Name: Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Lernen Sie die Quantifizierung von Mykotoxinbiosynthese und Pilzwachstum in Getreidekörnern mittels Kernel-Bioassays. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse zur Untersuchung von Samen-Pilz-Interaktionen.

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Wir möchten Brandon Hassett und Carlos Ortiz für ihre technische Unterstützung zu danken. Diese Arbeit wurde von der NSF Zuschüsse IOB-0544428, 0951272-IOS, IOS-0925561 und an Dr. Michael Kolomiets unterstützt und von der USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), Afri Pflanzenzüchtung und Bildung Grant # 2010-85117 -20539 bis Drs. Seth Murray, Thomas Isakeit, und Michael Kolomiets.

1. Maiskorn Bioassay <ol><li> Zwei Wochen vor, die Kultur pilzliche Erreger auf Kartoffeldextroseagar (PDA) bei 28 ° C </li><li> Wählen Kerne mit ähnlicher Größe und Form, vorzugsweise abgeflacht, so dass sie auf Höhe der Unterkante der Bioassay Fläschchen, und in 50 ml Falcon-Röhrchen zu legen. Kernel ausgewählt werden, müssen produziert worden sind gleichzeitig in derselben Umgebung, um ähnliche Samen Alters-und Metabolit-Zusammensetzung zu gewährleisten. </li><li> Oberfläche sterilisiert Kernel, die von Schüttelkolben bei Raumtemperatur für 5 Minuten mit 70% Ethanol, 1 Minute mit sterilem Wasser, und 10 Minuten mit 6% Natriumhypochlorit. Spülen, dreimal, jeweils 5 Minuten Zeit, mit sterilem Wasser dabei weiterhin zittern. Pat Kerne trocken auf autoklavierten Handtücher. </li><li> Um eine Infektion von Aspergillus flavus zu erleichtern, eine kleine Wunde auf den Embryo-Seite mit einer 18 G Nadel in die Tiefe von 0,5 cm. Aber nach unserer Erfahrung eine größere Wunde wird für Fusarium verticillioides Infektion benötigt. Therefore Verwenden einer Rasierklinge in den Embryo-Seite in einer Tiefe von 0,5 mm geschnitten. </li><li> Bereiten Inokulumsuspension durch Schaben kultivierten Platten in etwa 5 ml autoklavierten 0,01% Tween-20 Lösung, um Sporen zu befreien und zu entfernen Myzel durch die Schwerkraft Filterung durch mindestens 4 Schichten von autoklavierten Gaze. Berechnen Sie Sporenkonzentration mit Hämozytometer und justieren bis 10 6 Sporen / ml für A. flavus oder F. verticillioides. Bei Verwendung anderer Arten von Pathogenen oder einen Host, ist es wichtig, die Konzentration von Inokulum für geeignete Infektion zu bewerten. </li><li> Erstellen Sie eine feuchte Kammer in einem Plastikbehälter (29,2 cm x 18,7 cm x 8,3 cm) mit fünf Blatt Papier Handtücher und 100 ml sterilem Wasser gefüttert. Kammer ist nicht wasser-oder luft-und zusätzliches Wasser sollte in der gesamten Experiment zu halten feuchten Papiertüchern hinzugefügt werden. </li><li> Platz vier Kerne in einer autoklavierten 20 ml Glasszintillationsröhrchen und Aufzeichnung ihrer Masse. Impfen mit 200 ul Sporensuspension,Kappe und Wirbel gleichmäßig zu beschichten Kerne mit Federung. Lösen Sie sich frei Kappen ermöglichen den Luftaustausch und Ort in feuchten Kammer. </li></ol> Hinweis: Samen oder anderen Pilzen als die in dieser beschriebenen Verfahren, die Menge an Inokulum erforderlichen verschieden sein kann und sollte experimentell abgeleitet werden. <ol start="8"><li> Inkubieren Kernel unter einem 12-h-light/12-h-dark Photoperiode bei 28 ° C für 7 Tage oder bis die gewünschte. </li></ol> 2. Konidien Enumeration <ol><li> Nach der Infektion Zeitraum, 5 ml autoklavierten 0,01% Tween-20 in Szintillationsgefäße mit infizierten Körner und gründlich vortexen für 1 Minute. </li><li> Mit einer breit Bohrung Pipettenspitze, sofort durch die Übertragung von zwei getrennten 200 ul Aliquots Sporensuspension in 2,0 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1,8 ml 0,01% Tween-20 (oder verdünnter als je nach Infektion erforderlich) zu verdünnen. </li><li> Zählen Sie jeweils 200 ul Aliquot zweimal mit einem Hämocytometer 4und vergleichen Ebenen der Konidien zwischen den Behandlungen. </li></ol> 3. Aflatoxin Quantifizierung <ol><li> Add-Kernel von 1 Probe zu 50 ml Mixbecher mit 20 ml 80% Methanol und 0,05 g NaCl, Deckel und Mischung bei hoher Geschwindigkeit für 1 min. </li><li> Setzen Sie ein Faltenfilter über eine saubere Sammlung Gefäss auf und füllen Extrakt in Filter. </li><li> Übertragen Sie 10 ml Filtrat in ein sauberes Gefäß, mit 20 ml destilliertem H 2 O, und gut mischen. </li><li> Filter Probe durch eine 1,5 um Glas-Mikrofaser-Filter in einen sauberen Becher. </li><li> Bewerben 1 ml filtrierte Extrakt zu Afla Spalte Test und mit Hilfe von Druckluft, zwingen das gefilterte Extrakt durch die Säule mit einer Geschwindigkeit von 1-2 Tropfen / Sekunde, bis entleert. </li><li> Waschkolonne zweimal mit 1 ml destilliertem H 2 O und durchlaufen Säule bei 1-2 Tropfen / Sekunde, bis Luft kommt durch. </li><li> Eluieren Säule mit 1 ml 100% HPLC-Qualität Methanol bei einer 1-2 Tropfen / Sekunde Geschwindigkeit in einen Glasküvette gesammelt. </li><li> Hinzufügen1 ml Afla Test-Entwickler auf Eluat und gut mischen. Ort Küvette in kalibriert Fluorometer und lesen bei 60 sek. </li></ol> Hinweis: Bei Verwendung des Aflatest FGIS Protokoll, die Messung aus dem Fluorometer wird basierend auf einer anfänglichen 50 g Probe in 100 ml extrahiert berechnet. Wenn Sie die Verdünnung der Probe mit Wasser betrachten, das 1 ml aufgetragen, um eine Spalte darstellt 0,166 g Probe. Also, bei einer Änderung des Protokolls, müssen Sie berücksichtigen die Unterschiede in der Stichprobengröße und die anfängliche Extraktionslösung. Zum Beispiel werden 2 g der Samen in 20 ml 80% Methanol extrahiert. Dies ist 0,1 g / ml. Wenn 1 ml dieser Probe werden mit 2 ml Wasser gemischt wird, ist der Anteil der Probe in der Flüssigkeit nun 0,033 g / ml. Wenn in diesem Beispiel gibt einen Fluorometer Lesung von 100 ppb, wird die tatsächliche Konzentration auf den Anteil der Probe 0,166, das heißt ppb = (0,166 g X 100 ppb) / 0,1 g), oder 166 ppb bezogen. Für alternative Aflatoxin QuantifizierungKation Methoden finden Sie unter Referenz 7. 4. Fumonisin B1 (FB1) Analyse <ol><li> Wenn Pilz auf Maiskörnern angebaut wird, zu extrahieren Proben über Nacht mit 10 ml Acetonitril / Wasser (50/50, v / v) bei Raumtemperatur ohne Schütteln. Anschließend mischen den Extrakt (2 ml) mit destilliertem Wasser (6 ml), und wenden Sie diese Mischung (8 ml) direkt mit dem C-18-Festphasenextraktion. </li><li> Vor dem Einlegen der Probe, die Voraussetzung C-18 Festphasenextraktionssäule durch Spülen mit 2 ml Acetonitril von 2 ml Wasser gefolgt. </li><li> Nach dem Laden der Probe wird die Säule mit 2 ml Wasser mit 2 ml Acetonitril / Wasser (15/85, v / v) gewaschen. Probe für die HPLC-Analyse (mit FB1) mit 2 ml Acetonitril / Wasser (70/30, v / v) eluiert. </li><li> Derivatisieren FB1 mit o-Phthalaldehyd (OPA) durch Übertragung von 0,1 ml Eluat der Säule in ein Fläschchen mit 0,1 ml Boratpuffer (0,05 M Borsäure acid/0.05 M Natriumborat [50/50, V / V], pH 8,5) und 0,1 OPA ml (0,1 mg / ml in Acetonitrile mit 0,5% - Mercaptoethanol). </li><li> Die Reaktion nach 10 min durch Zugabe von 0,5 ml acetonitrile/0.01 M Borsäure (40/60, v / v). </li><li> Analysieren FB1 auf einem Shimadzu HPLC LC-20AT-System mit einer analytischen Zorbax-ODS-Säule (4,6 150 mm) und einer variablen Wellenlänge Shimatzu RF-10Axl Fluoreszenzdetektor (Anregung 335 nm / Emission 440 nm) ausgestattet. </li><li> Ein linearer Gradient verwendet wird (Lösungsmittel A: acetonitrile/0.1 M Natriumphosphat (40/60), pH 3,3, Lösungsmittel B: Acetonitril / 0,1 M Natriumphosphat (60/40), pH 3,3) und die Gradienten-Programms ist wie folgt: 100% A bis 100% B in 10 min, 100% B für 5 Minuten. </li><li> Analysieren FB1 Standards mittels HPLC und Peakfläche Messungen werden verwendet, um Standardkurve zu erstellen. Anschließend quantifizieren FB1 Ebene in einer Probe durch Vergleich Peakflächen mit FB1 Standardkurve. </li></ol> 5. Ergosterol Analyse <ol><li> Kultur der Pilz auf Maiskörner für 7-14 Tage. </li><li> Nach der Inkubationszeit, fügen Sie 10 ml Chloroform: methnol (2:1, v / v) in jedem Fläschchen. Einmal aufgenommen, schütteln Sie die Proben gut und dann inkubieren Fläschchen im Dunkeln bei Raumtemperatur für 24 Stunden. </li><li> Nach 24 Stunden, die Proben zentrifugieren und den Überstand und filtern es durch 0,45 um Nylonmembran. </li><li> Die Probe direkt in ein Shimadzu HPLC LC-20AT-System mit einem 4,6 U ODS-C18-Säule (200 A, 250 ± 4,6 mm) und einem Shimadzu SPD-20A UV / VIS Detektor eingestellt bei 282 nm-Monitor ausgestattet. </li><li> Verwendung Methanol (100%) bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,5 ml / min als mobile Phase. Bestimmen Quantifizierung von Ergosterol in Proben durch Vergleichen der Spitzenbereiche von Proben mit einer Standardkurve von HPLC-Qualität Ergosterol erzeugt. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Nach der Inokulation und die Inkubation in einer feuchten Kammer für zwei bis drei Tage, das Pilzwachstum zu beginnen, auf den Kernen zu sehen. Sieben Tage nach der Behandlung, das vegetative Wachstum auf behandelten Pflanzen sollten gut sichtbar sein, while Mock Kontrollen sollten nicht infiziert sind (Abbildung 1B, oben). Zeiträume von mehr Inkubation förderlich sind mehr reichlich vegetativen Wachstums (Abbildung 1B, unten). Unter den hier beschriebenen Bedingungen (Abbildung 2G), A. flavus Wildtyp-NRRL 3357 angezeigt Maximalwerte der Kolonisation, Aflatoxin Akkumulation, Produktion und Konidien bei 8, 6, und 8 Tage, (Abbildung 2, AC). Allerdings, wenn Mykotoxinkontamination und conidiation pro Einheit von Ergosterol verglichen wurden, wurden die größten Werte bei 4 und 6 Tage lang beobachtet, (Abbildung 2, DE). 2F fasst diese pilzliche Biomasse-abhängige maximale Wert-Beobachtungen. Interessanterweise zwischen 4-6 Tagen nach der Inokulation, unterzogen die Kerne Nukleinsäureabbaus, wie Gesamt-RNA von Proben auf den zeitlichen Verlauf (2H, unten) gesehen. Mehrere Studien, einschließlich unserer eigenen, haben ExaminEd F. verticilliodies Infektion auf Maiskörnern 2,8,9,10,11,12 und erfolgreich eingesetzt 7-13 Tage als Zeit-Punkte für Beobachtungen. Mit den hier beschriebenen Verfahren, Fumonisin liegen im Bereich von 3,500-8,000 ng / g und 4,13 Kernel Ergosterin liegen im Bereich von 5.000-10.000 ng / g Kernel 14,13. Abbildung 3 zeigt repräsentative Peaks für Fumonisin (oben) und Ergosterol (unten ) von HPLC-Chromatogrammen. Messung von Ergosterol kann auch über Absorptionsspektren 15 durchgeführt werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufschema für die Quantifizierung von pilzlichen Biomasse, Sporogenese und Mykotoxin-Produktion und repräsentative Ergebnisse für das vegetative Wachstum von Kernel-Bioassays. A) Flow-Diagramm, in der beschriebenen Methode zur Quantifizierung der grundlegenden biologischen Parameter verwendet werden, um die Pathogenität von Pilzen auf Maiskörnern zu beurteilen. B) VertreterErgebnisse für die Kernel-Bioassays. Top, A. flavus (NRRL3357) vegetatives Wachstum auf Maiskörnern in die B73 genetischen Hintergrund. Die Samen wurden mit 200 ul 10 6 Sporen / mL und Bilder aufgenommen wurden 7 Tage nach der Impfung geimpft. Unten, F. verticillioides inokulierten Körner in B73 Hintergrund 13 Tage nach der Infektion. Kerne wurden mit 200 ul 10 6 Sporen / ml inokuliert. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> Abbildung 2. Aspergillus flavus Kernel Bioassay zeitlichen Verlauf. B73 Kerne wurden mit 200 ul 10 6 Sporen / ml Aspergillus flavus Konidienaufschwemmung beimpft und für 2-8 Tage (G). (; Mittelwert ± SE n = 3-4) Alle Werte wurden aus dem Trockengewicht durchschnittlich 4 Kernel bestimmt. A) Die Kolonisation (bezogen auf Ergosterol), (B) Aflatoxin, und (C) wurden unter Verwendung conidiation oben beschriebenen Verfahren. E) und Aflatoxin (F) conidiation werden angezeigtin Abhängigkeit von pilzlicher Biomasse, wie durch h Ergosterol gemessen. F) Maximalwerte für Ergosterol, Aflatoxin Akkumulation und conidiation als Funktion der pilzlichen Biomasse - Maximalwerte für jede Menge beobachtet wurde auf 100% gesetzt. (H) 1 g pro Spur von Gesamt-RNA aus zeitlichen Verlauf. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> Abbildung 3. Vertreter High Performance Liquid Chromatographie (HPLC)-Chromatogramme für Fumonisin B1 (oben) und Ergosterol (unten) aus Kernen mit Fusarium verticillioides (M3125) infiziert isoliert.

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</ol>

<p class="jove_content"&gt; Ich habe nichts zu offenbaren.</p

<p class="jove_content"&gt; Die hier beschriebenen Methoden wurden ausgiebig getestet und bewiesen, dass bei der Erzeugung von quantifizierbare Ergebnisse für Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen robust. Darüber hinaus sollte diese Methoden für Samen von anderen Pflanzenarten, die anfällig für Verunreinigung mit mycotoxigenic Pilze (zB Erdnüsse, Weizen, Baumwolle, Pistazien, etc.). Für kompetente Pflanze-Pathogen-Interaktion analysiert, ist es unerlässlich, dass die Samen am Leben gehalten werden. Eine kleine Wunde an der ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> Kartoffeldextroseagar </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Plastic Container Inkubation </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Mixer </td><td> VICAM </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 cm Faltenfilter </td><td> VICAM </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1,5 um Glasmikrofaser </td><td> VICAM </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Afla Spalte Test </td><td> VICAM </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla Test-Entwickler </td><td> VICAM </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> VICAM </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18 Festphasenextraktionssäule (Prep September SPE C18-Säule) </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-Phthalaldehyd (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co. </td><td> 79760-5g </td></tr><tr><td> Borsäure </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Natriumborat </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Mercaptoethanol </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> Shimadzu HPLC LC-20AT (Pumpe) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax-ODS-Säule (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl Fluoreszenz-Detektor </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Natriumphosphat </td><td> Fisher Wissenschaftlicher </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 Standards </td><td> Sigma Chemical Co. </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 13 mm Spritzenfilter mit 0,45 um Nylonmembran (HPLC) </td><td> Pall Life Science </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45480-50G-F </td></tr><tr><td> Szintillationsgefäße </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Kochsalz </td><td> VICAM </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

die quantifizierung der pilzbesiedlung, sporogenese und produktion von mykotoxinen kernel-bioassays

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Die Verrottung der Körner durch Samen-Pilzresistenz stellt eine der größten wirtschaftlichen Herausforderungen zu Getreideproduktion weltweit, nicht zu ernsthaften Gefahren für die menschliche und tierische Gesundheit zu erwähnen. Unter Getreideproduktion ist Mais wohl die betroffenen Kultur, durch Pathogen-induzierte Verluste in Korn Integrität und Mykotoxin-Verunreinigung von Saatgut. Die beiden am weitesten verbreiteten und problematisch für Mykotoxine Maiserzeuger und Lebens-und Futtermittel-Prozessoren sind Aflatoxin und Fumonisin, durch Aspergillus flavus und Fusarium verticillioides produziert bzw.. Neuere Untersuchungen in der molekularen Pflanze-Pathogen-Interaktionen haben Versprechen für das Verständnis spezifischer Mechanismen mit pflanzlichen Reaktionen auf Pilzinfektion und Mykotoxinkontamination 1,2,3,4,5,6 verbunden demonstriert. Da viele Labs verwenden Kernel-Assays, um Pflanzen-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen, besteht ein Bedarf für ein standardisiertes Verfahren zur Quantifizierung von unterschiedlichen biologischen Parameter, soErgebnisse aus verschiedenen Laboratorien können Cross-interpretiert werden. Für eine robuste und reproduzierbare Mittel für quantitative Analysen auf Saatgut, haben wir im Labor Kernel-Assays und anschließender Methoden entwickelt, um das Pilzwachstum, Biomasse und Mykotoxinkontamination quantifizieren. Vier sterilisiert Maiskörner in Glasfläschchen mit einer Pilz-Suspension (10 6) beimpft und für einen vorbestimmten Zeitraum. Probenfläschchen werden dann für die Zählung von Conidien mit einem Hämocytometer, Ergosterin-Biomasse Analyse ausgewählt durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), Aflatoxin Quantifizierung mit Hilfe eines AflaTest Fluorometer Verfahren und Fumonisin Quantifizierung durch HPLC.

Die Verwüstung von Getreide durch Samen-Pilzresistenz hat zahlreiche Forschungsarbeiten zum besseren Verständnis Pflanze-Pathogen-Interaktionen dazu aufgefordert werden. Um Saatgut-Pilz-Interaktionen in einem Labor untersuchen, entwickelten wir eine robuste Methode zur Quantifizierung von Pilz-Reproduktion, Biomasse und Mykotoxinkontamination mit Kernel Bioassays.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

Die Fäulnis von Körnern durch sameninfizierende Pilze stellt eine der größten wirtschaftlichen Herausforderungen für die weltweite Getreideproduktion dar, ganz zu schweigen von den ernsthaften Risiken ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Biosynthese von Mykotoxinen, die Verderblichkeit und das Wachstum genau zu quantifizieren, um molekulare Wechselwirkungen zwischen Samen und Pilzen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Korn-Bioassay eingerichtet wird. Anschließend werden Kedia gezählt und danach die Mykotoxine quantifiziert.Schließlich wird die Pilzbiomasse gemessen. Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die die Auswirkungen der Samenphysiologie auf die Fortpflanzungsentwicklung und den sekundären Stoffwechsel mykotoxinbildender Pilze zeigen, durch die Quantifizierung der Biomasse von Kedia und sekundärer Metabolite mittels Sporenzählverfahren in Kombination mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Der Hauptvorteil der Verbreitung dieser Technik besteht darin, Methoden über mehrere Labore hinweg zu standardisieren, sodass Ergebnisse aus verschiedenen Laboratorien gegenseitig interpretierbar sind.Mit dieser Methode können zentrale Fragen im Bereich der molekularen Wechselwirkungen zwischen Samen und Mikroben beantwortet werden, beispielsweise wie pathogene Pilze den pflanzlichen Lipidstoffwechsel als virulente Strategie übernehmen. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, häufig Schwierigkeiten, da verschiedene Stämme von Angi unterschiedliche Wachstums- und Entwicklungsprofile aufweisen. Daher ist es unerlässlich, dass Sie die Bedingungen für Ihre bevorzugte Pilz-Samen-Wechselwirkung zwei Wochen vor Durchführung des Labyrinths optimieren.Kultur für Keimlings-Bioassays. Die pilzlichen Pathogene auf Kartoffel-Dextrose-Agar oder PDA bei 28 Grad Celsius kultivieren. Wenn die Kulturen bereit sind, Körner ähnlichen Alters, gleicher Form und Größe auswählen und in 50-Milliliter-Röhrchen geben. Oberfläche.Sterilisieren Sie die Körner, indem Sie 70 % Ethanol hinzufügen und die Röhrchen fünf Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Danach schütteln Sie sie eine Minute mit steriler Wasser und 10 Minuten mit 6 % Natriumhypochlorit. Spülen Sie dreimal mit steriler Wasser, wobei jedes Mal fünf Minuten unter Schütteln gespült wird.Dann trocknen Sie die Kerne auf Autoklav-Tüchern ab, um sie mit Aspergillus flavus zu infizieren. Verwenden Sie eine 18-Gauge-Nadel, um eine kleine Wunde von 0,5 Zentimetern Tiefe auf der Embryoseite jedes Kerns zu erzeugen. Für eine Fusarium-verticillioides-Infektion machen Sie mit einer Rasierklinge einen 0,5 Millimeter tiefen Schnitt.Bereiten Sie die Inokulum-Suspension vor, indem Sie fünf Milliliter Autoklavlösung mit 0,1 % Tween 20 zu den kultivierten Platten hinzufügen und einen Zellverteiler verwenden, um die Sporen abzukratzen. Entfernen Sie das Mycel durch Schwerkraftfiltration der Lösung durch mindestens vier Lagen Autoklav-Gauchecloth. Verwenden Sie ein Hämocytometer, um die Sporenkonzentration zu berechnen, und stellen Sie diese auf zehn hoch sechs Sporen pro Milliliter ein.Für beide Pilzarten. Erstellen Sie eine Feuchtigkeitskammer in einem Plastikbehälter, indem Sie diesen mit fünf Lagen Papiertüchern auskleiden und 100 Milliliter sterilem Wasser hinzufügen. Anschließend werden jeweils vier Kolbenkörner in jeden Autoklaven gegeben.20 Milliliter fassendes Glas in Installationsfläschchen. Wiegen Sie sie und notieren Sie ihre Masse. Geben Sie 200 Mikroliter Sporensuspension in jede Fläschchenkappe und wirbeln Sie diese, um die Körner gleichmäßig mit der Suspension zu benetzen.Danach lösen Sie die Verschlüsse, um einen freien Luftaustausch zu ermöglichen, und stellen Sie die Gefäße in die Feuchtigkeitskammer. Inkubieren Sie die Körner bei einer Licht-Dunkel-Periode von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit bei 28 Grad Celsius für sieben Tage oder bis zum gewünschten Zeitpunkt. Nach der Infektionsphase geben Sie fünf Millimeter autoklavierten 0,01 %igen Tween 20 zu den Simulationsgefäßen mit infizierten Körnern und wirbeln diese eine Minute lang gründlich um. Verdünnen Sie die Sporensuspension unverzüglich mit einer breiten VRE-Pipettenspitze, indem Sie zwei separate Aliquots à 200 Mikroliter in zwei Milliliter fassende Eppendorfgefäße überführen, die jeweils 1,8 Milliliter 0,01 %igen Tween 20 enthalten.Verwenden Sie ein H&auml;mocytometer, um jedes Aliquot zweimal zu z&auml;hlen. Um Aflatoxin zu quantifizieren, geben Sie die K&ouml;rner einer einzelnen Probe in einen 50-Milliliter-Blendbecher mit 20 Millilitern 80%igem Methanol und 0,05 Gramm Natriumchlorid. Decken Sie den Becher ab und homogenisieren Sie eine Minute lang bei hoher Geschwindigkeit.Legen Sie ein gefaltetes Filterpapier über ein sauberes Sammelgefäß und gießen Sie das Extrakt in den Filter. Überführen Sie 10 Milliliter Filtrat in ein sauberes Gefäß. Geben Sie 20 Milliliter destilliertes Wasser hinzu und mischen Sie gründlich.Filtern Sie die Probe durch einen 1,5-Mikrometer-Glasmikrofaseraufsatz in einen sauberen Becher. Geben Sie ein Milliliter des filtrierten Extrakts auf eine ALE-Testspalte und treiben Sie den filtrierten Extrakt mit Druckluft mit einer Rate von ein bis zwei Tropfen pro Sekunde durch die Säule. Spülen Sie die Säule zweimal mit je einem Milliliter destilliertem Wasser, indem Sie das Wasser mit einer Rate von ein bis zwei Tropfen pro Sekunde durch die Säule leiten, bis Luft durchtritt.Eluieren Sie die Säule mit einem Milliliter 100 %igem HPLC-Reinheitsgrad-Methanol mit einer Rate von ein bis zwei Tropfen pro Sekunde, die in ein Glass Q Vet gesammelt werden. Geben Sie ein Milliliter Ale-Testentwickler zum EIT hinzu und mischen Sie gründlich. Stellen Sie das Q VET in ein kalibriertes Fluorimeter und lesen Sie nach 60 Sekunden ab. Für die Analyse von Acin B1 oder FB1 geben Sie 10 Milliliter einer 50:50-Lösung aus Acetonitril in Wasser zu jeder kernbasierten Bioassay-Probe hinzu und extrahieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur ohne Rühren.Vermischen Sie das Extrakt mit sechs Millilitern deionisiertem Wasser und geben Sie es auf eine C18-Festphasensäule, die zuvor mit zwei Millilitern Acetonitril und anschließend mit zwei Millilitern Wasser vorkonditioniert wurde. Nach der Probenbeladung waschen Sie die Säule mit zwei Millilitern Wasser, gefolgt von zwei Millilitern Acetonitril in Wasser. Eluieren Sie die FB1-haltige Probe für die HPLC-Analyse mit zwei Millilitern Acetonitril in Wasser.Derivatisieren Sie FB1, indem Sie ein Milliliter der Säuleneffluentenprobe in ein Gefäß überführen, das 0,1 Milliliter Boratpuffer und 0,1 Milliliter Aldehyd enthält, und inkubieren Sie 10 Minuten lang. Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 0,5 Milliliter einer Acetonitril-Lösung mit 0,01 molaren Borsäure. Analysieren Sie FB1 mittels HPLC unter Verwendung eines linearen Gradienten aus Acetonitril und 0,1 molarem Natriumphosphat.Vergleichen Sie die Proben mit einer FB-Ein-Standardkurve, um die Sterolkultur zu analysieren, den Pilz auf Mais für sieben bis 14 Tage. Nach der Inkubationszeit geben Sie 10 Milliliter Chloroform-Methanol zu jedem Gefäß hinzu. Schütteln Sie die Proben gründlich und inkubieren Sie die Gefäße anschließend 24 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur.Zentrifugieren Sie die Proben bei 5.000 U/min für drei Minuten. Danach filtrieren Sie den Überstand durch eine 0,45-Mikron-Nylonmembran. Geben Sie die Probe direkt in eine HBLC-Säule ein und eluieren Sie mit 100 % Methanol bei einer Flussrate von 1,5 Milliliter pro Minute.Quantifizieren Sie die Proben durch Vergleich der Peakflächen mit einer Standardkurve, die aus HPLC-Reinheit oder Goole generiert wurde. Nach der Inokulation und Inkubation in einer Feuchtigkeitskammer für zwei bis drei Tage sollte sich pilzliches Wachstum auf den Körnern wie hier gezeigt abzeichnen.Das vegetative Wachstum sieben Tage nach der Behandlung auf inoculierten Körnern sollte deutlich sichtbar sein, während die Kontrollen ohne Infektion bleiben sollten; längere Inkubationszeiten begünstigen ein stärkeres vegetatives Wachstum. Diese Abbildung zeigt, dass der Wildtyp flavus NR RL 3 3 5 7 maximale Werte bezüglich Kolonisation, Aflatoxinakkumulation und Kedia-Produktion nach vier, sechs bzw. acht Tagen erreichte. Bei einem Vergleich der Mykotoxin-Kontamination und der tion pro Einheit Rol wurden jedoch die höchsten Werte nach vier bzw. sechs Tagen beobachtet.Gezeigt sind hier repräsentative Chromatogramme für Fumonisin und Rol aus HPLC-Analysen, die mit den in diesem Video demonstrierten Methoden durchgeführt wurden. Die Fumonisinkonzentrationen liegen zwischen 3.500 und 8.000 Nanogramm pro Gramm Kernel, die Rol-Konzentrationen zwischen 5.000 und 10.000 Nanogramm pro Gramm Kernel. Sobald die Kernel-Bioassays abgeschlossen sind, können Toxine, Mykotoxine und Pilzbiomasse innerhalb von zwei bis vier Tagen gemessen werden, abhängig von der Anzahl der experimentellen Proben.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, die Methoden unter möglichst sterilen Bedingungen durchzuführen. Weitere Methoden wie Phyto-, Harmonik-, Lipidomik- und Proteomik-, Transkriptomik- oder andere Interatomik-Verfahren können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise welche Gene, Proteine und Hormonwege an diesen wichtigen interreichlichen Wechselwirkungen beteiligt sind.

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Zur Untersuchung der Entwicklungsprozesse von Ascosporen in Gibberella zeae, ein Verfahren für die Sammlung unter sterilen Bedingungen gefilmt wird, um ein Höchstmaß an Informationen für die Protokoll-Beschreibung zu generieren. Dies sollte die Reproduzierbarkeit der Experimente, ein entscheidender Aspekt, wenn sie voll Genom Expressionsprofil Tests durchgeführt werden.

Gibberella zeae Ascosporen Produktion und Sammlung für Microarray-Experimente.

Protein-Extraktion für Proteom-Analysen in Pilzarten erfordert ein hohes Maß an Standardisierung zu erfolgen gemäß den Mindestanforderungen Informationen über ein Proteom-Experiment (MIAPE) Richtlinien. Wir präsentieren ein Video-Protokoll, das ein Verfahren zur Minimierung der experimentellen Bias während Toxin Induktion und Extraktion der Proteine ​​aus...

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Hier beschreiben wir ein Protokoll zur pulmonalen Pilz Belastung bei Mäusen mit invasiver Aspergillose durch Quantifizierung der Gomoris modifizierten Methanamine Silber Färbung in histologischen Abschnitte bestimmen. Verwendung dieser Methode führte zu vergleichbaren Ergebnissen mit weniger Tiere im Vergleich zu Bewertung der Pilzinfektionen Belastung durch quantitative PCR der Lunge Pilz DNA.

Histologischen Quantifizierung Lunge Pilz Belastung in experimentellen Aspergillose bestimmen

Hier präsentieren wir ein Protokoll um Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in Maiskörner mit dem Ausdruck einer antimykotischen Proteins zu analysieren.  Mit GFP exprimierenden A. Flavus Belastung überwacht wir die Infektion und die Ausbreitung des Pilzes in Reife Kerne in Echtzeit. Der Test ist schnell, zuverlässig und reproduzierbar.

Hemmung der Aspergillus Flavus Wachstum und Aflatoxin in transgenen Mais mit dem Ausdruck der α-Amylase-Inhibitor von Lablab Purpureus L.

Wir beschreiben eine modifizierte Agar-basierte Methode zur Quantifizierung der antimykotischen Wirkung pflanzlicher Produkte. Sowohl flüchtige als auch nichtflüchtige Beiträge zur Antimykotika-Aktivität können durch dieses Protokoll bewertet werden. Darüber hinaus kann die Wirksamkeit gegen Pilze in wichtigen Entwicklungsstadien in einem einzigen Versuchsaufbau gemessen werden.

Messung der flüchtigen und nichtflüchtigen Antimykotika-Aktivität von Biocontrol-Produkten

Wir präsentieren ein markierungsfreies Live-Imaging-Protokoll mit Durchlichtmikroskopie-Techniken, um Bilder zu erfassen, die Wachstumskinetik des filamentösen Pilzes A. nidulans sowohl in Unterwasserkulturen als auch in festen Medien zu analysieren und zu quantifizieren. Dieses Protokoll kann in Verbindung mit der Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.

Quantitative Analyse der Wachstumsrate von Aspergillus nidulans mittels Live-Mikroskopie und Open-Source-Software

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das auf dem Mehlwurm (Tenebrio molitor) -Ködersystem basiert, das zur Isolierung und Auswahl entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben verwendet wurde. Eine effektive Konidienzahlformel (ECN) wird verwendet, um einen hoch stresstoleranten EPF basierend auf physiologischen Eigenschaften für die mikrobielle Schädlingsbekämpfung im Feld auszuwählen.

Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten

Dieses Protokoll zielt darauf ab, detaillierte Verfahren zum Sammeln, Fixieren und Pflegen mykoheterotropher Pflanzenproben bereitzustellen, wobei verschiedene Mikroskopietechniken wie Raster- und Transmissionselektronenmikroskopie, Licht-, Konfokal- und Fluoreszenzmikroskopie angewendet werden, um die Pilzbesiedlung in Pflanzengeweben und Samen zu untersuchen, die mit Mykorrhizapilzen gekeimt sind.

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

Dieses Manuskript beschreibt ein optimiertes Inokulationsprotokoll, das abgelöste Maisblatthüllen für reproduzierbare zytologische, physiologische und molekulare Studien von Maisinteraktionen mit pilzlichen Pflanzenpathogenen verwendet. Die Blattscheiden erleichtern die Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen zwischen der lebenden Pflanze und dem Pilz in nicht fixiertem Gewebe.

Abgetrennte Maisscheiden für die Lebendzell-Bildgebung der Infektion durch pilzliche Blattmais-Erreger

Lernen Sie die Quantifizierung von Mykotoxinbiosynthese und Pilzwachstum in Getreidekörnern mittels Kernel-Bioassays. Diese standardisierte Methode ermöglicht reproduzierbare Ergebnisse zur Untersuchung von Samen-Pilz-Interaktionen.

Die Quantifizierung der Pilzbesiedlung, Sporogenese und Produktion von Mykotoxinen Kernel-Bioassays

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