Isolierung von Basalzellen und Submuköse Gland Duct Zellen aus Maus Trachea

Das Ziel dieser Methode besteht darin, Stammzellen aus den submukösen Drüsengängen der Mausluftröhre zu isolieren, um deren Untersuchung, Reparatur und Regeneration zu ermöglichen. Zunächst wird die Luftröhre von einer euthanasierten Maus präpariert. Die Luftröhre wird gereinigt, zerschnitten und verdaut.

Anschließend wird das Epithel mechanisch entfernt und weiterverdaut, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen. Die Zellen werden dann für FACS gefärbt, sortiert und schließlich für die Verwendung in In-vivo- und In-vitro-Assays aufbereitet. Letztendlich kann diese Methode dabei helfen, zentrale Signalwege zu identifizieren, die die Selbstvermehrung und Differenzierung von Atemwegs-Epithelstammzellen regulieren.

Diese Techniken sind wichtig, weil sie uns Modelle für die in vitro und ex vivo Atemwegs-, Epithelreparatur und -regeneration liefern. Dies ermöglicht es uns, die normale Atemwegsreparatur sowie Atemwegserkrankungen wie die chronisch obstruktive Lungenerkrankung, die zystische Fibrose und Asthma zu untersuchen. Die Idee zu dieser Methode entstand, als wir keine spezifischen Oberflächenmarker finden konnten, um die basalen von den Gang-Stammzellen zu isolieren, und wir uns daher entschlossen, das Oberflächenepithel zusammen mit den basalen Zellen zu entfernen und die Gangzellen zurückzulassen. Demonstration der Verfahren zur Trachealdissektion.

Das Abtrennen des Atemwegsepithels, die Herstellung einer Einzelzell-Suspension und die Zellsortierung werden durchgeführt. Ein Postdoktorand in meinem Labor demonstriert die Verfahren zur Aufbereitung sortierter Zellen in in-vitro- und ex-vivo-Modellen. Ja, Orga, unsere Laborleiterin. Beginnen Sie diesen Vorgang, indem Sie die Bauchdecke einer euthanasierten Maus eröffnen.

Bewegen Sie die Därme zur Seite, um die Bauchaorta freizulegen, und dissezieren Sie diese. Öffnen Sie den Brustkorb, indem Sie durch das Zwerchfell und die innere Brustwand beidseits schneiden, um Herz und Lunge freizulegen. Setzen Sie den Schnitt bis in den Hals fort, entfernen Sie das Fett- und die Speicheldrüsen mit einer feinen Schere, um die Luftröhre freizulegen.

Entfernen Sie den Thymus und trennen Sie die Lunge vom darunter- und dahinterliegenden Bindegewebe. Setzen Sie dann die Pinzette zwischen Luftröhre und Speiseröhre, um diese zu trennen. Durchtrennen Sie die Luftröhre am obersten Teil oberhalb ihrer Verbindung mit dem Kehlkopf.

Halten Sie anschließend die Trachea mit der Pinzette und dissezieren Sie sie von ihrer Verankerung. Setzen Sie die Dissektion nach kaudal fort, um sie zusammen mit dem Herz-Lungen-Block zu entfernen, und schneiden Sie das Herz und die Lungen nahe dem Hilum ab, sodass die größten Teile der rechten und linken Hauptbronchien mitentfernt werden. Legen Sie die Trachea in eine kleine Petrischale mit Sammelmedium auf Eis unter dem Dissektionsmikroskop.

Verwenden Sie eine sehr feine Pinzette der Größe fünf, eine Venenkanüle und eine Schere, um jegliches an der Trachea anhängende Gewebe zu entfernen. Dazu gehören Lymphknoten, Fettgewebe des Nervus laryngeus recurrens, die Schilddrüse und verbleibende Lungengefäße. Der obere Teil der Trachea erfordert besondere Sorgfalt, um große Stücke des Kehlkopfknorpels zu entfernen, ohne den größten Haufen submuköser Drüsen zu beschädigen, der zwischen dem Cricoknorpel und dem ersten knorpeligen Trachealring C1 liegt.

Schneiden Sie anschließend die Luftröhre zwischen C vier und C fünf in einen oberen und einen unteren Teil und trennen Sie sie. Öffnen Sie beide Teile entlang des Lumens der Luftröhre. Überführen Sie den unteren Teil der Luftröhre in ein eintausend Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen und den oberen Teil der Luftröhre in ein 15-Milliliter-Konischgefäß zur Enzymspaltung und Aufbereitung zu einer Einzelzell-Suspension.

Im nächsten Teil des Verfahrens werden der untere und obere Teil der Trachea verarbeitet, um Einzelzell-Suspensionen zu erzeugen. Obwohl diese hier gleichzeitig verarbeitet werden sollten, werden die beiden Methoden nacheinander demonstriert. Um den unteren Teil der Trachea zu verarbeiten, geben Sie diesen in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter 16 Einheiten Dis Raum, und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur.

Überführen Sie dann die Trachea in ein neues Gefäß mit 0,5 Milligramm pro Milliliter DNAase I in DMM und inkubieren Sie weitere 20 Minuten bei Raumtemperatur nach dem Verdau. Verwenden Sie feine Pinzette, um das Gewebe in eine sterile Petrischale mit frischem Sammelmedium zu überführen. Entfernen Sie dann unter dem Stereomikroskop das Oberflächenepithel, indem Sie vorsichtig an den epithelialen Schichten ziehen, um sie von der darunterliegenden Basalmembran zu lösen. Überführen Sie anschließend mit einer Pipette das Medium mit dem abgelösten Epithel in ein kegelförmiges 50-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie bei 1000 × g und vier Grad Celsius.

Nach dem Zentrifugieren entfernen Sie das SNAT und geben 0,1 % Trypsin-EDTA hinzu. Inkubieren Sie das Gefäß 30 Minuten lang in einem schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation pipettieren Sie mit einer 1000-Mikroliter-Spitze mehrmals auf und ab, um Zellklumpen aufzubrechen und sicherzustellen, dass eine Einzelzell-Suspension entsteht. Legen Sie die obere Luftröhre in ein kegelförmiges Reaktionsgefäß, das ein Milliliter 0,15 % Pronase enthält, und inkubieren Sie vier Stunden lang bei vier Grad Celsius. Überführen Sie den unteren Teil der Luftröhre in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit einem Milliliter Medium, das 16 Einheiten Discase enthält.

Nach der Inkubation das Röhrchen vorsichtig verwirbeln und dann die Trachea in frisches Sammelmedium geben. Unter dem Auflichtmikroskop überprüfen, ob das Oberflächenepithel vollständig abgelöst ist. Mit feiner Schere die Trachea zerkleinern und die Submukosadrüsenkompartimente öffnen.

Inkubieren Sie eine weitere Stunde bei Raumtemperatur mit langsamen Schütteln in 0,15 % Pronase. Zentrifugieren Sie das Trachealgewebe nach dem Entfernen der Pronase. Geben Sie 0,1 % Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius unter Schütteln.

Als Nächstes filtern Sie die großen Stücke durch ein 70-Mikron-Sieb. Danach spülen Sie das Sieb mit Medium aus. Leiten Sie die digestierte Zellklumpen und alle verbleibenden Drüsenstücke mit einer 10-Milliliter-Spritze durch Nadeln mit 20, 23 und 26 Gauge.

Wiederholen Sie die Aufbereitung mehrmals mit jeder Nadelgröße, bevor Sie zur nächstkleineren Größe wechseln. Nun sollten sich die meisten Zellen in einer Einzelzell-Suspension befinden. Filtern Sie die Suspension durch ein 40-Mikron-Sieb, waschen Sie das Sieb mit Medium nach und zentrifugieren Sie die Zellen.

Dann resuspendieren Sie die Zellen in dem geeigneten Volumen Medium, zählen Sie die Zellen und fahren Sie unverzüglich mit der Färbung und Sortierung fort. Entnehmen Sie ausreichend Zellen zur Herstellung der unbehandelten und einfach gefärbten Kompensationsröhrchen. Anschließend färben Sie den Rest der Zellen mit primären Antikörpern gegen Trop-Rohr und I TGA sechs 15 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation waschen Sie mit PBS oder Sammelmedium und entfernen Sie das Überstand vorsichtig.

Resuspendieren Sie das Zellpellet in der geeigneten Sekundärantikörper-Lösung. Inkubieren Sie 10 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur. Anschließend waschen und entfernen Sie den Überstand und resuspendieren dann das Pellet.

Die Zellen können nun mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung sortiert werden. Nach der Sortierung können die Zellen verwendet werden, um die Mechanismen der Reparatur und Regeneration zu untersuchen und in vitro kugelförmige Kulturen zu erzeugen. Mischen Sie 100 Mikroliter wachstumsfaktorarmes Matrigel mit 100 Mikrolitern komplettem Medium, das bis zu 50.000 sortierte Zellen enthält.

Pipettieren Sie diese Mischung in die obere Kammer einer 24-Loch-Transwell-Platte. In die untere Kammer pipettieren Sie 400 Mikroliter komplettes Medium und inkubieren bei 37 Grad Celsius. Wechseln Sie das Medium in der unteren Kammer jeden zweiten Tag und geben Sie wöchentlich oder früher zusätzlich 100 Mikroliter Matrigel hinzu, falls es dünn wird.

Kugeln bilden sich typischerweise nach sieben Tagen und können über mehrere Wochen kultiviert oder seriell weitergeimpft werden. Für das In-vivo-Modell resuspendieren Sie das sortierte Zellpellet in vollständigem Medium, das im Verhältnis eins zu eins mit Matrigel gemischt wurde, bei einer Konzentration von 5.000 bis 10.000 Zellen pro 50 Mikroliter. Nach der Anästhesie der empfängenden C57BL/6-Maus sterilisieren und rasieren Sie deren Rücken, insbesondere den oberen Rückenbereich.

Führen Sie einen zentralen longitudinalen Hautschnitt durch. Verwenden Sie die stumpfe Seite der Scherenklinge, um Taschen zwischen der Haut und der Rückseite der Brustwand auf beiden Seiten zu erweitern. Drücken Sie die Mausgliedmaßen nach oben und hinten, um den mediale Rand des Schulterblatts zu verschieben und zu identifizieren.

Danach mithilfe einer 300-Mikroliter-Insulinspritze 50 Mikroliter der Zellsuspension in das Fettgewebe injizieren, das sich medial zur Schulterblattregion und lateral zu den Wirbeln befindet. Es sollte sich eine Blase bilden; die Injektion auf der anderen Seite wiederholen, dann nach drei Wochen den Hautschnitt mit einer Klammer oder Naht verschließen. Die Haut des euthanasierten Mäuschens wie zuvor öffnen und das gesamte Fettgewebe beidseits mit einem Sicherheitsabstand herauspräparieren.

Um sicherzustellen, dass keine Gewebestruktur übersehen wird, die sich möglicherweise gebildet und ausgebreitet hat, fixieren Sie das dissezierte Fettgewebe in PFA und betten es in Paraffin ein, um Strukturen beim Schneiden des Blocks nicht zu umgehen oder zu übersehen. Schneiden Sie einmal 40 Mikrometer ab und fertigen Sie dann einen vier Mikrometer dicken Schnitt an.

Legen Sie es auf einen Objektträger und untersuchen Sie es unter dem Mikroskop, um festzustellen, ob epitheliale Strukturen vorhanden sind. Falls nichts zu sehen ist, schneiden Sie erneut ab und wiederholen Sie diesen Schritt. Das in diesem Video beschriebene Abstreifen der Maus-Trachea führt zu einer entblößten Trachea, die mittels Lichtmikroskopie sichtbar ist, wie hier an entblößten Tracheen gezeigt.

Nach 30 Minuten Pepsin-Digestion sind die behandelten Gewebe auf der linken Seite dargestellt, darunter auch entepithelialisierte Tracheen. Nach vierstündiger Pronase-Digestion sind die Proben auf der rechten Seite zu sehen. Nach dem Entfernen des Epithels lösen sich die submukösen Drüsen aus dem Gewebe und ähneln Trauben von Weintrauben.

Die Entfernung der Oberflächenepithelzellen ist mit schwarzen Pfeilen dargestellt. Die Entfernung von Zellen in den submukösen Drüsen und Ausführungsgängen ist mit grünen Pfeilen dargestellt. Die Durchflusszytometrie der Einzelzell-Suspensionen sollte Vorwärtsstreuung und Seitwärtsstreuung wie hier gezeigt aufweisen.

Gute Trennung der Gangzellen von den übrigen Zellen. Wenn die trachealen Zellen mit dem Trop2-Antikörper in der Durchflusszytometrie zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung sichtbar sein sollen, sollten nach etwa einer Woche Kultur Sphäroide im Matrigel sichtbar sein – luminal, wenn sie von Basalzellen abstammen, und duktal, wenn sie von Gangzellen abstammen. Die Effizienz dieses Prozesses liegt in der Größenordnung von ein bis zwei Prozent, und einzelne Zellen verbleiben weiterhin im Matrigel; diese stellen vermutlich Zellen aus den submukösen Drüsen ducts dar, die nicht zur Selbsterneuerung befähigt sind.

Basale Sphären sind größer und erscheinen luminal. Die Injektion von Ductus-Stammzellen in die Mausfettpolster führt zur Bildung von submukösen Drüsen-ähnlichen Strukturen, die sphärisch sind und ein zentrales Lumen besitzen. Diese sind bereits in den Schnittblöcken sichtbar, selbst ohne H-und-E-Färbung.

Es müssen viele Querschnitte durch das Fettgewebe geführt werden, um einen Ausschnitt zu erhalten, der diese epithelialen Strukturen enthält. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Stammzellpopulation aus subikulären Drüsenzellen isoliert, und sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von 10 Stunden abgeschlossen werden. Im Anschluss an dieses Verfahren können die Kulturbedingungen verändert werden, um verschiedene Fragestellungen im Zusammenhang mit der Sphäroidbildung und der Regeneration sowie der Wachstumsfaktorstimulation zu beantworten.