Die Beurteilung Teratogene Änderungen in einem Zebrafisch-Modell der Fetal Alcohol Exposure

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Auswirkungen einer Ethanolexposition auf den sich entwickelnden Zebrafisch zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem Zebrafische zunächst während der frühen Entwicklung in normalem Embryowasser Ethanol in bestimmten Dosen ausgesetzt werden. Anschließend wird das Ethanol entfernt, und die Fische dürfen bis zum gewünschten Zeitpunkt weiterentwickeln.

Dann werden sowohl grobe physikalische Veränderungen als auch Änderungen in der Genexpression in behandelten im Vergleich zu Kontrollembryonen analysiert. Schließlich werden die Embryonen mit mRNA, Morpholinos oder Wirkstoffen manipuliert, um festzustellen, ob die durch Ethanol hervorgerufenen Entwicklungsdefekte verändert werden können. Letztendlich zeigen eine Kombination aus quantitativer PCR und *in situ*-Hybridisierung, dass die Wirkungen von Ethanol auf sich entwickelnde Zebrafischembryonen mit Veränderungen in der Genexpression verknüpft sind.

Spätere Eingriffe in die Genexpression können die durch Ethanol verursachten Entwicklungsstörungen verbessern oder verhindern. Die heute gezeigten Techniken erweitern unser Wissen über die Natur des fetalen Alkoholsyndroms sowie über konservierte Entwicklungsprozesse bei Wirbeltieren. Die Behandlung von Embryonen mit Ethanol wird heute von Steph Erhardt, einer Technikerin in meinem Labor, demonstriert.

Züchten Sie sie durch Kreuzung von Wildtypen bis zum Kuppelstadium bei 28 Grad Celsius in Embryowasser. Teilen Sie die Embryonen einer Gelegeablage in die gewünschte Anzahl von Schalen auf, mit zwischen 10 und 50 Embryonen pro Schale. Geben Sie eine Ethanol-Lösung im Bereich von 0,2 bis 2,5 % (Volumen/Volumen) in Fischwasser zu den Embryonen hinzu und stellen Sie sie für bis zu 24 Stunden nach der gewünschten Expositionszeit zurück in den Inkubator.

Ersetzen Sie das Ethanol enthaltende Wasser durch frisches Embryowasser für einen bestimmten Entwicklungszeitraum, um mRNA für die quantitative PCR zu gewinnen. Geben Sie die H-angepassten Embryonen in Eppendorf-Röhrchen. Entfernen Sie das Fischwasser und geben Sie Lysepuffer mit TCEP hinzu.

Unter Verwendung eines motorbetriebenen Pulverisiergeräts die Embryonen mechanisch dissociieren und anschließend in die Zentrifuge für eine langsame Drehung geben. Das Lösungsmittel auf eine Vorklärsäule überführen und dann die Säule zentrifugieren, um dissociierte große Stücke zu entfernen.

Verwenden Sie ein RNA-Isolationskit, um die RNA zu extrahieren. Synthetisieren Sie anschließend cDNA mit Standardmethoden für die qPCR oder Microarray-Analyse, um Embryonen für die *in situ*-Hybridisierung und Antikörperfärbung vorzubereiten. Fixieren Sie die Embryonen sechs bis 24 Stunden nach der Befruchtung über Nacht in 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius, nachdem sie dreimal mit PBS plus 0,1 % Tween gewaschen wurden.

Entfernen Sie die Chorionhülle mit zwei scharfen Pinzetten unter dem Mikroskop. Anschließend überführen Sie die Embryonen mittels einer Serie von Flüssigkeitswechseln mit zunehmender Methanol-Konzentration und abnehmender PBT-Konzentration in Methanol. Nach dem Überführen der Embryonen in 100 % Methanol lagern Sie diese bei minus 20 Grad Celsius, um den Knorpel anzufärben.

Züchten Sie die Embryonen bis zu fünf oder sechs Tage nach der Befruchtung. Fixieren Sie sie über Nacht in 4 % Paraformaldehyd bei vier Grad Celsius. Waschen Sie sie anschließend dreimal in PBT, um zu bestimmen, wie sich die Genexpressionsniveaus durch Ethanol-Behandlung verändert haben.

Führen Sie die QPCR durch, indem Sie zunächst Primer entwerfen, um die Primer zu validieren. Testen Sie diese an drei biologischen Proben. Diese kontrollierten biologischen Proben können beliebiges Alter aufweisen, solange das Gen von Interesse zu diesem bestimmten Zeitpunkt exprimiert wird.

Nachdem die Primer verifiziert wurden, verwenden Sie die zuvor hergestellte cDNA, um eine qPCR durchzuführen, wobei die Proben im Dreifachansatz laufen und eine Kontrollprobe für einen Zebrafisch-Kontrollwert eingeschlossen wird; wir verwenden die Primer für gap dh. Normalisieren Sie die Ergebnisse auf die gap DH-Spiegel. Berechnen Sie anschließend die relative Genexpressionsmenge unter Verwendung der leistungsstarken Methode.

Variation der zweifachen Delta-Delta-CT-Methode zur Darstellung der Unterschiede im Experiment im Vergleich zum Wildtyp. Für den C-zwei-Hybridisierungskonstrukt. Verwenden Sie markierte Ribo-Proben für das Gen von Interesse.

Dann inkubieren Sie sie unter Standardbedingungen mit altersentsprechenden Embryonen und detektieren Sie das Hybridisierungsmuster mittels alkalischer Phosphatase; nehmen Sie die Proben mit einem Stereomikroskop auf, um die morphogenetische Entwicklung zu beurteilen, beispielsweise könnte die Formaufnahme lebender Embryonen zur Beurteilung des interokularen Abstands und der Körperlänge dienen. Fixieren Sie zunächst die Embryonen in Paraformaldehyd. Sammeln Sie anschließend Bilder, um die Auswirkungen der Alkoholbehandlung auf die sich entwickelnden Knorpelstrukturen in der Larvenfärbung zu untersuchen.

Fixieren Sie Zebrabärblinge mit lc und blau für mehrere Stunden bis über Nacht, um die Embryonen vor der Bildgebung zu fixieren und zu klären. Analysieren Sie den Zelltod in lebenden Embryonen, indem Sie diese eine Stunde lang in fünf Milligramm pro Milliliter Aine Orange in PBS inkubieren. Waschen Sie die Embryonen dreimal in PBS, montieren Sie die Embryonen dann auf Objektträgern, bilden Sie die Proben mit einem konfokalen Mikroskop ab und verwenden Sie Z-Serien, um Komposite zu erstellen.

Nach der Identifizierung von Genen, deren Expression aufgrund von Ethanol-Exposition abgenommen hat, injizieren Sie 25 bis 200 Pikogramm pro Nanoliter kappiertes mRNA eines Gens der Interesse in Embryonen im Ein- bis Zweizellstadium. Lassen Sie die Eier in einem beheizten Inkubator bei 28 Grad Celsius regenerieren, bis sie das Dommoment erreichen, und behandeln Sie sie anschließend wie zuvor mit Ethanol. Für Gene, deren Expression infolge der Ethanol-Exposition angestiegen ist, führen Sie eine Herunterregulation durch Injektion von Pikogramm- bis Nanogramm-Mengen von Antisense-Morpholinos in Embryonen im Ein- bis Zweizellstadium durch.

Dieses Protokoll ähnelt dem für kappte mRNA. Wenn eine mRNA injiziert wird, messen Sie die Effizienz mittels RT-PCR, um die Mengen gesplicter und ungesplicter Transkripte zu vergleichen, um die genetische Aktivität in Abhängigkeit von der Dosis zu analysieren, titrieren Sie die injizierte Morpholino-Oligonukleotidmenge und lassen Sie die Embryonen bis zu einem gewünschten Entwicklungsstadium wachsen, bevor Sie sie mit Ethanol behandeln. Die Exposition von Zebrafisch-Embryonen gegenüber Ethanol führt zu einer Reihe von Entwicklungs- und genetischen Defekten, die mit den Phänotypen verwandt sind, die bei anderen Wirbeltieren gefunden werden.

Die abnormale Entwicklung der Achsengewebe, einschließlich Noor, führt zu einer verkürzten und gelegentlich unterbrochenen Noord, was teilweise die späteren Anomalien in den Somiten verursacht, wie hier gezeigt. Während die unbehandelten Kontrollen eine ausgeprägte Pfeilform aufweisen, nehmen die durch Ethanol behandelten Somiten die U-förmige Gestalt an, die mit einer verminderten sonic hedgehog-Signalübertragung assoziiert ist. Wie hier zu sehen ist.

Eine weitere Folge der Ethanol-Exposition, möglicherweise abhängig von einer frühen Entwicklungsverzögerung und nachfolgenden Noor-Defekten, ist eine verkürzte Embryolänge. Dieser Befund ähnelt der Persistenz einer vorpubertären Kleinwüchsigkeit bei Kindern, die während der Entwicklung Ethanol ausgesetzt waren, was darauf hindeutet, dass das Zebrafisch-Modell für das Verständnis dieses menschlichen Geburtsfehlers relevant ist. An Tiermodellen wurde gezeigt, dass eine schwere Ethanol-Exposition zu ausgeprägten Phänotypen des fetalen Alkoholsyndroms führt, einschließlich Synchie und Opie.

Bei Zebrafischen nimmt der intraokulare Abstand (IOD) in Abhängigkeit von der Ethanoldosis ab, was mit der Natur des menschlichen Geburtsdefekts übereinstimmt. Opia tritt nur bei sehr hohen Dosen auf, doch bereits niedrigere Dosen führen zu einer signifikanten Verringerung des IOD, was darauf hindeutet, dass dieses Tiermodell einen ähnlichen Defekt in der mittigen Gesichtsentwicklung aufweist. In dieser Abbildung werden die Expressionslevel der frühen Gene six3b und gsc1 in unbehandelten und mit Ethanol behandelten Embryonen verglichen.

Beide Gene zeigten in den mit Ethanol behandelten Proben verringerte Expressionsniveaus. Mithilfe der NC-Zwei-Hybridisierung wurden die Expressionsmuster von sechs drei B und gooID wie gezeigt analysiert. Hier zeigten beide Gene im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen eine Abnahme der räumlichen Expression in mit Ethanol behandelten Embryonen.

Da beide Gene in Geweben exprimiert werden, die zu kraniofazialen Mittellinienstrukturen werden sollen, ist ihre Verringerung acht Stunden nach der Befruchtung vereinbar mit der späteren Entwicklung einer verminderten IOD. Sobald Gene identifiziert sind, die durch Ethanol beeinflusst werden, gibt es Mechanismen, durch die ihre Expression erhöht oder verringert werden kann. In diesem Beispiel wurde mRNA für sonic hedgehog injiziert, einen Liganden, der die Glee-one-Spiegel erhöht, wodurch die groben Defekte infolge der Verringerung von Glee one sowie bei mit Ethanol behandelten Embryonen behoben wurden.

Die Injektion von sechs drei B konnte jedoch das durch Ethanol hervorgerufene Phänotyp nicht retten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die genetischen und entwicklungsmäßigen Defekte untersucht, die durch Ethanol in einem sich entwickelnden Zebrafischembryo verursacht werden. Die hier verwendeten Techniken können ebenfalls von Personen angewandt werden, die die Toxizität anderer wasserlöslicher Verbindungen am sich entwickelnden Wirbeltierembryo untersuchen möchten.