Name: Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Lernen Sie die Bewertung teratogener Veränderungen bei Zebrafisch-Embryonen nach Ethanol-Exposition. Diese Methode nutzt Danio rerio zur Untersuchung genetischer und phänotypischer Entwicklungsdefekte.

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Wir möchten Monte Westerfield, Makoto Kobayashi und Jacek Topczewski für die Gaben der Plasmide danken für in-situ-Hybridisierung und mRNA Mikroinjektion. Wir bedanken uns bei Steph Erhard für seinen Einsatz in dem Video. Wir möchten auch die Hilfe von William Goossens mit der konfokalen Mikroskopie in dem Video gezeigt anerkennen. Tyler Schwend bereitgestellten Bilder in dem Video verwendet wird, und Rodney Dale mit Vorbereitung auf das Video unterstützt. Wir erkennen auch die CMRC Tierpfleger für die Zucht Arbeit mit dem Zebrafisch. Diese Arbeit wurde vom NIH R21 AA13596 zu SCA finanziert.

1. Ethanol Behandlung der Embryonen <ol><li> Zebrafisch-Embryonen aus Wildtyp-Paarungen abgeleitet wurden bei 28 ° C erhöht, in 5 ml Wasser Embryo. (Milli-Q Wasser mit 60 mg / L Instant Ocean). Verschiedene Stämme von Wildtyp-Embryonen haben leicht unterschiedliche Toleranzen, um die Exposition 9 Ethanol. </li><li> Die Exposition gegenüber Ethanol wurde bei Kuppel Stufe (~ 4,3 Stunden nach der Befruchtung, HPF) für die gewünschte Zeitdauer eingeleitet, bis zu 24 h Puls. Diese Startphase ist etwa vergleichbar mit der Implantation der Bühne von Säugetier-Embryonen, kurz vor der Gastrulation. Ethanol verwendeten Konzentrationen reichen von 0,2% -2,5%, Volumen / Volumen. Tests haben gezeigt, dass 25-50% der Lösung in dem Wasser am Ende in den sich entwickelnden Embryo 10, 11. Die Embryonen werden bei 28 ° C für die gewünschte Zeitdauer gehalten. Nach der gewünschten Länge von Ethanolexposition wird das Ethanol-Wasser-Lösung entfernt und mit drei Wäschen mit regelmäßigen Zebrafisch Wasser ersetzt und gehalten for die gewünschte Länge der Zeit. Die Spezifität des Mangels hängt von der Zeit des Beginns, der Dosis und der Länge des Pulses von Ethanol. </li></ol> 2. Sammlung von Embryonen für die RNA in situ Hybridisierung, Antikörper und Knorpel Färbung <ol><li> Um mRNA für die qPCR sammeln, sind gleichaltrigen Embryonen in Eppendorf-Röhrchen gesammelt. Nach dem Entfernen des Zebrafisch Wasser, Lysepuffer mit TCEP zugegeben. Eine motorisierte pulverisiert wird verwendet, um physisch distanzieren die Embryonen in der Lyse-Lösung. Dieses wird dann durch eine Preclear Spalte, die keine große Stücke entfernt undissoziierten geleitet. Die resultierende Lösung enthält alle Makromoleküle durch die Lyse freigesetzt. RNA wird dann, indem Sie diese Lösung auf einer Säule, gefolgt von Waschungen und DNAse-Behandlung extrahiert. Die Elution wird dann unter Verwendung von entweder Wasser oder einer Elutionslösung vom Hersteller (5&#39;-Prime) vorgesehen ist. Die RNA kann, um cDNA umgewandelt werden unter Verwendung von Standardtechniken für die qPCR oder Mikroorganismen eingesetztArray-Analyse. </li><li> Für die in situ Hybridisierung und Antikörper-Färbung, Embryonen 6-24 hpf wurden in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C fixiert Dies wird mit 3 Waschschritten in PBS + 0,1% Tween (PBT), Embryonen aus aneinander haften gefolgt. Die Embryonen werden dann durch eine Reihe von 3 Methanol übertragen: PBT wäscht in 100% Methanol, an welcher Stelle sie bei -20 ° C gelagert werden können Diese Embryonen können in situ-Hybridisierung oder Antikörper-Färbung verwendet werden. Einige Antikörper funktionieren nicht nach Methanol-Behandlung, so dass diese Einschränkung zu berücksichtigen und Ihre spezifischen Antikörper getestet, um festzustellen, ob es nach der Behandlung mit Methanol wird funktionieren muss. </li><li> Für Knorpel-Färbung, müssen Embryonen Anspruch 5 oder 6 Tagen nach der Befruchtung (dpf) angehoben werden. Sie werden dann in 4% Paraformaldehyd über Nacht bei 4 ° C, gefolgt von 3 Waschschritten in PBT. </li></ol> 3. Die Beurteilung Ethanol-induzierte Veränderungen der Genexpression und Entwicklungsfolgen <ol><li&gt; Um festzustellen, welche die Genexpression haben sich geändert, Zielgenen werden sowohl qPCR und in situ Hybridisierung untersucht. qPCR wird erreicht unter Verwendung von Primern mit Integrated DNA Technologies (IDT)-Software, dann validiert mit 3 separaten biologischen Proben entwickelt. Sobald Primer validiert wurden, wird auf qPCR cDNA aus RNA-Proben gesammelt erstellt durchgeführt. Jede Probe wird in dreifacher Ausfertigung durchgeführt. PCR-Reaktionen werden Platinum SYBR Green qPCR Super Mix (Invitrogen) auf einer Chroma-4 PCR-Maschine (BioRad) oder ähnliche PCR-Maschine mit einer Multicolor Detection System laufen. Zusätzlich zu den Genen verhört, ist es entscheidend, dass eine Steuerung der Primer festgelegt wird verwendet, um kleine Unterschiede in der cDNA oder RNA-Präparation auszugleichen. Für unsere Zebrafischembryonen verwenden wir GAPDH: 5&#39;GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3 &#39;und 5&#39;TTGCACCACCCTTAATGTGA3&#39;. Gene, die analysiert werden dann an ein GAPDH normalisiert die relative Quantifizierung der Genexpression berechnet sich nach Pfaffl Methode Variante 2 <sup&gt; - Ct, die Anzeige von Daten wie fache Differenz in der experimentellen Vergleich zum Wildtyp-12. Die normalen Berechnung nimmt an, dass alle Gene Duplizieren der DNA zweimal für jeden Zyklus, und drückt somit die Daten als Verhältnis der Änderung im experimentellen Gens über die Änderung der Bezugs-Gen, ausgedrückt als Leistungsberechnungen über die ganze Zahl &quot;2&quot;, welches die Effizienz der Verdoppelung der DNA pro Zyklus in einer perfekten PCR-Reaktion zu sehen. Der Pfaffl Methode ersetzt den generischen &quot;2&quot; mit dem Experimentator erzeugt echte Effizienz für die PCR-Primer gewählt. Er berücksichtigt genaueres Bild der Differenz in den PCR-Reaktionen. Die vollständige Formel lautet: <table border="0"><tbody><tr><td> (Wirksamkeit der experimentellen Gen) (CT Kontrolle Probe-Ct von behandelten Probe) </td></tr><tr><td> -------------------------------------------------- ----------------------------------- </td></tr><tr><td> (Effizienz des Referenz-Gen) (CT vonKontrollprobe - Ct von behandelten Probe) </td></tr></tbody></table></li><li> Für die in situ Hybridisierung, Digoxigenin (DIG)-markierte Ribosonden aus Plasmiden, die Abschnitte des Gens von Interesse ausgebildet ist. Alter zusammenpassende Embryonen auf Ribosonden unter Verwendung von Standardbedingungen 13 ausgesetzt und unter Verwendung von Anti-DIG-Antikörper gekoppelt ist, um alkalische Phosphatase, die den Standort der markierte Ribosonden Verwendung einer Farbreaktion (NBT / BCIP) ermöglicht. Die Embryonen werden dann visualisiert mit einem Leica Binokular (Abbildung 1B-G). </li><li> Um morphogenetische Entwicklung zu beurteilen, werden Embryonen zur gewünschten Zeit gesammelt und unter dem Binokular. Für Somiten Form, sind Live-Embryonen 14 abgebildet. Für Inter Augenabstand und Körperlänge, sind Embryonen in PFA fixiert. In allen Fällen werden die Bilder des gewünschten Bereichs auf einem Präpariermikroskop mit einer festen Vergrößerung und Messungen mit Adobe Photoshop softwar erfasste 10,14. </li><li> Um die Auswirkungen der Behandlung auf die Entwicklung von Knorpel-Strukturen im Larvenstadium Zebrafisch zu untersuchen, benutzen wir Alcianblaufärbung. 20% Eisessig (Säure-Alkohol) für mehrere Stunden oder über Nacht: Fixed Zebrafischlarven sind mit Alcianblau-Lösung in 80% Ethanol gelöst behandelt. Die Larven werden in mehreren Waschungen mit Säure-Alkohol bevor sie in eine 1% KOH übertragen entfärbt: 3% Wasserstoffperoxid-Lösung für weitere Abwicklung von Pigmentzellen. Zebrafisch müssen mindestens 4 Tage alt, um Knorpel-Strukturen zeigen sein, und diese werden besser in den Fischen, die 5 oder 6 Tage alt sind definiert. </li><li> Der Zelltod in lebenden Embryonen wird anhand Acridinorange (AO). AO ist zellpermeablen, lebende Zellen, und bindet an DNA in Zellen mit eingeschränkter Membranen, einschließlich der Apoptose und Nekrose. Leben Embryonen werden mit 5 mg / ml AO in PBS für 1 Stunde inkubiert, gefolgt von 3 Waschschritten in PBS. Die Embryonen werden dann bebildert mit dem konfokalen Mikroskop. Digitale Z-Sern Bilder werden kombiniert, um Verbundwerkstoffe zu schaffen. </li></ol> 4. Manipulation des Zebrafisch-Embryos <ol><li> Nach der Identifizierung von Genen, die durch Ethanolexposition verringert werden, ist es möglich, zu versuchen, sie zu ersetzen durch Injektion von mRNA konstruiert, um die fehlende Gen zu ersetzen. Capped mRNA von linearisierten DNA-Plasmide unter Verwendung von RNA-Polymerase in vitro-Transkription-Kits transkribiert, nach den Anweisungen des Herstellers (mMessage Maschine, Applied Biosystems). Zwischen 25 bis 200 pg / nl von RNA in 1-2 Zell-Stadium Zebrabärblingeier injiziert, in einer Lösung von 0,1 M KCl. Die Embryonen werden dann absetzen gelassen, mit Ethanol behandelt, wie oben (5) beschrieben erholen. </li><li> Für alle, die durch Gen-Transkripte Ethanolexposition erhöht werden, können sie reduziert werden, oder &quot;Knocked Down&quot; mit einem Antisense-Morpholino-Technologie. Antisense Morpholinos (AMO) werden von der Firma Gene-Tools entwickelt, und blockieren die Translation von RNA in Protein oder block die Reifung und Spleißen von RNA, je nach Notwendigkeit experimentellen. Diese Aktion von Morpholinos beschränken die Menge an aktivem Protein für das Gen gezielt, ein Defizit, gemessen mit anitibodies werden können, wenn sie verfügbar sind. Die Effizienz der RNA-Spleißen Morpholinos gemessen mittels RT-PCR, die relativen Mengen der gespleißten und ungespleißten Transkripten zu detektieren. Titrieren der Morpholino kann in dosisabhängige Aktivität 15 zur Folge haben. Amos sind auf die Zusammenarbeit Konzentrationen (pg bis ng titriert Konzentration) in Danieau Lösung (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5 mM HEPES, pH 7,6) verdünnt. Die Einspritzung erfolgt an der 1-2-Zellen-Stadium, dann werden die Embryonen erlaubt, bevor sie einer Wärmebehandlung wie oben Ethanol zu entwickeln. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Zebrafisch-Embryo Exposition gegenüber Ethanol führt zu einer Reihe von Entwicklungs-und genetischen Defekten, die verwandt sinddie Phänotypen in anderen Wirbeltieren gefunden. Wir haben eine abnorme Entwicklung der axialen Gewebe dokumentiert, einschließlich der Chorda (Daten nicht gezeigt 14). Die Entwicklungsverzögerung durch Ethanol führt anscheinend zu einer Störung der ordnungsgemäßen Chorda Dehnung, was zu einer verkürzten und gelegentlich gestört Chorda (Daten nicht gezeigt 14). Diese frühe Verzögerung und Chorda Defekt führt wahrscheinlich zum Teil auf den späteren Auffälligkeiten in den Somiten (Abb. 2), die ihre starke Form Chevron verloren haben, als in den unbehandelten Kontrollen gesehen und sind näher an den U-förmigen Somiten Merkmal der Phänotypen gesehen, wenn Sonic-Signalisierung wird 14 reduziert. Der Winkel der Somiten kann unter Verwendung von Standard-Software, und die Winkel erhöht sich von 92,1 ± 4,6 ° in den unbehandelten Kontrollen auf 122,6 ± 6,6 ° in den Ethanol-behandelten Embryonen (p &lt;0,001) werden. Eine weitere Folge von Ethanolexposition die downstrea sein könntenm frühen Entwicklungsverzögerung und später Chorda Mängel ist eine verkürzte Länge des Embryos (Abbildung 3). Wobei auch der Embryonen zu berücksichtigen die Krümmung durch Ethanolexposition hergestellt führt Ethanolexposition zu einer verkürzten Stamm, der abhängig von der Dosis der Embryo Ethanol ausgesetzt war ist (3E 14). Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit der Persistenz der Vorpubertät Kleinwuchs bei Kindern, die Ethanol ausgesetzt während der Entwicklung 16, 17 gefunden, was darauf hindeutet, dass das Zebrafisch-Modell relevant für das Verständnis des menschlichen Geburtsfehler ist. Eines der klassischen Merkmale des FAS ist ein klassisches Fazies, einschließlich einer reduzierten Kiefer, kleine Augen öffnen, und eine glatte Philtrum. Ein Großteil dieser Funktionen werden zu einer Reduktion in der Mittellinie Gewebe. Es wurde in Tiermodellen gezeigt worden, dass schwere Ethanolexposition noch stärker Phänotypen, einschließlich synopthalmia und Zyklopie führt. Wenn exposingen Zebrafischembryonen höhere Dosen von Ethanol sinkt der intraokularen Abstand (IOD) in einer dosisabhängigen Art und Weise (Abbildung 4) im Einklang mit der Natur des menschlichen Geburtsfehler. Cyclopia nur bei sehr hohen Dosen vor, aber niedriger Dosis muss eine signifikante Reduktion in der IOD (4) zu erzeugen, was darauf hindeutet, dass dieses Tiermodell einen ähnlichen Defekt in der Mitte, Gesichtsentwicklung 10 aufweist. Um den zugrunde liegenden Mechanismus der Mängel sowohl in der Körper und das Gesicht von Ethanol produziert Exposition zu verstehen, haben wir versucht, Veränderungen der Genexpression, die früh in der Entwicklung auftreten und dass aller Voraussicht nach zu später Entwicklungsstörungen beitragen werden, zu etablieren. Wir tun dies in zweierlei Hinsicht, ermöglicht die Extraktion von mRNA, die aus Embryonen für eine quantitative Auswertung der Ebenen der Genexpression in Ethanol behandelt Embryonen im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abbildung 1A). Darüber hinaus können wir in situ durchführenHybridisierung an das Muster von Genen zu suchen, unabhängig davon, ob das Signal verringert wird (1B-G 18). In diesem Beispiel sind zwei Gene, deren Expression nach Exposition gegenüber Ethanol verringert gezeigt, Gli1 und six3b. Wenn wir die in-situ-Muster für six3b untersucht Versuch es eine Verringerung der räumlichen Ausdehnung der Expression dieses Gens (1 Zum Beispiel) in Embryonen, die Ethanol ausgesetzt. Eine ähnliche Reduktion wurde in der GSC-Gen (Abb. BD) gefunden. Sowohl six3b und GSC sind in Geweben bestimmt, zu kraniofazialen Mittellinie Geweben beitragen ausgedrückt. So Reduktion dieser Gene bei 8 hpf steht im Einklang mit der Verringerung der IOD weiter hinten, wie in 4 gezeigt. Wenn Gene, die durch Ethanol beeinflusst identifiziert sind, gibt es Mechanismen, durch den die Expression von ihnen erhöht oder verringert werden kann. In diesem speziellen example, haben wir zwei Gene, die sind zurückgegangen (Gli1 und six3b) durch qPCR gezeigt. Wir entschieden uns, mRNA zu injizieren, um festzustellen, ob die Umkehr dieser Genveränderungen Ergebnisse verbessern können. Für dieses Experiment statt Injektion Gli1, entschieden wir uns zu sch, ein Ligand, der Gli1 Ebenen erhöht injizieren. Für six3b, konnten wir six3b selbst zu injizieren. Wir fanden keine Veränderungen, wenn wir six3b (Daten nicht gezeigt) injiziert, sondern konnten sich retten, die grundsätzlich grobe Mängel in Zebrafisch-Embryos mit zusätzlichen Injektionen shh (Abbildung 5). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ethanolexposition ändert die frühen Muster und Genexpression von ausgewählten Entwicklungs-Genen. A) qPCR-Ergebnisse für Embryonen im 8hpf. Die Ergebnisse für zwei Gene werden angezeigt: six3b und Gli1. Ergebnisse als Mittelwert von drei getrennten Experimenten gezeigt,und die Dosis von Ethanol dargestellt beträgt 2,5%. Beide Gene sind in einer Weise, die signifikante Steuerung (t-Test, p &lt;0,05) reduziert ist. BG) In situ Hybridisierung von 8 hpf Zebrabärblinge. Sowohl GSC und six3b Muster werden zu diesem Zeitpunkt im Vergleich zur Kontrollgruppe verändert. (Modifiziert mit Erlaubnis von Loucks et al. 2007). <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig2.jpg" /> Abbildung 2. Somitenentwicklung wird in den behandelten Embryonen verändert. Somiten Struktur und Winkel bei 48 HPF untersucht. In der Kontrollgruppe Embryonen (A) haben Somiten eine Chevron-Form und einen spitzen Winkel. Ethanol ausgesetzt Zebrafisch haben mehr I-oder U-förmigen Somiten, und weniger scharfen Winkeln. (Modifiziert mit Erlaubnis von Loucks und Ahlgren 2009). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ethanol Behandlung signifikant abnimmt Körperlänge im Zebrafisch.Die Länge der unbehandelten und Ethanol-exponierten Embryonen wurden nach 5 Tagen der Befruchtung gemessen. Eine signifikante Reduktion in der Länge wurde bei allen behandelten Embryonen gesehen (ANOVA, p &lt;0,001). BD. Es gab eine geringe, aber signifikante Verringerung der Gesamtlänge von Embryonen mit 1,0% und 1,5% Ethanol behandelt, während eine größere Verringerung der Embryonen mit 2,0% und 2,5% Ethanol dosiert zu sehen war. E. Zur Größenunterschiede in jeder Kupplung zu steuern, wurden die Embryonen Steuerelement für jedes Experiment auf 100 normiert, und Geschwister-behandelten Embryonen als Prozentsatz von 100 ausgedrückt. (Modifiziert mit Erlaubnis von Loucks und Ahlgren 2009). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig4.jpg" /> Abbildung 4. Ethanolexposition führt zu einer Verringerung des intraokularen Abstand (IOD) in Zebrafisch-Embryos. A) Frontalansichten von Embryonen zeigen normalen und fusionierten Auge Phänotypen. B) Unterschiedliche Dosierungen von Ethanol für 3 Stunden während der Gastrulation res verabreichtultate in IOD verringert, wenn der Fisch 24 Stunden später untersucht werden. Fused Augen und Zyklopie sind nur bei der höchsten getesteten Dosis (2,4%) gesehen. * Kennzeichnet eine signifikante Reduktion der IOD im Vergleich zur Kontrollgruppe. (Modifiziert mit Erlaubnis von Ahlgren, 2004). <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig5.jpg" /> Abbildung 5. Shh-N-mRNA-Injektion rettet die grobe Mängel, die durch Ethanol Exposition von Zebrabärbling produziert. Eins-zwei Embryonen wurden mit 100 pg / nl Shh-N-mRNA und die Hälfte der injizierten Embryonen wurden zu den Standard-Ethanol-Dosen von 4,3 bis 24 HPF ausgesetzt injiziert. Die Embryonen wurden bei 5 dpf analysiert. Embryonen mit 2,0% Ethanol behandelt aufweisen dorsal kürzere Schwänze, I-förmigen Somiten, und Augen-Defekte einschließlich Zyklopie gekrümmt. Rettung dieser Phänotypen ist in 71/76 der injizierten Embryonen (93%) gesehen. In diesen Embryonen, wird der Körper gerade, sind die Chevron-förmige Somiten, und die Augen sind vollständig getrennt.

<ol><li>Streissguth, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+in+adolescents+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Jama%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome in adolescents and adults.</a> Jama. 265 (15), 1961-1967 (1991).</li>
<li>Floyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+from+the+CDC.+Preventing+alcohol-exposed+pregnancies+among+women+of+childbearing+age%3A+the+necessity+of+a+preconceptional+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Womens+Health+Gend.+Based+Med%22%5BJournal%5D)">Observations from the CDC. Preventing alcohol-exposed pregnancies among women of childbearing age: the necessity of a preconceptional approach.</a> J. Womens Health Gend. Based Med. 8 (6), 733-736 (1999).</li>
<li>Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+acute+ethanol+exposure+in+zebrafish+development%3A+a+critical+time+window+and+resilience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of acute ethanol exposure in zebrafish development: a critical time window and resilience.</a> PLoS One. 6 (5), e20037-e20037 (2011).</li>
<li>Dlugos, C. A., Rabin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional effects of developmental exposure to ethanol on the zebrafish heart.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 34 (6), 1013-1021 (2010).</li>
<li>Fernandes, Y., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+behavioral+changes+in+response+to+early+developmental+exposure+to+ethanol+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term behavioral changes in response to early developmental exposure to ethanol in zebrafish.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 33 (4), 601-609 (2009).</li>
<li>Bilotta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+embryonic+exposure+to+ethanol+on+zebrafish+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Effects of embryonic exposure to ethanol on zebrafish visual function.</a> Neurotoxicol. Teratol. 24 (6), 759-766 (2002).</li>
<li>Tanguay, R. L., Reimers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ethanol+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of ethanol developmental toxicity in zebrafish.</a> Methods Mol. Biol. 447, 63-74 (2008).</li>
<li>Blader, P., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+impairs+migration+of+the+prechordal+plate+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethanol impairs migration of the prechordal plate in the zebrafish embryo.</a> Dev. Biol. 201 (2), 185-201 (1998).</li>
<li>Loucks, E., Carvan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3rd%2C+Strain-dependent+effects+of+developmental+ethanol+exposure+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">3rd, Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).</li>
<li>Ahlgren, S. C. Molecular Mechanisms of Fetal Alcohol Syndrome: Shh-signaling. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhlgren%2C+SC+%22Comprehensive+Handbook+of+Alcohol+Related+Pathology%22">Comprehensive Handbook of Alcohol Related Pathology</a>. Preedy, V. , (2004).</li>
<li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (9), 45-45 (2001).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJowett%2C+T+%22Tissue+in+situ+hybridization%3A+methods+in+animal+development%22">Tissue in situ hybridization: methods in animal development</a>. , John Wiley & Sons. New York. 128-128 (1997).</li>
<li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 86, 556-567 (2009).</li>
<li>Schwend, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Npc1+and+availability+of+cholesterol+for+early+embryonic+cell+movements+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Requirement of Npc1 and availability of cholesterol for early embryonic cell movements in zebrafish.</a> J. Lipid Res. 52 (7), 1328-1344 (2011).</li>
<li>Spohr, H. L., Willms, J., Steinhausen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+spectrum+disorders+in+young+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol spectrum disorders in young adulthood.</a> J. Pediatr. 150 (2), 175-179 (2007).</li>
<li>Strauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+intrauterine+environment+on+childhood+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Effects of the intrauterine environment on childhood growth.</a> Br. Med. Bull. 53 (1), 81-95 (1997).</li>
<li>Loucks, E. J., Schwend, T., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+changes+associated+with+teratogen-induced+cyclopia%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Molecular changes associated with teratogen-induced cyclopia.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 79 (9), 642-651 (2007).</li>
<li>Schwend, T., Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Gli+activity+in+craniofacial+tissues+of+hedgehog-pathway+reporter+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of Gli activity in craniofacial tissues of hedgehog-pathway reporter transgenic zebrafish.</a> PLoS One. 5 (9), 14396-14396 (2011).</li>
<li>Chrisman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+ethanol+exposure+disrupts+the+expression+of+FGF8+and+Sonic+hedgehog+during+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Gestational ethanol exposure disrupts the expression of FGF8 and Sonic hedgehog during limb patterning.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 70 (4), 163-171 (2004).</li>
</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Methoden und die Ergebnisse gezeigt, zeigen nur die Spitze des Zebrafisch-how lassen sich Entwicklungsstörungen verhören werden. Aufgrund der Zugänglichkeit des Embryos, der hohen Anzahl von Eiern für jede Kupplung, und eine hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse gelegt, sind diese ideal für Wirbeltiere Teratogenität durchgeführt. Fische können auch manipuliert werden, um fluoreszierende Moleküle enthalten, die als visuelle Reportergen für ein bestimmtes Gen oder ein Weg von Interesse 19 verwenden werden. In den Ethanol-Studien erscheinen die verwendeten Dosen recht hoch im Vergleich zu Säugetieren Blutalkoholspiegel. Jedoch, während die einzelnen Stufen das in dem Wasser, und nicht alle der Ethanol auf den Embryo geliefert. Insgesamt deuten die beschriebenen Methoden und oben erläuterten, dass Zebrafischembryonen sehr nützlich bei der Modellierung menschlichen Missbildungen im Zusammenhang mit Ethanolexposition sind. Darüber hinaus haben die Veränderungen der Genexpression im Zebrafisch vor von anderen bestätigtin den Säugetier-Modellsystemen 20, was darauf hindeutet, dass die entwicklungspolitischen Effekte von Ethanol auf Wirbeltiere werden beibehalten. Viele der Techniken demonstriert oben kann mit anderen Umwelt-oder pharmazeutischen Beleidigungen verwendet werden, um schnell und einfach erkennen potenzielle Teratogene und bestimmen die zugrunde liegenden Mechanismen, die zur Teratogenität eines bestimmten Stoffes beitragen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Tissue RNA Kit: 5-Prime PerfectPure </td><td> Fisher Scientific </td><td> FP2302410 </td></tr><tr><td> Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG </td><td> Invitrogen </td><td> 11733038 </td></tr><tr><td> mMessage mMachine hohe Ausbeute begrenzt RNA-Transkription-Kit </td><td> Applied Biosystems </td><td> Abhängig von der RNA-Polymerase in Ihrer Plasmid </td></tr></tbody></table>

die beurteilung teratogene Änderungen in einem zebrafisch-modell der fetal alcohol exposure

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetale Alkoholsyndrom (FAS) ist eine schwere Manifestation der embryonalen Exposition gegenüber Ethanol. Es stellt sich mit charakteristischen Defekten im Gesicht und Organe, einschließlich mentaler Retardierung aufgrund ungeordneter und beschädigten die Entwicklung des Gehirns. Fetale Alkohol-Spektrum-Störung (FASD) ist ein Begriff verwendet, um ein Kontinuum von Geburtsschäden, die aufgrund mütterlichen Alkoholkonsum auftreten zu decken, und tritt bei etwa 4% der Kinder in den Vereinigten Staaten geboren. Mit 50% der gebärfähigen Alter Frauen berichten Konsum von Alkohol, und die Hälfte aller Schwangerschaften ungeplant sein, ist ein anhaltender unbeabsichtigten Exposition Ausgabe 2. Um am besten verstehen, den Schaden durch Ethanol produziert, plus ein Modell zu produzieren, mit denen potenzielle Interventionen zu testen, entwickelten wir ein Modell der Entwicklungspsychologie Ethanolexposition Verwendung der Zebrafisch-Embryos. Zebrafische sind ideal für diese Art von Studie Teratogen 3-8. Jedes Paar legt Hunderte von Eiern, die dann ohne Schädigung der Erwachsenen gesammelt werden könnenFisch. Die Zebrafisch ist transparent und kann leicht mit einer beliebigen Anzahl von Flecken abgebildet werden. Die Analyse dieser Embryonen nach Exposition mit Ethanol in verschiedenen Dosierungen und Zeiten der Dauer und der Anwendung zeigt, dass die grobe Entwicklungsstörungen durch Ethanol produziert im Einklang mit der menschlichen Geburtsfehler sind. Hier beschrieben werden die grundlegenden Techniken verwendet, um zu studieren und manipulieren das Zebrafisch-FAS-Modell.

Um die molekularen Mechanismen des Ethanol-induzierte Entwicklungsstörungen verstehen, haben wir einen Zebrafisch-Modell von Ethanol Exposition entwickelt und erforschen die physikalischen, zellulären und genetischen Veränderungen, die nach der Exposition auftreten Ethanol<sup&gt; 1</sup&gt;. Wir haben dann versuchen, mögliche Interventionen zu finden und schnell testen sie in diesem Tiermodell.

Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Das fetale Alkoholsyndrom (FAS) ist eine schwere Ausprägung einer embryonalen Ethanolexposition. Es äußert sich durch charakteristische Defekte an Gesicht und Organen, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen einer Ethanolexposition auf den sich entwickelnden Zebrafisch zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Zebrafische zunächst während der frühen Entwicklung in normalem Embryowasser Ethanol in bestimmten Dosen ausgesetzt werden. Anschließend wird das Ethanol entfernt, und die Fische dürfen bis zum gewünschten Zeitpunkt weiterentwickeln.Dann werden sowohl grobe physikalische Veränderungen als auch Änderungen in der Genexpression in behandelten im Vergleich zu Kontrollembryonen analysiert. Schließlich werden die Embryonen mit mRNA, Morpholinos oder Wirkstoffen manipuliert, um festzustellen, ob die durch Ethanol hervorgerufenen Entwicklungsdefekte verändert werden können. Letztendlich zeigen eine Kombination aus quantitativer PCR und *in situ*-Hybridisierung, dass die Wirkungen von Ethanol auf sich entwickelnde Zebrafisch-Embryonen mit Veränderungen in der Genexpression verknüpft sind.Spätere Eingriffe in die Genexpression können die durch Ethanol verursachten Entwicklungsstörungen verbessern oder verhindern. Die heute gezeigten Techniken erweitern unser Wissen über die Natur des fetalen Alkoholsyndroms sowie über konservierte Entwicklungsprozesse bei Wirbeltieren. Die Behandlung von Embryonen mit Ethanol wird heute von Steph Erhardt, einer Technikerin in meinem Labor, demonstriert.Züchten Sie sie durch Kreuzung von Wildtypen bis zum Kuppelstadium bei 28 Grad Celsius in Embryowasser. Verteilen Sie die Embryonen einer Gelege auf die gewünschte Anzahl von Schalen mit jeweils zwischen 10 und 50 Embryonen pro Schale. Geben Sie eine Ethanol-Lösung im Bereich von 0,2 bis 2,5 % (Volumen pro Volumen) in Fischwasser zu den Embryonen hinzu und kehren Sie sie nach der gewünschten Expositionszeit für bis zu 24 Stunden in den Inkubator zurück.Ersetzen Sie das Ethanol enthaltende Wasser durch frisches Embryowasser für einen bestimmten Entwicklungszeitraum, um mRNA für die quantitative PCR zu gewinnen. Geben Sie H-kompatible Embryonen in Eppendorf-Röhrchen. Entfernen Sie das Fischwasser und geben Sie Lysepuffer mit TCEP hinzu.Unter Verwendung eines motorbetriebenen Pulverisierers die Embryonen mechanisch dissoziieren und anschließend für eine langsame Zentrifugation in die Zentrifuge geben. Das Lösungsmittel auf eine Vorklärsäule übertragen und danach die Säule zentrifugieren, um dissoziierte große Partikel zu entfernen.Verwenden Sie ein RNA-Isolationskit, um die RNA zu extrahieren. Anschließend synthetisieren Sie cDNA mit Standardmethoden für die qPCR- oder Microarray-Analyse, um Embryonen für die *in situ*-Hybridisierung und Antikörperfärbung vorzubereiten. Fixieren Sie Embryonen sechs bis 24 Stunden nach der Befruchtung über Nacht in 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius, nach drei Waschschritten mit PBS plus 0,1 % Tween.Entfernen Sie die Chorionhülle mit zwei scharfen Pinzetten unter dem Mikroskop. Anschließend überführen Sie die Embryonen in Methanol, indem Sie die Flüssigkeit schrittweise mit zunehmender Methanol-Konzentration und abnehmender PBT-Konzentration wechseln. Nach dem Übertragen der Embryonen in 100 % Methanol lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius, um den Knorpel anzufärben.Züchten Sie die Embryonen bis zu fünf oder sechs Tage nach der Befruchtung. Fixieren Sie sie über Nacht in 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius. Waschen Sie sie anschließend dreimal in PBT, um zu bestimmen, welche Genexpressionsniveaus sich durch Ethanol-Behandlung verändert haben.Führen Sie eine QPCR durch, indem Sie zunächst Primer entwerfen, um die Primer zu validieren. Testen Sie diese an drei biologischen Proben. Diese kontrollierten biologischen Proben können beliebiges Alter aufweisen, solange das Gen von Interesse zu diesem bestimmten Zeitpunkt exprimiert wird.Nachdem die Primer verifiziert wurden, verwenden Sie die zuvor hergestellte cDNA, um eine qPCR durchzuführen, wobei die Proben im Dreifachansatz laufen und eine Kontrollprobe für einen Zebrafisch-Kontrollwert eingeschlossen wird; wir verwenden die Primer für gap dh. Normalisieren Sie die Ergebnisse auf die gap DH-Spiegel. Berechnen Sie anschließend die relative Genexpressionsmenge unter Verwendung der leistungsstarken Methode.Variation der doppelten Delta-Delta-CT-Methode zur Darstellung der Unterschiede im Experiment im Vergleich zum Wildtyp. Für den Zwei-Hybridisierungs-Konstrukt in C. Verwenden Sie markierte Ribo-Proben für das Gen von Interesse.Dann inkubieren Sie sie unter Standardbedingungen mit altersentsprechenden Embryonen und detektieren Sie das Hybridisierungsmuster mittels alkalischer Phosphatase; nehmen Sie die Proben mit einem Stereomikroskop auf, um die morphogenetische Entwicklung zu beurteilen, beispielsweise könnte die Form verwendet werden, um lebende Embryonen abzubilden und den interokularen Abstand sowie die Körperlänge zu bewerten. Fixieren Sie zunächst die Embryonen in Paraformaldehyd. Sammeln Sie anschließend Bilder, um die Auswirkungen der Alkoholbehandlung auf die sich entwickelnden Knorpelstrukturen in der Larvenfärbung zu untersuchen.Fixieren Sie Zebrabärblinge mit LC und Blau für mehrere Stunden bis über Nacht, um die Embryonen vor der Bildgebung zu fixieren und zu klären. Analysieren Sie den Zelltod in lebenden Embryonen, indem Sie diese eine Stunde lang in fünf Milligramm pro Milliliter Aine Orange in PBS inkubieren. Waschen Sie die Embryonen dreimal in PBS, montieren Sie die Embryonen anschließend auf Objektträgern, nehmen Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop auf und verwenden Sie Z-Serien, um Komposite zu erstellen.Nach der Identifizierung von Genen, deren Expression aufgrund der Exposition gegenüber Ethanol abgenommen hat, injizieren Sie 25 bis 200 Pikogramm pro Nanoliter kapptes mRNA eines Gens von Interesse in Embryonen im Ein- bis Zweizellstadium. Lassen Sie die Eier in einem beheizten Inkubator bei 28 Grad Celsius so lange regenerieren, bis sie das Dommoment erreichen, und behandeln Sie sie anschließend wie zuvor mit Ethanol. Für Gene, deren Expression infolge der Ethanolbehandlung angestiegen ist, führen Sie eine Herunterregulation durch Injektion von Pikogramm- bis Nanogramm-Mengen von antisense-Morpholinos in Embryonen im Ein- bis Zweizellstadium durch.Dieses Protokoll ähnelt dem für kappte mRNA. Falls eine mRNA oder ein Spleiß-Morpholino injiziert wird, messen Sie die Effizienz mittels RT-PCR, um die Mengen gespleißter und ungereifter Transkripte zu vergleichen, um die genetische Aktivität in Abhängigkeit von der Dosis zu analysieren, titrieren Sie das injizierte Morpholino und lassen Sie die Embryonen bis zu einem gewünschten Entwicklungsstadium wachsen, bevor Sie sie mit Ethanol behandeln. Die Exposition von Zebrafisch-Embryonen gegenüber Ethanol führt zu einer Reihe von Entwicklungs- und genetischen Defekten, die mit den Phänotypen verwandt sind, die bei anderen Wirbeltieren beobachtet werden.Die abnormale Entwicklung der axialen Gewebe, einschließlich Noor, führt zu einer verkürzten und gelegentlich unterbrochenen noord, was teilweise die späteren Anomalien in den Somiten verursacht, wie hier gezeigt. Während die unbehandelten Kontrollen eine ausgeprägte Pfeilform aufweisen, nehmen die durch Ethanol behandelten Somiten die U-förmige Gestalt an, die mit einer verminderten sonic hedgehog-Signalübertragung assoziiert ist. Wie hier zu sehen ist.Eine weitere Folge der Ethanol-Exposition, möglicherweise abhängig von einer frühen Entwicklungshemmung und nachfolgenden Noor-Defekten, ist eine verkürzte Embryolänge. Dieser Befund ähnelt der Persistenz einer vorpubertären Kleinwüchsigkeit bei Kindern, die während der Entwicklung Ethanol ausgesetzt waren, was darauf hindeutet, dass das Zebrafisch-Modell für das Verständnis dieses menschlichen Geburtsfehlers relevant ist. An Tiermodellen wurde gezeigt, dass eine schwere Ethanol-Exposition zu ausgeprägten Phänotypen des fetalen Alkoholsyndroms führt, einschließlich Synchie und Opie.Bei Zebrafischen nimmt der intraokulare Abstand (IOD) in Abhängigkeit von der Ethanoldosis ab, was mit der Natur des menschlichen Geburtsdefekts übereinstimmt. Opia tritt nur bei sehr hohen Dosen auf, doch bereits niedrigere Dosen führen zu einer signifikanten Verringerung des IOD, was darauf hindeutet, dass dieses Tiermodell einen ähnlichen Defekt in der Mittellinien-Entwicklung des Gesichts aufweist. In dieser Abbildung werden die Expressionslevel der frühen Gene sechs drei B und glee eins in unbehandelten und mit Ethanol behandelten Embryonen verglichen.Beide Gene zeigten in den mit Ethanol behandelten Proben verringerte Expressionsmengen. Mithilfe der NC-Zwei-Hybridisierung wurden die Expressionsmuster von sechs drei B und gooID wie dargestellt analysiert. Hier zeigten beide Gene eine Abnahme der räumlichen Expression in mit Ethanol behandelten Embryonen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen.Da beide Gene in Geweben exprimiert werden, die zu kraniofazialen Mittellinienstrukturen werden sollen, ist ihre Verringerung acht Stunden nach der Befruchtung vereinbar mit der späteren Entwicklung einer verminderten IOD. Sobald Gene identifiziert sind, die durch Ethanol beeinflusst werden, gibt es Mechanismen, durch die ihre Expression erhöht oder verringert werden kann. In diesem Beispiel wurde mRNA für sonic hedgehog injiziert, einen Liganden, der die Glee-one-Spiegel erhöht, wodurch die groben Defekte infolge der Verringerung von Glee one sowie die Defekte bei mit Ethanol behandelten Embryonen behoben wurden.Die Injektion von sechs drei B konnte jedoch das durch Ethanol hervorgerufene Phänotyp nicht retten. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man genetische und entwicklungsmäßige Defekte untersucht, die durch Ethanol in einem sich entwickelnden Zebrafischembryo verursacht werden. Die hier verwendeten Techniken können ebenfalls von Personen angewendet werden, die die Toxizität anderer wasserlöslicher Verbindungen am sich entwickelnden Wirbeltierembryo untersuchen möchten.

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Forschung

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Medizin

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