Name: Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Stickoxid-Metaboliten in biologischen Proben präzise nachweisen können. Diese Methode umfasst die sofortige Verarbeitung von Blutproben, schnelle Gewebegewinnung und biochemische Assays zur Quantifizierung von Nitrat, Nitrit und Nitrothiolen.

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Die Autoren bedanken sich bei Hong Jiang, Ph.D. danke und Deepa Parathasarthy, MPH, BDS für die technische Unterstützung.

1. Entnahme von Vollblut <ol><li> Sammle venöse Blut vom Menschen oder von Versuchstieren in NEM / EDTA-Röhrchen enthält. </li><li> Unmittelbar Spin-Down Blut in einer Tischzentrifuge bei 14.300 RCF (relative Zentrifugalkraft) für 7 Minuten zu Plasma-und Erythrozyten-Pellet herzustellen. </li><li> Planen Plasmaproben für Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) und Chemilumineszenzdetektion (CLD)-Analyse. HPLC: Hinzufügen 01.01 Volumen an kaltem Methanol Plasma, Wirbel und Zentrifuge bei 13.200 rpm für 10 Minuten ausgefällt Plasmaproteine. Sammle Überstand zur HPLC-Analyse. CLD: Aliquot einer Probe und vorinkubiert mit Sulfanilamid und Quecksilberchlorid gezielt Assay Nitrosothiole. </li><li> Bereiten rot Zellpellet für die HPLC-und CLD-Analyse. HPLC: Hinzufügen 01.04 roten Zellpellet einer hypotonischen Lyse-Lösung, enthaltend 10 mM NEM, 2,5 mM EDTA und 10 mM Ferricyanid. Vortex gründlich und fügen Sie dann 1:1 Methanol, Wirbel und CENTRIFuge bei 13.200 rpm für 10 Minuten bis ausgefällte Protein. Sammle Überstand zur HPLC-Analyse. CLD. In 1.04 roten Zellpellet einer hypotonischen Lyse-Lösung, enthaltend 10 mM EDTA, 2,5 mM EDTA und 10 mM Ferricyanid. Aliquotproben in Röhrchen mit Sulfanilamid und Quecksilberchlorid zum spezifischen Nachweis von Nitrosothiole. </li></ol> 2. Tissue Gewinnung und Aufbereitung <ol><li> Um Gewebe Ebenen keine Metaboliten zu bestimmen, ist es zunächst notwendig, Blut frei Gewebe für die Probenvorbereitung ernten wie oben beschrieben. Ein Vollblut Austausch wird durch Infusion physiologischen Puffer durch die Spitze des linken Ventrikels zu nehmen. Sobald alle Blut entfernt wird, kann Geweben von Interesse dann geerntet werden. </li><li> Homogenisieren von Gewebeproben und Proben vorbereiten, wie oben für HPLC-und CLD-Analyse beschrieben. </li></ol> 3. Aortenringen Isolierung für die endotheliale Funktion Tissue Organbad <ol><li> Mäuse werden Anesthetized mit Diethylether, bis nicht mehr ansprechbar Quetschung Fuß, um, und unterliegen Genickbruch vor der Operation. Eine Thorakotomie durchgeführt wird, um Brust-und Bauchaorta aussetzen. Eine 25-Gauge-Spritze in der Spitze des linken Ventrikels eingesetzt und frei von Blut perfundiert mit Sauerstoff angereicherten Krebs-Henseleit-Puffer. </li><li> Der rechte Vorhof wird geschnitten, um einen Ausgang für Blut bereitzustellen. Bauchaorta wird ausgebaut und gereinigt werden der Adventitia. </li><li> Ringe werden in 2 mm lange Segmente geschnitten werden und auf einem Vier-Kanal-Gewebe Organbad (DMT 720MO, AD Instruments) in einem physiologischen Puffer-Lösung getaucht. </li><li> Schiff Ringe werden in 10-ml-Organbäder mit Sauerstoff angereicherten Krebs-Puffer (95% O 2 und 5% CO 2) bei 37 ° C gehalten Ein Gramm Vorspannung wird auf jedem Aorten-Ring (geeigneter Ausgangspunkt für eine optimale Spannung vasomotorischen Funktion wie in den vorangegangenen Experimenten bestimmt) platziert. Ein Acht-Kanal-Brücke oktal (Powerlab) und Datenerfassungs-Software (Chart Version 5.2.2) einwieder verwendet, um alle Kraftmessungen aufzuzeichnen. </li><li> Ringe dürfen für 80 Minuten mit dem Puffer in jedem Organbad verändert alle 20 min ins Gleichgewicht. Nach Äquilibrierung für 80 min, 1 uM wird Phenylephrin auf jedem Ring für submaximalen Kontraktion aufgenommen. </li><li> Nach der Stabilisierung wird endotheliale Agonisten, wie Acetylcholin hinzugefügt, um die NO-Produktion und der Grad der Entspannung Schiffes zu bestimmen. Nach der Dosis auf Acetylcholin wird Bäder gespült und recontracted werden und dann mit einer exogenen Quelle von Stickstoffmonoxid, Natriumnitroprussid, um die Reaktionsfähigkeit der glatten Muskulatur zu bestimmen und einen Wert für 100% Entspannung zu erhalten. </li><li> NO-Fänger können zugesetzt werden, um deutlich veranschaulichen Freisetzung von NO und Hemmung des Schiffes Entspannung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Nutzung der ENO-20 engagierten HPLC bietet eine einfach zu hohen Durchsatz Methode zur spezifischen und sensitiven Nachweis von Nitrit und Nitrat im Einsatzbiologischen Matrices. Das Prinzip der Detektion und einem ursprünglichen Chromatogramm ist in 1 gezeigt. Dieses Verfahren kann für jeden biologischen Probe zur Bestimmung von Nitrit und Nitrat verwendet werden. CLD basierte Erkennung von NO-Metaboliten erfordert eine chemische Derivatisierung Schritt, um die molekulare Ursache des NO zu bestimmen. Der experimentelle Aufbau zur gleichzeitigen denitrosation oxidativen und reduktiven denitrosation für die Chemilumineszenz-Detektor ist in Abbildung 2 dargestellt. Das Reaktionsgefäß wird auf der rechten Seite mit 800 mM Ferricyanid in PBS pH 7,4 gefüllt und das Reaktionsgefäß auf der linken Seite mit Kaliumiodid / Iod Mischung in Essigsäure zur Reduktion denitrosation (2A) gefüllt ist. Der gesamte Aufbau ist in 2B gezeigt. Abbildung 3 zeigt, gruppenspezifische denitrosation Assays, die Detektion und Quantifizierung von Nitrit kann, Nitrosothiole, Nitrosamine sowie Nitrosyl-Häm-Produkte. Diese Methode wurde zuvor beschrie warenBett und validiert 4,5. Diese wichtige biochemische Analysen können leicht mit funktionellen Untersuchungen an isolierten Aortenringen korreliert werden, um festzustellen, endotheliale NO-Produktion bei Versuchstieren. Diese klassischen pharmakologischen Experiment lässt sich einfach und exakt zu bewerten endotheliale NO-Funktion und Produktion. Messgefäss Reaktivität auf endotheliale Agonisten wie Acetylcholin direkt bestimmen endothelialen NO-Produktion, die dann mit biochemischen Biomarkern in Blut und Gewebe der Versuchstiere festgestellt korreliert werden können. Eine typische Darstellung einer Dosis-Wirkungs-zu Acetylcholin wird in Abbildung 4 dargestellt. Gesunde Kontroll-Mäusen mit normaler Endothelfunktion auf Acetylcholin reagieren, indem sie entspannend. Mäuse, die mit einer endothelialen Dysfunktion (Hypercholesterinämie Mäuse) zeigen reduzierte Entspannung aufgrund der reduzierten NO-Produktion auf den gleichen Reiz. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig1.jpg" /> FeigeAbbildung 1. Prinzip der Erfassung von Nitrit und Nitrat durch ENO-20 und Probenchromatogramm. (Nach oben) Schematische Darstellung des ENO-20 zum Nachweis von Nitrit und Nitrat. (Unten) Standard chromotogram von 10 pmol Nitrit und Nitrat in ENO-20 (100 ul von 100 nM Lösung von Nitrit und Nitrat) injiziert. Empfindlichkeit von 1 nm für jedes Anion mit 100 pl Injektionsvolumen. Keine Interferenz mit Protein oder farbige Spezies. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig2.jpg" /> Abbildung 2. CLD Versuchsaufbau sowohl mit oxidativem denitrosation von Ferricyanid und reduktive denitrosation mit Jodid / Jod-Assay mit Gasphase Nachweis von Stickstoffmonoxid Gas gespült. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig3.jpg" /> Abbildung 3. (Feld A) Chemilumineszenz Detektion von Nitrit, RSNO, RNNO in reduktiven denitrosation Probe Assay durch Vorinkubation mit spezifischen Gruppe ChemicReagenzien al. Subtraktion von Peakflächen erlauben Nachweis von Nitrit und RSNOs. (Feld B) Chemilumineszenzdetektion von Nitrosylchlorid Häm-Spezies mit oxidativen denitrosation Lösung von Ferricyanid. Diese Methode ist spezifisch für die NO-Häm-Produkte mit keine Kreuzreaktion mit RSNOs (GSNO oder SNO-Albumin), oder RNNO (NO-Pyrrolidin und N-Nitroso-Albumin). <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3722/3722fig4.jpg" /> Abbildung 4. Ex vivo Organbad an isolierten Aorten-Ringen liefert ein direktes Maß der endothelialen NO-Produktion, die dann mit biochemischen Biomarkern mittels HPLC und CLD detektiert korreliert werden können. Diese Abbildung zeigt reduziert Entspannung bei Mäusen mit einer endothelialen Dysfunktion aufgrund einer verminderten NO-Produktion.

<ol><li>Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+metabolism+and+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide metabolism and breakdown.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).</li>
<li>Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+obligatory+role+of+endothelial+cells+in+the+relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+acetycholine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine.</a> Nature. 288, 373-376 (1980).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+relaxing+factor+produced+and+released+from+artery+and+vein+is+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide.</a> Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).</li>
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<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die hier beschriebenen Methoden zur Quantifizierung der relevanten Metaboliten NO in mehreren biologischen Fächern wird für Fingerabdruck des NO Biologie in Gesundheit und Krankheit, die mit funktionellen Messungen von NO durch das Endothel korreliert werden können. Diese Methoden erfordern einfache Probenvorbereitung mit Potenzial für die Anpassung für hohen Durchsatz. Die relative Menge dieser Moleküle kann helfen, die Produktion von NO und seinen Stoffwechsel in einer Reihe von experimentellen Modellen von Krankheit ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> N-Ethylmaleimid </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23030 </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E7889 </td></tr><tr><td> Kaliumferricyanid </td><td> Fluka </td><td> 60299 </td></tr><tr><td> HPLC </td><td> EICOM Corp </td><td> ENO-20 </td></tr><tr><td> Autosampler </td><td> Alcott </td><td></td></tr><tr><td> DMT Myographions </td><td> AD Instruments </td><td></td></tr><tr><td> PowerLab </td><td> AD Instruments </td><td></td></tr><tr><td> Chemolumineszenz </td><td> EcoPhysics </td><td> CLD 88Y </td></tr><tr><td> Zentrifugieren </td><td> Eppendorf </td><td> 5415D </td></tr><tr><td> Acetylcholin </td><td> Sigma-Aldrich</td><td> A6625 </td></tr><tr><td> R-(-) Phenylephrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P6126 </td></tr></tbody></table>

analytische verfahren zur bestimmung von stickoxid bioaktivität

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein zweiatomigen freien Radikalen, die extrem kurz in biologischen Systemen (weniger als 1 Sekunde im zirkulierenden Blut) 1 gelebt wird. NO kann als eines der wichtigsten Signalmoleküle in unserem Körper produziert werden, regulieren essentielle Funktionen einschließlich, aber nicht um Regulierung des Blutdrucks, Immunantwort und neuronalen Kommunikation begrenzt. Daher seine genaue Detektion und Quantifizierung in biologischen Matrices ist entscheidend für das Verständnis der Rolle von NO in Gesundheit und Krankheit. Mit einer solch kurzen physiologischen Halbwertszeit von NO, alternative Strategien für die Detektion von Umsetzungsprodukten von NO Biochemie entwickelt. Die Quantifizierung der relevanten Metaboliten NO in mehreren biologischen Fächer liefert wertvolle Informationen im Hinblick auf in-vivo-NO-Produktion, Bioverfügbarkeit und Metabolismus. Einfach Probenahme aus einer einzigen Fach wie Blut oder Plasma kann nicht immer eine genaue Beurteilung der gesamten boDy keinen Status, vor allem in Geweben. Die Möglichkeit, Blut mit ausgewählten Geweben bei Versuchstieren zu vergleichen, wird dazu beitragen, die Lücke zwischen Grundlagenforschung und klinischer Medizin so weit wie diagnostischer und prognostischer Nutzen von NO-Biomarkern in Gesundheit und Krankheit. Daher ist die Extrapolation von Plasma oder Blut ohne Status zu spezifischen Geweben von Interesse nicht mehr ein gültiger Ansatz. Als Ergebnis weiterhin Methoden entwickelt und validiert werden, die es erlauben den Nachweis und die Quantifizierung von NO und NO-und Genussmittel / Metaboliten in mehreren Fächern von Versuchstieren in vivo. Die etablierten Paradigma der NO-Produktion durch die Biochemie von NO-Synthasen, um die Aktivierung der löslichen Guanylatzyklase (sGC), um eventuelle Oxidation zu Nitrit (NO 2 -) und Nitrat (NO 3 -) kann nur einen Teil der NO-Effekten in vivo. Die Wechselwirkung von NO und NO-abgeleiteten Metaboliten mit Thiolen, sekundären Aminen, und Metalle S-nitrosothi bildenole (RSNOs), N-Nitrosamine (RNNOs) und Nitrosyl-Häm jeweils für cGMP-unabhängige Effekte von NO und sind wahrscheinlich genauso wichtig wie physiologisch Aktivierung der sGC durch NO. Ein wahres Verständnis von NO in der Physiologie von in vivo Experimenten Probenahme mehrere Fächer gleichzeitig abgeleitet. Stickstoffmonoxid (NO)-Methodik ist eine komplexe und oft verwirrenden und Wissenschaft im Mittelpunkt vieler Debatten und Diskussionen über NO Biochemie. Die Aufklärung neuer Mechanismen und Signalwege unter Beteiligung keine Scharniere auf unserer Fähigkeit, spezifisch, selektiv und sensitiv detektieren und zu quantifizieren NO und NO alle relevanten Produkte und Metaboliten in komplexen biologischen Matrices. Hier präsentieren wir eine Methode für die schnelle und hochempfindliche Analyse von Nitrit und Nitrat mittels HPLC sowie Nachweis von freiem NO in biologischen Proben mittels in vitro Ozon basierende Chemilumineszenz mit chemischen derivitazation auf molekularer Quelle von NO als auch ex vivo mit bestimmenOrganbad Myographie.

Die endogene Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) reguliert eine Vielzahl von biologischen Funktionen. Es wird zunehmend klar, dass Störungen oder Fehlregulation der NO-basierter Signalisierung in vielen menschlichen Krankheiten beteiligt ist. Methoden zur Quantifizierung relevanter keine Metaboliten können neue diagnostische oder prognostische Biomarker für Erkrankungen des Menschen bieten.

Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein zweiatomiges freies Radikal, das in biologischen Systemen eine extrem kurze Lebensdauer hat (weniger als 1 Sekunde im zirkulierenden Blut)1. NO kann ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zu demonstrieren, wie Nitric-Oxid-Metaboliten in biologischen Proben genau und spezifisch nachgewiesen werden können. Dies wird erreicht, indem Blutproben unmittelbar nach der Entnahme bearbeitet werden, um einen Verlust von Metaboliten oder die Bildung von Artefakten zu verhindern. Gleichzeitig wird eine schnelle und effiziente Gewebeentnahme durchgeführt, um die Auswirkungen einer hypoxischen Umgebung auf Nitric-Oxid-Metaboliten zu minimieren.Aortaringe werden entnommen und in ein Organbad gehängt, um ihre endotheliale Funktion zu bewerten. Außerdem werden biochemische Assays verwendet, um die Nitratkonzentrationen, Nitritkonzentrationen sowie die relativen Konzentrationen von Nitrothiolen und anderen nitrierten Produkten im Gewebe zu quantifizieren. Mithilfe dieser Assays lässt sich ein aussagekräftiger Vergleich zwischen Versuchs- und Kontrolltieren durchführen, der wertvolle Informationen über die Produktion und den Stoffwechsel von Stickstoffmonoxid liefert.Der Hauptvorteil der Anwendung dieses multimodalen Ansatzes im Vergleich zu einzelnen Methoden oder Assays liegt darin, dass er ein umfassenderes Bild der Stickstoffmonoxid-Biochemie in mehreren Organsystemen ermöglicht. So können wir verstehen, welche dieser Metaboliten eine prognostische oder diagnostische Relevanz besitzen und wie das Spektrum der Stickstoffmonoxid-Metaboliten die endotheliale Bildung und Verfügbarkeit von Stickstoffmonoxid widerspiegelt. Die visuelle Darstellung dieser Methode ist entscheidend, da jeder Schritt im Verfahren für die Erhaltung der Probenechtheit von großer Bedeutung ist.Einige dieser Schritte sind aus der Lektüre des Methodenteils typischer Fachzeitschriften nicht ersichtlich, da sie sehr detaillierte Angaben zur Probenentnahme und Gewebeextraktion enthalten. Diese Prozedur wird Dr. Hong Jing demonstrieren, eine leitende Wissenschaftlerin in meinem Labor. Für diesen Protokollablauf muss eine Person oder ein Versuchstier für die Blutentnahme zur Verfügung stehen; bei Versuchstieren werden zudem deren Gewebe untersucht.Zunächst wird Vollblut durch Einführen einer 25-Gauge-Nadel in die untere Hohlvene gewonnen. Sobald 500 bis 1000 Mikroliter gesammelt wurden, wird das Tier durch Spülung mit physiologischem Puffer über die Spitze des linken Ventrikels von verbleibendem Blut befreit, wobei eine vollständige Blutersetzung erfolgt, während Blut und Puffer über die untere Hohlvene austraten. Das venöse Blut ist unmittelbar nach der Entnahme in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit NEM und EDTA zu sammeln.Zentrifugieren Sie das Blut bei 14.300 RCF für sieben Minuten. Entfernen Sie das Plasma mit einer Pipette vom Erythrozyten-Pellet und überführen Sie es in ein separates Gefäß. Bereiten Sie die isolierten Plasma-Proben für die HPLC vor, indem Sie zuerst 50 Mikroliter der Plasmaprobe ein gleichen Volumen kaltes Methanol hinzufügen.Vortexen Sie die Mischung kräftig für drei bis fünf Sekunden, bis sie trüb wird. Zentrifugieren Sie die Mischung anschließend bei 14.300 RCF für sieben Minuten. Um die Plasmaproteine auszufällen, sammeln Sie den Überstand in einem separaten 1,5-Milliliter-Röhrchen und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, bis er analysiert werden kann.Um das Plasma für die Chemilumineszenzanalyse vorzubereiten, nehmen Sie das verbleibende Plasma, das etwa 200 bis 400 Mikroliter betragen sollte, und teilen es in zwei Volumina auf. Bereiten Sie die eine Hälfte des Plasmas vor, indem Sie ein 10%-Volumen an 5%iger angesäuerter Sulfidlösung hinzufügen und 10 Minuten warten. Diese Probe ist nun bereit für die CLD-Analyse.Bereiten Sie die andere Hälfte des Plasmas vor, indem Sie nach fünf Minuten 10 % des Volumens von 2 % Quecksilber(II)-chlorid hinzufügen. Geben Sie bei Raumtemperatur 10 % des Volumens an angesäuertem Sulfonamid hinzu. Warten Sie weitere 10 Minuten und injizieren Sie diese Probe wie das Plasma in das CLD.Das Erythrozyten-Pellet kann für die HPLC und die CLD für eine der beiden Analysen vorbereitet werden. Geben Sie zunächst ein Teil Zellpellet zu vier Teilen hypotoner Lyse-Lösung. Vortexen Sie die Mischung gründlich für die CLD-Analyse.Die Vorbereitung der Zellen erfolgt genauso wie für Plasma. Geben Sie zunächst eine gleiche Menge Methanol hinzu. Vortexen Sie dann das Gemisch kräftig für drei bis fünf Sekunden und zentrifugieren Sie es anschließend sieben Minuten bei 14.300 RCF.Pipettieren Sie nun den Überstand ab und lagern Sie ihn bei vier Grad Celsius, bis er mittels HPLC analysiert werden kann, um die Gewebegehalte an Metaboliten von Stickstoffmonoxid zu bestimmen. Bei den interessierenden Geweben von Versuchstieren sollte zunächst das Blut gemäß dem vorherigen Abschnitt geerntet und vorbereitet werden; die Gewebeentnahme sollte anschließend wie üblich erfolgen, wobei besonderes Augenmerk auf Schnelligkeit und Effizienz gelegt werden muss, damit die Gewebe nicht hypoxisch werden. Nach der Sammlung werden die Gewebeproben im Verhältnis 1:5 in PBS mit N-E-M-E-D-T-A homogenisiert.Bereiten Sie anschließend die homogenisierten Gewebe für die HPLC- und CLD-Analyse wie in den vorherigen Abschnitten für Erythrozyten beschrieben vor. Betäuben Sie eine erwachsene Maus mit Dathyläther und überprüfen Sie, dass sie nicht auf einen Zehenquetschtest reagiert, führen Sie dann eine Thorakotomie durch. Ein medianer Einschnitt wird vom Sternum bis zur Schambeinregion vorgenommen, um die Brust- und Bauchhöhle freizulegen.Als Nächstes perfundieren Sie das Tier mit oxygeniertem Krebs-Alite-Puffer. Injizieren Sie den Puffer mit einer 25-Gauge-Spritze in die Spitze des linken Ventrikels. Der rechte Vorhof wird dabei geöffnet, um dem Blut einen Austritt zu ermöglichen.Nach der Perfusion die Bauchaorta isolieren, indem Leber, Lunge und andere Gewebe, die die Aorta bedecken könnten, abgeschnitten und entfernt werden. Danach das Herz mit einer Pinzette festhalten und die Aorta vorsichtig von der Hinterwand des Tieres ablösen. Herz und Aorta in eine mit Eis gefüllte Petrischale legen.Kaltes Krebs-Puffer in der Petrischale. Vorsichtig das Fett- und Adventitiagewebe von der Aorta abschneiden und reinigen. Während der Reinigung darauf achten, das Endothel im Inneren des Gefäßes nicht zu beschädigen.Halten Sie den Stoffwechsel der Aorta langsam, um Hypoxie zu verhindern, indem Sie sie alle fünf Minuten in frischen, eiskalten, mit Sauerstoff angereicherten Puffer überführen. Schneiden Sie die Aorta nun mit einem Skalpell in ringförmige Segmente von drei Millimeter Länge. Überführen Sie die Segmente in ein vierkanaliges 10-Milliliter-Gewebeorganbad, das mit mit Sauerstoff angereichertem Krebs-Puffer gefüllt ist.Unter Verwendung des Transducer-Knopfs 1,5 Gramm Vorspannung auf jeden Aortenring aufbringen. Gemäß empirischen Befunden ist 1,5 Gramm die geeignete Ausgangsspannung für eine optimale vasomotorische Funktion.Überwachen und erfassen Sie am Mauspräparat die Kraftmessung mithilfe einer achtkanaligen Octal-Brücke und einer Datenerfassungssoftware, lassen Sie die Ringe 80 Minuten lang equilibrieren, wobei Sie die Pufferlösung alle 20 Minuten wechseln, und führen Sie anschließend die Experimente durch. Nachdem die Gewebespannung equilibriert ist, geben Sie 100 Nanomolar Fennelrin zu jedem Ring, um eine submaximale Kontraktion zu erzielen. Sobald die Ringspannung stabil ist und ein gleichmäßiger Tonus vorliegt, führen Sie eine Dosis-Wirkungs-Analyse mit einem endothelialen Agonisten wie Acetylcholin durch.Dies dient der Bestimmung der Stickoxidproduktion und des Ausmaßes der Gefäßrelaxation. Nach der Dosis-Wirkungs-Kurve auf Acetylcholin spülen Sie die Badgefäße mit Krebs-Puffer und geben 100 Nanomolar Fencholin je Organbad hinzu, um die Gefäße zu kontrahieren. Bestimmen Sie anschließend erneut die Empfindlichkeit der glatten Muskelringe gegenüber einer exogenen Stickoxidquelle wie Natriumnitroprussid, jeweils mit und ohne ODQ, einem Inhibitor der löslichen Guanylatcyclase.Diese Art der Versuchsdurchführung bestimmt einen 100 %igen Relaxationswert für die Gefäße und zeigt zudem die entscheidende Bedeutung der löslichen Guanylatcyclase bei der Vermittlung der Reaktion auf vasodilatierendes Stickoxidoxid auf. Da ODQ die Relaxation durch Natriumnitroprussid in Reaktion auf Acetylcholin verhindert, relaxierten Aortenringe von gesunden Kontrollmäusen, während Aortenringe von Mäusen mit endothelialer Dysfunktion eine verminderte Relaxation zeigten, bedingt durch eine reduzierte Produktion von Stickoxid. Gruppenspezifische Denitrosierungsassays wurden ebenfalls an Kontrolltieren mittels Chemilumineszenz von Nitrit durchgeführt.RSNO und RNNO wurden mithilfe eines reduktiven Denitrosierungs-Assays nachgewiesen. Durch Subtraktion der Peakflächen wurden Nitrit- und rSNO-Spiegel gemessen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Stickstoffmonoxid und vaskuläre Biologie zu beantworten, beispielsweise wie die zirkulierenden Spiegel dieser Stickstoffmonoxid-Metaboliten die Gewebespiegel widerspiegeln und wie sich Metaboliten bei verschiedenen Krankheitszuständen verändern.Die Bestimmung der Gleichgewichtskonzentrationen und der Halbwertszeiten dieser relevanten Stickstoffmonoxid-Metaboliten in mehreren Organsystemen sowie im gesamten Kreislauf eines einzelnen Tieres ermöglicht die Identifizierung spezifischer molekularer Krankheitsmarker und hilft uns, neue auf Stickstoffmonoxid basierende Behandlungsmodalitäten zu definieren, wodurch der behandelnde Arzt mit besseren Biomarkern für Schweregrad oder Progression von Erkrankungen ausgestattet werden kann. Im Allgemeinen haben Personen, die neu im Bereich der Salpetersäure sind, Schwierigkeiten, da viele Methoden nicht empfindlich genug sind, um diese geringen Konzentrationen an Salpetersäure-Metaboliten in biologischen Proben nachzuweisen und zu quantifizieren. Vor allem können unsachgemäße Handhabungstechniken während der Probenvorbereitung Artefakte erzeugen, die zu fehlerhaften Daten und einer falschen Interpretation der Ergebnisse führen.

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Forschung

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Medicine

Medizin

Die Spiegel des inflammatorischen zellulären Signalmoleküls Stickstoffmonoxid (NO) werden üblicherweise mit dem Griess-Reagenz gemessen. In diesem Protokoll haben wir einen modifizierten Griess-Assay entwickelt, der lebendes Drosophila-Hirngewebe verwendet, um die Sekretion von NO in einer einfachen, quantifizierbaren und hochgradig wiederholbaren Methode nachzuweisen.

Neuartiger quantitativer Ganzgewebe-Assay des Stickoxid-Spiegels bei neuroinflammatorischer Reaktion von Drosophila

In diesem Artikel beschreiben wir eine angepasste relativ einfache Methode der Fluoreszenzfarbstoff Diaminofluorescein-2 - diacetat (DAF-2DA) und Dihydroethidium (DHE) für en face simultane Detektion und Visualisierung von intrazellulären Stickstoffmonoxid (NO) und Superoxid - Anion mit (O 2 .- ) jeweils in frisch intakten Aorten von einer Adipositas-Maus-Modell isoliert.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Stickstoffmonoxid (NO) ist ein wichtiges Signalmolekül in der vaskulären Homöostase. NEIN, die Produktion in vivo ist zu gering für eine direkte Messung. Die Chemilumineszenz bietet nützliche Einblicke in den NO-Zyklus durch die Messung seiner Vorläufer und Oxidationsprodukte, Nitrit und Nitrat. Die Nitrit-/Nitratbestimmung in Körpergeweben und -flüssigkeiten wird erläutert.

Mess Nitrit und Nitrat, Metabolite in der Stickoxid-Bahn, in biologischen Materialien der Chemilumineszenz-Methode unter Verwendung von

Frühere Arbeiten deuten darauf hin, dass die Stickstoffisotopenzusammensetzung von atmosphärischen Stickoxiden den Einfluss verschiedener Quellen in der Umwelt unterscheiden könnte. Wir berichten über eine automatisierte, mobile, feldbasierte Methode zur hohen Abscheideeffizienz der atmosphärischen NOx für N-Isotopenanalyse mit stündlicher Zeitauflösung.

Automatisierte, hochauflösende Mobilsammelsystem für die Stickstoffisotopenanalyse von NO<sub&gt; x</sub

Dieses Whitepaper beschreibt Stickstoffmonoxid (NO) Begasung Protokolle für postharvest Schädlingsbekämpfung. Begasung Kammern werden mit Stickstoff (N2) herstellen Frequenzverschiebungen Sauerstoffbedingungen vor Nr. gespült wird injiziert. Am Ende werden die Kammern mit N2 NO vor der Belichtung Produkte an Umgebungsluft zur Vermeidung der Exposition gegenüber Nr.2verdünnen gespült.

Verfahren der Labor-Begasung für die Schädlingsbekämpfung mit Gas Stickstoffmonoxid

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um die mögliche Verwendung von Thrombozyten als hochsensible Stickoxid-Sensor im Blut zu beheben. Es beschreibt erste Thrombozyten Vorbereitung und die Verwendung von Nitrit und sauerstoffarmes Blut Erythrozyten als Stickoxid-Generatoren.

Thrombozyten-basierte Erkennung von Stickoxid im Blut durch die Messung VASP Phosphorylierung

Wir präsentieren Protokolle für drei verschiedene Methoden zur Homogenisierung von vier verschiedenen Muskelgruppen von Ratten-Skelettmuskelgewebe, um die Nitrat- und Nitritwerte zu messen und zu vergleichen. Darüber hinaus vergleichen wir verschiedene Probengewichte, um zu untersuchen, ob die Gewebeprobengröße die Ergebnisse der Homogenisierung beeinflusst.

Herstellung von Ratten-Skelettmuskelhomogenaten für Nitrat- und Nitritmessungen

Hier stellen wir Protokolle zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen biologisch relevanten Derivaten mittels Chemilumineszenz-basierter Assays mit hoher Sensitivität vor.

Chemilumineszenz-basierte Assays zum Nachweis von Stickstoffmonoxid und seinen Derivaten aus Autoxidation und nitrosierten Verbindungen

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Quantifizierung der Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) in den Apithelkulturen der Luftwege, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) differenziert sind, indem Nitrit in apikalen Sekreten mittels eines triiodidbasierten chemilumineszenzbasierten Assays gemessen wird.

Messung der Stickstoffmonoxidproduktion in Maus-Tracheal-Epithelzellkulturen, die an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche differenziert wurden

Wir beschreiben eine Technik zur Kennzeichnung und Verfolgung von Stammzellen mit FDA-Zulassung, superparamagnetische Eisenoxid (SPIO), ferumoxytol (Feraheme). Diese zellulären bildgebendes Verfahren, das Magnetresonanz-(MR)-Bildgebung nutzt zur Visualisierung, ist leicht zugänglich für die langfristige Überwachung und Diagnose von Erfolg oder Misserfolg Stammzellen engraftments bei Patienten.

Labeling Stammzellen mit Ferumoxytol, eine FDA-Zulassung Eisenoxid-Nanopartikel

Erfahren Sie, wie Sie Stickoxid-Metaboliten in biologischen Proben präzise nachweisen können. Diese Methode umfasst die sofortige Verarbeitung von Blutproben, schnelle Gewebegewinnung und biochemische Assays zur Quantifizierung von Nitrat, Nitrit und Nitrothiolen.

Analytische Verfahren zur Bestimmung von Stickoxid Bioaktivität

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