Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu demonstrieren, wie Stickstoffmonoxid-Metaboliten in biologischen Proben genau und spezifisch nachgewiesen werden können. Dies wird erreicht, indem Blutproben unmittelbar nach der Entnahme zunächst verarbeitet werden, um den Verlust von Metaboliten oder die Bildung von Artefakten zu verhindern. Gleichzeitig wird eine schnelle und effiziente Gewebeentnahme durchgeführt, um die Auswirkungen einer hypoxischen Umgebung auf Stickoxid-Metaboliten zu minimieren.

Aortenringe werden entnommen und in ein Organbad gehängt, um ihre Endothelfunktion zu beurteilen. Darüber hinaus werden biochemische Assays verwendet, um den Nitratgehalt, den Nitritgehalt und den relativen Gehalt an Nitrothiolen und anderen nitrogesättigten Produkten im Gewebe zu quantifizieren. Mit diesen Assays kann ein richtiger Vergleich von Versuchs- und Kontrolltieren wertvolle Informationen über die Stickoxidproduktion und den Metabolismus liefern.

Der Hauptvorteil dieses Multi-System-Ansatzes gegenüber einzelnen Methoden oder Assays besteht darin, dass dies ein breiteres Bild der Stickstoffmonoxid-Biochemie in mehreren Organsystemen ermöglichen würde. Dann können wir beginnen zu verstehen, welche dieser Metaboliten einen prognostischen oder diagnostischen Nutzen haben könnten und wie das Repertoire der Stickstoffmonoxid-Metaboliten die Bildung und Verfügbarkeit von endothelialem Stickstoffmonoxid widerspiegelt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da jeder Schritt im Prozess entscheidend für die Aufrechterhaltung der Integrität der Probe ist.

Einige dieser Schritte sind aufgrund der feinen Details der Probenentnahme und Gewebeextraktion aus dem Abschnitt über die Lesemethoden in einer typischen Zeitschrift nicht ersichtlich. Dieses Verfahren wird von Dr. Hong Jing demonstriert. Ein leitender Wissenschaftler in meinem Labor: Für dieses Protokoll steht eine Person oder ein Versuchstier für eine Blutentnahme für Versuchstiere zur Verfügung, deren Gewebe ebenfalls untersucht werden.

Sammeln Sie zunächst Vollblut, indem Sie eine 25-Gauge-Nadel in die untere Hohlvene einführen. Sobald 500 bis 1000 Mikroliter entnommen wurden, perfundieren Sie das Tier frei von verbleibendem Blut, indem Sie physiologischen Puffer durch die Spitze des linken Ventrikels infundieren und einen vollständigen Blutersatz ermöglichen, da Blut und Puffer durch das untere Venen-CVA austreten. Venöses Blut sollte unmittelbar nach der Entnahme in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen entnommen werden, die NEM und EDTA enthalten.

Schleudern Sie das Blut nach der Zentrifugation sieben Minuten lang bei 14.300 RCF herunter. Saugen Sie das Plasma mit einer Pipette aus dem RBC-Pellet ab und übertragen Sie es in ein separates Röhrchen. Bereiten Sie die isolierten Plasmaproben für die HPLC vor, indem Sie zunächst ein Eins-zu-Eins-Volumen kaltes Methanol zu 50 Mikrolitern der Plasmasammlung hinzufügen.

Vortexen Sie, die Mischung drei bis fünf Sekunden lang kräftig, bis sie trüb ist. Dann zentrifugieren Sie die Mischung bei 14.300 RCF für sieben Minuten. Um die Plasmaproteine auszufällen, sammelt man das Supernat in ein separates 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagert es bei vier Grad Celsius, bis es analysiert werden kann.

Um das Plasma für die Chemilumineszenzanalyse vorzubereiten, wird das verbleibende Plasmavolumen, das etwa 200 bis 400 Mikroliter betragen sollte, in zwei Volumina aufgeteilt. Bereiten Sie die Hälfte des Plasmas vor, indem Sie ein Volumen von 10 % 5 % angesäuertem Sulfid hinzufügen und 10 Minuten warten. Diese Probe ist nun bereit für die CLD-Analyse.

Bereiten Sie eine andere Hälfte des Plasmas vor, indem Sie nach fünf Minuten 10 % Volumen 2 % Quecksilberchlorid hinzufügen. Bei Raumtemperatur 10 Vol.-% angesäuertes Sulfonamid hinzufügen. Warten Sie weitere 10 Minuten und injizieren Sie diese Probe wie das Plasma in die CLD.

Das Erythrozyten-Pellet kann für beide Analysen für die HPLC und CLD vorbereitet werden. Beginnen Sie damit, einen Teil Zellpellet mit vier Teilen hypotoner Lyselösung zu mischen. Wirbeln Sie die Mischung gründlich für die CLD-Analyse auf.

Die Vorbereitung für die Zellen ist die gleiche wie für Plasma. Beginnen Sie mit der Zugabe eines gleichen Volumens Methanol. Dann wirbeln Sie die Mischung drei bis fünf Sekunden lang kräftig und anschließend sieben Minuten lang bei 14.300 RCF.

Pipettieren Sie nun den Überstand ab und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, bis er per HPLC analysiert werden kann, um die Gewebespiegel von Stickstoffmonoxid-Metaboliten zu bestimmen. Bei Geweben von Interesse aus Versuchstieren sollte zuerst das Blut entnommen und aufbereitet werden, wie im vorherigen Abschnitt beschrieben, die Entnahme des Gewebes sollte wie üblich erfolgen, wobei besonderes Augenmerk auf Geschwindigkeit und Effizienz gelegt werden sollte, damit das Gewebe nicht hypoxisch wird. Nach der Entnahme werden die Gewebeproben in einem Verhältnis von eins zu fünf von N-E-M-E-D-T-A, das PBS enthält, homogenisiert.

Bereiten Sie dann das homogenisierte Gewebe für die HPLC- und CLD-Analyse vor, wie in den vorherigen Abschnitten für Erythrozyten beschrieben. Nachdem Sie eine erwachsene Maus mit Dathylether betäubt und bestätigt haben, dass sie nicht auf ein Zehenklemmen anspricht, führen Sie eine Thorakotomie durch. Ein Mittellinienschnitt wird vom Brustbein bis zum Schambereich vorgenommen, um die Brust- und Bauchhöhle freizulegen.

Als nächstes perfundieren Sie das Tier mit sauerstoffreichem Krebs Alite Puffer. Verwenden Sie eine 25-Gauge-Spritze, um den Puffer in die Spitze des linken Ventrikels zu injizieren. Mit dem rechten Vorhof wird der Vorhof aufgeschnitten, um einen Austritt für das Blut zu ermöglichen.

Isolieren Sie nach der Perfusion die Bauchaorta, indem Sie die Leber, die Lunge und andere Gewebe, die die Aorta bedecken könnten, wegschneiden und entfernen. Halten Sie dann das Herz mit einer Pinzette fest und schneiden Sie die Aorta auf sanfte Weise von der hinteren Wand des Tieres ab. Legen Sie das Herz und die Aorta in eine mit Eis gefüllte Petrischale.

Erkältungspuffer in der Schüssel. Schneiden Sie das Fett und die Adventitia vorsichtig ab und reinigen Sie die Aorta. Vermeiden Sie es, das Endothel im Inneren des Gefäßes während der Reinigung zu beschädigen.

Halten Sie den Stoffwechsel der Aorten langsam, um Hypoxie zu verhindern, indem Sie ihn alle fünf Minuten in frischen, eiskalten, sauerstoffhaltigen Puffer übertragen. Schneide nun mit einem Skalpell die Aorta in drei Millimeter lange ringförmige Segmente. Übertragen Sie die Segmente in ein vierkanaliges 10-Milliliter-Gewebeorganbad, das mit sauerstoffreichem Krebspuffer beladen ist.

Üben Sie mit dem Wandlerknopf eine Vorspannung von 1,5 Gramm auf jeden Aortenring auf. Nach empirischen Befunden. 1,5 Gramm ist die geeignete Startspannung für eine optimale vasomotorische Funktion.

Überwachen und zeichnen Sie die Kraftmessung mit einer achtkanaligen Oktalbrücke und einer Datenerfassungssoftware mit der Maus auf, lassen Sie die Ringe 80 Minuten lang äquilibrieren, wechseln Sie den Puffer alle 20 Minuten und fahren Sie dann mit dem Experimentieren fort. Nachdem sich die Gewebespannung ausgeglichen hat, fügen Sie jedem Ring 100 nanomolare Fenchelrine hinzu, um eine submaximale Kontraktion zu erzielen. Sobald sich die Ringspannung stabilisiert hat und ein konstanter Tonus vorhanden ist, führen Sie eine Dosis-Wirkungs-Analyse mit einem Endotheldagonisten wie Acetylcholin durch.

Dies bestimmt die Stickoxidproduktion und den Grad der Gefäßentspannung. Nach dem Dosisverhalten auf Acetylcholin spülen Sie die Bäder mit Krebspuffer und fügen Sie 100 nanomolare Fenchelrine zu jedem Organbad hinzu, um die Gefäße zusammenzuziehen. Bestimmen Sie dann erneut die Reaktionsfähigkeit der glatten Muskelringe auf eine exogene Quelle von Stickstoffmonoxid wie Natriumnitropress-Seite mit und ohne ODQ, einen Inhibitor der löslichen Guile-Cyclase.

Diese Art von Ansatz bestimmt einen Entspannungswert von 100 % für die Gefäße und zeigt auch die essentielle Natur der löslichen Guilecyclase bei der Vermittlung der Stickoxidreaktion auf die Gefäßentspannung. Da ODQ die Entspannung zu Natriumnitro IDE als Reaktion auf Acetylcholin verhindert, entspannten sich die Aortenringe aus gesunder Kontrolle, während die Aortenringe von Mäusen mit endothelialer Dysfunktion aufgrund einer Verringerung der Stickoxidproduktion eine verringerte Entspannung zeigten. Gruppenspezifische Denitrosierungsassays wurden auch an den Kontrolltieren durchgeführt: Chemilumineszenz von Nitrit.

RSNO und RNNO wurden mit Hilfe eines reduktiven de Nitros-Assays nachgewiesen. Durch Subtraktion der Peakbereiche wurden die Nitrit- und r-Sno-Gehalte gemessen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Stickstoffmonoxid- und Gefäßbiologie zu beantworten, z. B. wie die zirkulierenden Spiegel dieser Stickstoffmonoxid-Metaboliten die Gewebespiegel widerspiegeln und wie sich Krankheitsmetaboliten bei verschiedenen Krankheitszuständen verändern?

Die Bestimmung der Steady-State-Konzentrationen und der Halbwertszeit dieser relevanten Stickoxid-Metaboliten in mehreren Organsystemen und während der gesamten Zirkulation eines einzelnen Tieres wird die Identifizierung spezifischer molekularer Signaturen von Krankheitsprozessen ermöglichen und uns helfen, neue Stickoxid-basierte Behandlungsmodalitäten zu definieren, die es dem Arzt ermöglichen, mit besseren Biomarkern für die Schwere oder das Fortschreiten der Erkrankung ausgestattet zu sein. Im Allgemeinen werden Personen, die neu im Salpetersäurebereich sind, Schwierigkeiten haben, da viele empfindlich genug sind, um diese niedrigen Konzentrationen des Trigsäurestoffwechsels, die in biologischen Proben gefunden werden, zu erkennen und zu quantifizieren. Zunächst einmal wird eine Nicht-Fähigkeit in der Kunst wahrscheinlich Artefakte während der Probenverarbeitung erzeugen, die fehlerhafte Daten und eine Fehlinterpretation der Daten erfordern.