke von jedem Hinterbein ab. Befestigen Sie dann eine subkutane Nadel mit einer Größe von 27 bis 29 Gauge an einer 10-Milliliter-Spritze und führen Sie die Nadel in die Tibia ein. Drücken Sie die Spritze so lange zusammen, bis das gesamte rote Material aus dem Inneren der Tibia entfernt ist.Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem Femur. Entsorgen Sie alle übrigen Knochen, die kein Knochenmark mehr enthalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem zweiten Hinterbein.Pipettieren Sie das Medium mit Knochenmark in eine große Petrischale. Um die Einzelzell-Suspensionen mithilfe einer Spritze, eines Kolbens und eines 40-Mikroliter-Mesh-Siebs herzustellen, zerkleinern Sie das Knochenmark, bis es vollständig durch den Sieb gegangen ist. Danach pipettieren Sie die Einzelzell-Suspension in ein 50-Milliliter-Konischgefäß und stellen dieses auf Eis, um CD3-positive Zellen aus dem Knochenmark gemäß Herstellervorschrift auszuschöpfen.Nachdem das Mark von CD3-positiven Zellen befreit wurde, waschen Sie die verbleibenden Zellen, indem Sie die SP-Zellen und Knochenmarkszellen durch Zentrifugation trennen; mischen Sie SP-Zellen und Knochenmarkszellen nicht. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers. Entfernen Sie danach die gesamte Überstände.Suspendieren Sie die Knochenmarkzellen in 100 µL Max-Puffer pro 10 Millionen Knochenmarkzellen. Fahren Sie mit der CD3-Depletion gemäß dem Herstellungsprotokoll fort. Waschen Sie die CD3-depletierten Knochenmarkzellen anschließend dreimal in steriler PBS.Zählen Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in einem geeigneten Volumen, um 10 hoch 7 Zellen zu injizieren. Resuspendieren Sie das Wildtyp-Pellet in 90 Mikroliter Max-Puffer pro 10 hoch 7 Zellen. Fahren Sie mit der CD8-T-Zell-Depletion fort.Gemäß Herstellerprotokoll das luxuspositive Pellet in 40 µl Max-Puffer pro 107 Zellen resuspendieren. Fortsetzen mit der CD8+-T-Zell-Reinigung. Gemäß Herstellerprotokoll jede Zellpopulation zählen und jede Population dreimal mit je einem Milliliter sterilem PBS waschen; jede Population anschließend in einem geeigneten Volumen resuspendieren, um 18 × 106 CD8+-verarmte, wildtypische PLE-Zellen und 2 × 106 L2G85B6-reinigete CD8+-T-Zellen zur Injektion vorzubereiten.Zunächst kombinieren Sie 10 der sieben CD drei verarmten Knochenmarkszellen 18 mal 10 hoch sechs Wildtyp-CD-acht-verarmte Zellen und zwei mal 10 hoch sechs L zwei G 85 B sechs lux-positive, gereinigte CD-acht-T-Zellen in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Anschließend waschen Sie die kombinierten Zellen mit steriler PBS und resuspendieren sie in 300 Mikrolitern steriler PBS.Als Nächstes wird mit einer 28-Gauge-Nadel die Zellpräparation in die Schwanzvene einer empfänglichen Maus injiziert. Die injizierten Empfängertiere werden in einem Mikroisolator-Käfig mit angesäuertem Wasser aufbewahrt. Die Tiere werden täglich mithilfe des in Tabelle 1 dargestellten GVHD-Bewertungssystems bewertet.Nach der Injektion der Mäuse mit Luciferin und der Bildgebung der anästhesierten Mäuse über fünf Minuten bei niedriger Belastung die Daten mithilfe der Living Image-Software analysieren. Mit der Living Image-Software können interessierende Bereiche definiert werden, und die Lichtemission kann quantifiziert werden, indem der aus jedem interessierenden Bereich emittierte Fluss berechnet wird. Hier ist das 1996 von Cook Etol entwickelte GVHD-Score-System.Die Mäuse sollten täglich nach jedem Kriterium auf der linken Seite bewertet werden. Jede Maus erhält für jedes Kriterium eine Punktzahl von null bis zwei, und die Gesamtpunktzahl ergibt sich aus der Summe aller einzelnen Punktzahlen. Hier sind die klinischen Scores und Überlebensdaten für die Empfängermäuse, denen allein 10 hoch sieben Knochenmarkzellen oder zusätzlich 18 × 10⁶ CD8⁺-T-Zell-depletierte Wildtyp-Zellen sowie 2 × 10⁶ gereinigte lose-positive CD8⁺-T-Zellen transplantiert wurden.Hier sind die klinischen Score-Daten für die Empfänger von alleinigem Knochenmark oder zusammen mit CD8-T-Zellen-depletierten wildtypischen Zellen und gereinigten los positiven CD8-T-Zellen dargestellt; die Überlebensdaten der Empfänger von alleinigem Knochenmark oder der Empfänger mit CD8-T-Zellen-depletierten wildtypischen BLE-Zellen und los positiven CD8-T-Zellen werden hier gezeigt. Dies sind biolumineszente Aufnahmen von empfängenden Mäusen nach Injektion von vier Milligramm D-Luciferin und Bildgebung mittels Enogen IVIS über fünf Minuten bei geringer Belichtung. Die pseudofarbigen Bilder sind dargestellt, wobei Purpur für geringe Intensität und Rot für hohe Intensität steht.Interessenbereiche wurden um die gesamte Maus herum gezeichnet und der Gesamtfluss bzw. die Quantifizierung durchgeführt. Gezeigt ist hier ein Biolumineszenzbild von Empfängermäusen nach Injektion von vier Milligramm D-Luciferin, aufgenommen mit dem Enogen IVIS für fünf Minuten bei geringer Rotation. Wie im vorherigen Bild dargestellt, handelt es sich bei den pseudofarbenen Bildern um Darstellungen, bei denen violett niedrige Intensität und rot hohe Intensität repräsentiert.A, B und C stellen die Bildgebung am vierten, sechsten bzw. achten Tag nach der Übertragung dar. Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Durchflusszytometrie verwendet werden, um die in den Darm eindringenden T-Zellen genauer zu charakterisieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt die Induktion der Darmtransplantat-gegen-Wirt-Krankheit, GvHD, bei einer tödlich bestrahlten Empfängermaus unter Verwendung von allogenen hämatopoetischen Stammzellen und GvHD-induzierenden Milz-alloreaktiven T-Lymphozyten. Dieses Protokoll hilft bei der Etablierung eines schweren akuten intestinalen GvHD-Modells, um den Mechanismus der Krankheit zu verstehen und innovative Therapieoptionen zu entwickeln.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit in Mausmodellen durch allogene Knochenmark- und Milzzelltransplantation

Die Schwanzhauttransplantation ist ein leistungsfähiges Modell zur Untersuchung der T-Zell-abhängigen Abstoßung und Toleranzinduktion während allogener Immunantworten bei Mäusen. Die Vorteile dieses Protokolls sind kleinere invasive Eingriffe und eine einfache Überwachung, ohne dass die Empfängermaus geopfert werden muss.

Transplantation von Haut-Schwanz zu allogene CD4-T-Zellantworten in Mäusen untersucht

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Induktion von Dickdarmentzündungen bei Mäusen durch adoptiven Transfer von syngenen CD4+CD45RBhohen T-Zellen in T- und B-Zell-defiziente Empfänger. Klinische und histopathologische Merkmale ahmen entzündliche Darmerkrankungen beim Menschen nach. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung des Beginns von Dickdarmentzündungen und des Fortschreitens der Krankheit.

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

Wir beschreiben ein Protokoll für die Aorteninterpositionstransplantation bei Mäusen. Ziel des Protokolls ist es, ein Modell zur Verfügung zu stellen, mit dem pathologische Prozesse und therapeutische Strategien, die für alloimmune Reaktionen in den Arterien relevant sind, und die daraus resultierenden arteriellen Veränderungen, die zum Versagen von Organtransplantaten beitragen, untersucht werden können.

Maus-Modell der Alloimmune-induzierte Gefäßabstoßung und Transplantat-Arteriosklerose

Murine Vollhauttransplantation ist ein gut etabliertes Modell Ablehnung in einer alloimmune Einstellung zu studieren. Hier bieten wir ein Tutorial von jedem Schritt beteiligt bei der Durchführung einer Balb / c -&gt; C57BL / 6 Vollhauttransplantation.

Murine Vollhauttransplantation

Hier präsentieren wir Ihnen eine Protokoll, die beschreibt allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation und ermöglicht sich wiederholenden Mini-endoskopische Auswertungen des distalen Colon an Ort und Stelle für die Präsenz, die Merkmale und die Schwere der Kolon Entzündung im live Mäuse Darm Graft - Versus - Host-Seuche leiden.

Induktion der intestinalen Graft - Versus - Host-Seuche und seiner Mini-endoskopische Beurteilung in Live Mäuse

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Wir beschreiben eine menschliche periphere Mononuklezelle (PBMC) – basierendes humanisiertes Xenograft-Mausmodell für translationale Immunonkologieforschung. Dieses Protokoll könnte als allgemeine Leitlinie für die Erstellung und Charakterisierung ähnlicher Modelle für die Bewertung von I-O-Therapien dienen.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

Graft-versus-Host-Krankheit ist eine große Komplikation nach allogenen Knochenmarktransplantation. Dendritische Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Transplantat-versus-Host-Krankheit. Der aktuelle Artikel beschreibt eine neuartige Knochenmarktransplantationsplattform, um die Rolle dendritischer Zellen bei der Entwicklung von Transplantat-versus-Host-Krankheit und dem Transplantat-versus-Leukämie-Effekt zu untersuchen.

Knochenmarktransplantationsplattform zur Untersuchung der Rolle dendritischer Zellen bei Graft-versus-Host-Krankheit

Dieses Protokoll beschreibt eine unkomplizierte und minimalinvasive Methode zur Transplantation und Bildgebung von NIT-1-Zellen in nicht-adipösen diabetischen (NOD)-schweren kombinierten immundefizienten Mäusen, die mit Splenozyten konfrontiert wurden, die von spontan diabetischen NOD-Mäusen gereinigt wurden.

Biolumineszentes Monitoring des Transplantatüberlebens in einem adoptiven Transfermodell des Autoimmundiabetes bei Mäusen

Erfahren Sie die Induktion von Graft-versus-Host-Krankheit und die In-vivo-Überwachung von T-Zellen in einem MHC-kompatiblen Mausmodell. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Visualisierung immunologischer Mechanismen.

Induktion der Graft-versus-Host-Krankheit und

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