Name: Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus und Adenovirus-vermittelten Hilfs-Zell-Infektion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Lernen Sie die Dissektion des erwachsenen Mäuse-Utriculus und die adenovirusvermittelte Infektion von Hilfszellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Haarzellregeneration und Überleben in vitro.

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Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung am National Institute on Taubheit und andere Kommunikations Erkrankungen unterstützt. Zusätzliche Unterstützung wurde von NIDCD 5R01 DC007613 zur Verfügung gestellt.

1. Utriculus Dissection und Kultur <ol><li> Euthanize einen Erwachsenen (4 Wochen alt oder älter) Maus unter Verwendung eines zugelassenen Protokoll und enthaupten. </li><li> Snip den äußeren Gehörgang auf beiden Seiten des Kopfes und ziehen Sie die Haut nach vorn in Richtung der Nase. Halbierung der Kopf von hinten nach vorne und entfernen Sie das Gehirn von beiden Seiten, um die knöchernen Labyrinth zu offenbaren. </li><li> Kürzen Sie den Schädel weg von der knöchernen Schnecke und überweisen Sie den knöchernen Labyrinth (einschließlich der Bulla) auf eine Gewebekultur Kapuze mit einem Binokular ausgestattet (Hinweis: Adenovirus Arbeit sollte in einer Klasse II biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden). </li><li> In der Haube, übertragen jede Schnecke auf einer 35-mm Gewebekulturschale mit steriler Sezieren Medien (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Abbildung 1A). </li><li> Wenn die Gehörkapsel noch intakt ist (es ist möglich, die Bulla während des Brutto-Dissektion zu entfernen, indem Sie Ihren Daumennagel zwischen der Bulla und der Spitzedie Cochlea), verwenden Sie zwei Zangen (ein # 3 und # 5 ein), um die Bulla (Abbildung 1B) zu brechen. </li><li> Identifizieren Sie die Sehenswürdigkeiten der knöchernen Schnecke Zubereitung: Apex, Base, Gehörknöchelchen, ovale und runde Fenster, VIII. Nervenwurzel, Bogengänge (Abbildung 1 C, D). </li><li> Setzen Sie den inneren Ohr in die Schüssel mit der medialen Seite nach oben, so dass die ovalen und runden Fensters und Spitze auf der Unterseite der Schale und der VIII. Nervenwurzel sind nach oben zeigt. Halten Sie die Vorbereitung mit Hilfe einer Pinzette # 3 in der Region der Bogengänge (1D). </li><li> Mit einem Skalpell mit einer # 11 Klinge ausgestattet, schneiden Sie die Spitze der Cochlea nur apikal der Nervenwurzel (1D). </li><li> Drehen Sie die Vorbereitung, so dass die abgeschnittenen Teil nach oben zeigt. Verwenden Sie den anterioren Bogengangs als Griff, um die Vorbereitung (1E) zu stabilisieren. </li><li> Mit Nr. 5 Zange, entfernen Sie die Hörschnecke an den Modiolus nach untenmit der Basis. An der Stelle, wo der Haken Bereich der Cochlea sich nach unten dreht, mit einem feinen Sonde (die Hälfte eines zerbrochenen Nr. 55 Pinzetten), um die letzte knöchernen Regal des knöchernen Lamina spiralis (1F) anheben und enthüllt den Sacculus. Direkt unter der Sacculus ist die Stapesfußplatte, was ein wichtiger Meilenstein ist. Die Schlauches unmittelbar an der Fußplatte (1G), und es ist von Knochen umgeben. Verwenden Sie die Sonde, um den Knochen splittern weg genug, um etwa 1/3 des Utriculus offenbaren. Entfernen Sie vorsichtig die Utriculus mit einer Pinzette # 55 (Abbildung 1H). Dieses Verfahren wird in der Regel bei der Entfernung des pigmentierten Dach Epithel führen, da die Schlauches von der knöchernen Herstellung gezogen wird. Wenn jedoch die Schlauches mit dem Dach Epithel intakt entfernt wird, kann das Dach abgenommen mit Nr. 55 Zangen werden. </li><li> Primordialschläuche für Adenovirus-Infektion (oder Live-Imaging-Experimente) müssen die Otokonien während der Dissektion (vor der Infektion) entfernt.In diesem Fall verwenden Sie einen Luer-Lock-Spritze, die mit Sezieren Medien gefüllt ist und mit einer kleinen Injektionsnadel (in der Regel 26 bis 28 Gauge). Halten Sie den Utriculus am Rand mit einer Pinzette # 55 (Abb. 1I). Bringen Sie die Nadelspitze in der Nähe des Schlauches mit der Abschrägung der Nadel nach unten zeigt. Verwenden Sie einen Stream zu sezieren Medien Abblasen des Otokonien (Abb. 1J). Alternativ können Otokonien durch Streichen sie weg mit der Wimper Werkzeug (Ted Pella, Inc. # 113) entfernt werden. Primordialschläuche, die nicht gehen, um Adenovirus-Infektion zu unterziehen sind in der Regel kultivierte freischwebend im 24-well-Zellkulturplatten mit dem Otokonien intakt (siehe unten für Post-fix Otokonien Entfernung, was leichter ist). </li><li> Sobald alle Primordialschläuche seziert werden, ändern Sie die Medien zu sezieren sterilen Nährmedien: DMEM F12 (Gibco Nr. 11320) mit 5% FBS und 50 U / ml Penicillin G (Sigma) ergänzt. </li><li> Primordialschläuche werden bei 37 ° C und 5% CO 2 kultiviert. Wenn Kulturen sind zu mainta seininiert für mehr als 48 Stunden, sollte die Hälfte der Kulturmedien jeden zweiten Tag gewechselt werden. Kulturen können für eine Woche oder länger aufrechterhalten werden. </li></ol> 2. Adenovirus-Infektion von Stützzellen Wichtig: Die Arbeit mit Adenovirus erfordert Biosafety Level 2 (BSL2) und Urkunde. Fragen Sie bei Ihrem Institutional Biosafety Officer für Beratung und Weiterbildung auf BSL2 Verfahren. <ol><li> Sezieren Primordialschläuche wie oben in Dissektion Medien (kein Serum). Entfernen Sie Otokonien wie oben. </li><li> Wenn Sie bereit sind zu infizieren, übertragen ein Utriculus (Haarzellen nach oben) in jedes Well ein Nunc Mini-Tray (Fisher # 12-565-68) mit 15 ul serumfreiem DMEM F12 (das ist wichtig, weil Serum das Virus zu inaktivieren kann) . Dieser Transfer ist leichter, mit einem 1,5 mm microcurette (# 10082-15 von Fine Science Tools). </li><li> Unsere Ad-GFP ist Serotyp 5 mit den viralen Gene E1 und E3 gelöscht und des humanen CMV-Promotor, der die transgen (GFP). Dieses Virus wurde von Vector BioLabs (Philadelphia, PA erhalten <a href="http://www.vectorbiolabs.com/">vectorbiolabs.com</a> ). Lager Viren in Titern von 1,0-4,0 × 10 10 PFU / ml bereitgestellt. In 0,5-2 ul Lager Virus in jede Vertiefung mit einem Utriculus (Abb. 1 l). Die tatsächliche Menge verwendet wird, variiert in Abhängigkeit von dem Virus und-Titern. Wir in der Regel infizieren sich Utriculus mit 1,0-4,0 × 10 7 PFU. </li><li> Kultur die Primordialschläuche in Virus-enthaltenden Medium bei 37 ° C / 5% CO 2 für 2 Stunden. Nach 2 Stunden, übertragen Sie die Primordialschläuche zurück auf die 24-Well-Zellkultur-Platte, die Nährböden mit Serum. Kultur Primordialschläuche die über Nacht bei 37 ° C / 5% CO 2. </li><li> Primordialschläuche kann verwendet werden, am nächsten Tag für die Live-Imaging-Experimenten werden, oder sie können für Haarzelle Immunchemie befestigt werden (siehe unten). Virale Transgenexpression der Zeit zunimmt, so dass, wenn Transgenexpression ist bei 24 Stunden nach der Infektion gering auch immerNutzen zur Kultivierung von Zellen weitere 24 Stunden in serumhaltigen Medien. Wenn Sie Haarzelle Toxizität sehen, reduzieren die Menge an Virus verwendet. </li></ol> 3. Utriculus Fixierung, Otokonien Removal, und Immunchemie <ol><li> Am Ende der Kulturzeit, zu fixieren Primordialschläuche in 4% Paraformaldehyd für entweder 3 Stunden bei Raumtemperatur (auf einer Schüttelplattform) oder über Nacht bei 4 ° C Wash Primordialschläuche (3-mal, jeweils 15 min) in 0,1 M (1X) Sorensens Phosphatpuffer pH 7,4. Diese Schritte werden in einer 24-Well Gewebekultur-Platte durchgeführt. </li><li> Otokonien Entfernung: Hinweis: Otokonien muss vor der Adenovirus-Infektion entfernt werden (siehe Schritt 1,11 oben). Allerdings kann Primordialschläuche, die nicht infiziert zu sein, kultiviert und mit dem Otokonien noch intakt fixiert werden. In diesem Fall verwenden Sie die hier beschriebenen Schritte, um die Otokonien nach der Fixierung zu entfernen. Überprüfen Primordialschläuche sie für jeden weiteren pigmentierte Epithel Dach. Entfernen Sie vorsichtig das restliche Dach Epithel mit zwei Nr. 55 forceps. Um die Otokonien entfernen, ersetzen Sorensen-Phosphat-Puffer mit 750-1000 ul Cal-Ex-Entkalker (Fisher # CS510-1D). Verlassen Sie Cal-Ex auf Primordialschläuche für 1 Minute und 40 Sekunden (nicht mehr als 2 Minuten). Ersetzen Sie Cal-Ex mit 0,1 M Sorensen-Phosphat-Puffer und waschen (5-mal, jeweils 5 min). </li><li> Inkubieren Primordialschläuche in Natriumborhydrid (Sigma # 452882, 1% in VE-Wasser) für 10 min. Waschen Sie Primordialschläuche in 0,1 M Sörensen-Phosphatpuffer (5-mal, jeweils 5 min). </li><li> Platz Primordialschläuche in Blocking-Lösung (PBS + 2% Rinderserumalbumin + 0,8% normales Ziegenserum + 0,4% Triton X-100) für 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Schüttler Plattform. </li><li> In primären Antikörpern und über Nacht bei 4 ° C Anti-Myosin 7a (entweder Proteus Biosciences # 25-6790 oder # MYO7A 138-1 aus der Developmental Studies Hybridoma Bank) bei 1:100 in Blockierungslösung Etiketten alle Haarzellen. Separat zu beschriften striolar und nicht-striolar Haarzellen, haben wir ein Doppel-Label-Protokolls in Verwendungl mit monoklonalen anti-Calmodulin (Sigma C # 3545; 1:150) und polyklonalen anti-Calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200). Sekundäre Antikörper (Alexa Fluor meist konjugierte sekundäre Antikörper von Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) werden 1:500 in Blocking-Lösung verdünnt und für 4 Stunden im Dunkeln bei Raumtemperatur auf einem schwankenden Plattform. </li><li> Berg Primordialschläuche auf Glasplättchen mit Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Primordialschläuche kultiviert mit dieser Methode die volle Ergänzung der beiden Haar-und Stützzellen (Abbildung 2). Haarzellen im gesunden Kulturen zeigen Runde nuklearen Profile von dünnen zytoplasmatischen Regionen, die Myosin-positiven 7a umgeben sind (Abbildung 2, oberes Feld). Stützzellen (markiert mit anti-Sox2) sind kleiner und dichter besiedelt als Haarzellen (Abb. 2, unten) verpackt. Adenovirus infiziert 25-50% der Stützzellen im Utriculus, und keine Haarzellen infiziert sind (Abbildung 2, Ad-GFP-Panels). Es sei darauf hingewiesen, dass die optimale Arbeitsbedingungen Titer jeder Adenovirus empirisch ermittelt werden müssen, da Haar Zelltod ist möglich, wenn der virale Titer zu hoch ist. Darüber hinaus werden die Regionen von mechanischen Beschädigungen (verursacht während der Dissektion) nehmen große Mengen an Virus. Diese Regionen einer mechanischen Beschädigung sind leicht zu erkennen durch eine durchgezogene Linie von Zellen mit sehr hohen GFP-Expression und fehlende Haarzellen. Dies steht im Gegensatz zu der gestreuten GFP-Expression in Stützzellen eines unbeschädigten Kultur (2). <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. Utriculus Dissection. A:. Gehörkapsel (AB). B: Die Bulla ist gebrochen mit zwei stabilen Zange C: knöchernen Schnecke (RW = runde Fenster, S =. A. stapedia, C = Cochlea, ST = Stapes) D: A Skalpellklinge (SB) dient zum Abschalten der Spitze der Cochlea apikal des VIII. Hirnnerven (8 th N) ASC = anterioren Bogengangs E..: Die Herstellung ist fest mit einer # 3-Zange mit einer Gabel in die vordere Bogengang (ASC) und das andere auf der äußersten Knochen (Pfeile) eingesetzt gehalten wird. Das häutige Labyrinth wird mit einer Pinzette entfernt F:. Mit der häutigen Labyrinths entfernt, ist der basalen Windung des knöchernen Spiralblatt sichtbar in der Nähe des Hakens Region. Eine feine Sonde wird unter dieser knöchernen Regal eingefügt, um das Regal anheben und entfernen Sie sie (Pfeil) G:. Nach der Entfernung des Sacculus ist Utriculus (U) sichtbar unmittelbar neben dem Stapesfußplatte (SF) H:. Utriculus (U ) wird unter Verwendung eines # 55 Zange (Pfeil) SF = Stapesfußplatte I:.. Utriculus mit Otokonien (O) teilweise entfernt eind Sinnesepithel (SE) darunter sichtbar J:. Otokonien (O) aus des Schlauches mit einem Strom von Medien durch eine Spritze mit einer 26-Gauge-Nadel ausgestattet geliefert entfernt. Der Schatten der Nadel (n) ist sichtbar am unteren Rand des Bildes K:. Utriculus mit Otokonien entfernt und Sinnesepithel (SE) sichtbar L:. Adenoviralen Infektion: je Utriculus (U) ist im Einzelfall auch von einer Mini platziert -Fach. Hintergrundinformationen Zellen mit Adenovirus durch Pipettieren Virus in dem Bohrloch (P = Pipettenspitze) infiziert. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig2.jpg" alt="2"/> Abbildung 2. Adenovirus-vermittelte Infektion von Zellen unterstützen. Primordialschläuche wurden mit Adenovirus die Expression des grün fluoreszierenden Proteins (GFP-Ad) infiziert. Es zeigen konfokale Bilder der Haare Zellschicht und der unterstützenden Zellschicht im gleichen Bereich eines Schlauches. Haar-Zellen werden mit einem Antikörper gegen Myosin 7a markierten(Magenta). Hintergrundinformationen Zellen mit einem Antikörper gegen Sox2 (rot) markiert. Schema zeigt die Struktur des Utriculus Sinnesepithel und die Standorte der Haarzellen (HC) und Stützzellen (SC). Standorte der konfokalen (optisch) Abschnitte in der oberen (U) und unteren gezeigt (L) Platten sind durch gestrichelte Linien in der schematischen angegeben. Obere Platten: Bei der konfokalen Bilder auf der Ebene der Haare Zellkernen, scheint sich Ad-GFP-Signal in den Zwischenräumen zwischen Haarzellen und nicht mit dem Haar Zellmarker Myosin 7a überlappen. Untere Reihe: In konfokale Schnitte auf der Ebene der tragenden Zellkerne, kolokalisiert Ad-GFP-Signal mit der tragenden Zellmarker Sox-2. Ad-GFP-Infektion führt zu einer GFP-Expression in Stützzellen nur, und kein Haar Zellen infiziert. <img src="/files/ftp_upload/3734/3734fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3. Adenoviralen Infektion nicht mit dem Tod der Haarzellen oder Stützzellen führen. Utricles wurden mit Ad-GFP bei 4 × 10 8 PFU / ml infiziert. Primordialschläuche wurden mit Antikörpern gegen Myosin 7a (Haar-Zell-Marker) und Sox2 (mit Unterstützung für Zell-Marker) beschriftet. Haarzelle und Unterstützung Zellzahlen waren gleich zur Kontrolle Primordialschläuche und Ad-GFP infiziert Primordialschläuche.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Sensorischen Haarzellen sind anfällig für den Tod von einer Vielzahl von Belastungen, einschließlich Altersstruktur, Knalltrauma, und der Exposition gegenüber ototoxischen Medikamenten, einschließlich der Aminoglykosid-Antibiotika und der Antineoplastikum Cisplatin verursacht. Bei Säugetieren Haare Zelltod führt zu permanentem Hörverlust und / oder Störung Gleichgewicht. In-vitro-Modellsysteme sind entscheidende Werkzeuge für das Studium an der Bestimmung der zellulären und molekularen Mechanismen, die Haare Ze...

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Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagenz</strong</td&gt;<td<strong&gt; Unternehmen</strong</td&gt;<td<strong&gt; Katalog-Nummer</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Medium 199</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 12350</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DMEM/F12</td&gt;<td&gt; Gibco / Invitrogen</td&gt;<td&gt; 11320</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Feinen Pinzette (# 55)</td&gt;<td&gt; Fine Science Tools</td&gt;<td&gt; 11255-20</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Feinen Pinzette (# 5)</td&gt;<td&gt; Fine Science Tools</td&gt;<td&gt; 11252-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzetten (# 3)</td&gt;<td&gt; Fine Science Tools</td&gt;<td&gt; 11231-30</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Penicillin G</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; P3032</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fötales Rinderserum</td&gt;<td&gt; Invitrogen</td&gt;<td&gt; 10082-139</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Nunc Mini-Tablett</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; 12-565-68</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Adenovirus-GFP</td&gt;<td&gt; Vector Biolabs</td&gt;<td&gt; 1060 *</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cal-Ex-Entkalker</td&gt;<td&gt; Fisher</td&gt;<td&gt; CS510-1D</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Natriumborhydrid</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; 452882</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosin 7a (polyklonal)</td&gt;<td&gt; Proteus Biosciences</td&gt;<td&gt; 25-6790</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Myosin 7a (monoklonal)</td&gt;<td&gt; Developmental Studies Hybridoma der Bank</td&gt;<td&gt; MYO7A 138-1</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calmodulin</td&gt;<td&gt; Sigma</td&gt;<td&gt; C 3545</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-Calbindin</td&gt;<td&gt; Chemicon</td&gt;<td&gt; AB1778</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fluoromount G</td&gt;<td&gt; Southern Biotechnology Associates</td&gt;<td&gt; 0100-01</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"<strong&gt; Tabelle 1</strong&gt;. Reagenzien und Instrumente in Utriculus Kultur und Adenovirus-Infektion eingesetzt.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; * Hinweis: Ad-GFP wird normalerweise durch Vector Biolabs an einer Börse Titer von 1x10 zur Verfügung gestellt<sup&gt; 10</sup&gt; PFU / ml. Wir baten um ein benutzerdefiniertes Verstärkung, um die Lager-Virus bei einem Titer von 1,2 x 10 liefern<sup&gt; 11</sup&gt; PFU / ml.</p&gt;

dissektion der erwachsenen maus utriculus und adenovirus-vermittelten hilfs-zell-infektion

Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection

Schwerhörigkeit und Gleichgewichtsstörungen werden oft durch den Tod von mechanosensorischen Haarzellen, die die Sinneszellen im Innenohr verursacht werden. Da es keine Zelllinie, die zufriedenstellend für Säuger-Haarzellen setzt Forschung Haarzellen auf Hauptorgan Kulturen. Die in vitro-Modellsystem von reifem Säuger Haarzellen am besten charakterisierte verwendet Organkulturen von Primordialschläuche von erwachsenen Mäusen (1) 1-6. Der Utriculus ist ein Gleichgewichtsorgan, und die Haarzellen des Utriculus sind ähnlich in Struktur und Funktion der Haarzellen im Hörorgan, das Corti-Organ. Die erwachsenen Maus Utriculus Vorbereitung stellt eine reife Sinnesepithel für Studien über die molekularen Signale, die das Überleben, Homöostase und Tod dieser Zellen zu regulieren. Mammalian Haarzellen der Cochlea sind terminal differenziert und werden nicht regeneriert, wenn sie verloren sind. In Nicht-mammalischen Wirbeltiere, auditive oder vestibuläre Haarzelle der Tod durch robuste Regeneration, die Gehör und Gleichgewicht Funktionen 7, 8 wieder gefolgt. Haare Zellregeneration wird durch Glia-wie Stützzellen, die die basolateralen Oberflächen der Haarzellen in der Sinnesepithel 9, 10 Kontakt vermittelt. Stützzellen sind auch wichtige Mediatoren der Haarzelle Überleben und Tod 11. Wir haben vor kurzem eine Technik für die Infektion von Stützzellen in kultivierten Primordialschläuche Verwendung von Adenovirus entwickelt. Verwendung von Adenovirus Typ 5 (dE1/E3), ein Transgen enthält GFP unter der Kontrolle des CMV-Promotors zu liefern, finden wir, dass Adenovirus-spezifisch und effizient infiziert Stützzellen. Unterstützende Zellinfektion ein Wirkungsgrad von ca. 25-50%, und Haarzellen nicht infiziert sind (Abbildung 2). Wichtig ist, finden wir, dass adenovirale Infektion von Stützzellen nicht in die Toxizität für Haarzellen oder Stützzellen führen, da Zellzahlen in der Ad-GFP-infektieren Primordialschläuche denen entsprechen, die in nicht-infizierten Primordialschläuche (Abbildung 3). So Adenovirus-vermittelten Genexpression in Stützzellen des kultivierten Primordialschläuche ist ein leistungsstarkes Tool, um die Rollen von Stützzellen als Vermittler der Haare das Überleben der Zelle, Tod und Regeneration zu studieren.

Mechanosensorischen Haarzellen sind die Sinneszellen des Innenohres. Der am besten charakterisierte<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell-System von Säugetieren reifen Haarzellen nutzt Organkulturen von Primordialschläuche von erwachsenen Mäusen. Wir präsentieren die Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus, und wir zeigen Adenovirus-vermittelte Infektion von Stützzellen in kultivierten Primordialschläuche.

Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus und Adenovirus-vermittelten Hilfs-Zell-Infektion

Hörverlust und Gleichgewichtsstörungen werden häufig durch das Absterben mechanosensorischer Haarzellen verursacht, welche die Rezeptorzellen des Innenohrs darstellen. Da es ...

Diese Darstellung ist eine Demonstration der Verfahren für die Kultur ganzer Organe des Utrikulus von erwachsenen Mäusen. Die Verwendung von Adenoviren zur Infektion von Stützzellen im kultivierten Utrikulus wird ebenfalls gezeigt. Dies erfolgt, indem der Utrikulus zuerst sorgfältig aus dem Innenohr präpariert wird.Der zweite Schritt besteht darin, das Dachepithel zu entfernen. Danach werden die Otoconien entfernt, wobei das sensorische Epithel intakt bleibt. Der letzte Schritt ist die Infektion der Stützzellen des Utrikulus mittels Adenovirus.Diese Techniken können in einer Vielzahl von Experimenten eingesetzt werden, die darauf abzielen, reife Haarzellen und Stützzellen bei Säugetieren in vitro zu untersuchen. Die Sinnesrezeptorzellen im Innenohr werden als Haarzellen bezeichnet, und diese Zellen sind dafür verantwortlich, Schallenergie oder Kopfbewegungen in neuronale Signale für das Gehirn umzuwandeln.Hörverlust wird häufig durch den Tod dieser sensorischen Haarzellen verursacht. Um die Mechanismen zu untersuchen, die dem Absterben sensorischer Haarzellen zugrunde liegen, ist es sehr hilfreich, ein In-vitro-Modellsystem zu haben. Die Methode, die wir demonstrieren werden, nutzt

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In diesem Video verwenden wir ein Adenovirus Durchführung der Cre-Rekombinase-Gen zur primären embryonalen Maus-Fibroblasten Tragen einer floxed Rac1 Allel zu infizieren.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

Verfahren zur Verfolgung synaptisch verbundenen Neuronen beschrieben. Wir verwenden TVA Spezifität eines vorgeschalteten Zelle zu untersuchen, ob eine Zellpopulation von Interesse synaptischen Input von genetisch definierten Zelltypen erhält.

Viral Tracing von genetisch definierten Neural Circuitry

Der beschriebene postaurikuläre chirurgische Ansatz ermöglicht eine schnelle und direkte Verabreichung in die Cochlea-Scala tympani der Maus bei gleichzeitiger Minimierung des Blutverlusts und der Tiersterblichkeit. Diese Methode kann für die Cochlea-Therapie mit molekularer, pharmakologischer und viraler Verabreichung an postnatale Mäuse durch die runde Fenstermembran verwendet werden.

Chirurgische Verfahren zum viral vermittelte Gentransfer in die Maus-Innenohr über die runde Fenstermembran

Wir präsentieren eine Methode, um die Erwachsenen Corti-Organ als drei intakte Cochlea-Windungen (Spitze, mittlere und Base) zu isolieren. Wir haben auch ein Verfahren zur Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern nachzuweisen. Zusammen ermöglichen diese Verfahren die Untersuchung der Haarzellen, Stützzellen und anderen Zelltypen in der Cochlea vorhanden.

Ganze Berge Dissection und Immunfluoreszenz der erwachsenen Maus Cochlea

In diesem Bericht werden die Vorteile des organotypischen Kulturen und dissoziierten Primärkulturen von Maus-abgeleitete Dorsal Root Ganglien hervorgehoben, um eine Vielzahl von Mechanismen, die Neuron-Glia-Interaktion, Neuroplastizität zugeordnet zu nehmen, Neuroinflammation und Antwort auf virale Infektion.

Erwachsenen Maus DRG Explant und distanzierte Zellmodelle um Neuroplastizität und Antworten auf ökologische Beleidigungen einschließlich Virusinfektion zu untersuchen

Hier beschreiben wir Canalostomy Verfahren die lokale Medikamentenabgabe in das innere Ohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen durch den Semicircular Kanal mit minimalschaden Hör- und vestibulären Funktion ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, virale Vektoren, Pharma und kleine Moleküle in das Innenohr Maus impfen.

Canalostomy als ein chirurgisches Vorgehen zu Local Drug Delivery in das innere Ohr von Erwachsenen und Neugeborenen Mäusen

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der murinen Utricle und Cochlea in optisch klar Kollagen ich bewahren angeborene Gewebe Morphologie Gele ermöglichen für mechanische Stimulation durch Anpassung der Matrix Steifigkeit und Virus-vermittelten gen Lieferung zu ermöglichen.

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane

Dieses Protokoll beschreibt den Prozess der Erzeugung und Charakterisierung von Urothelorganoiden der Maus, die Deletionen in interessanten Genen beherbergen. Die Methoden umfassen die Gewinnung von Maus-Urothelzellen, die Ex-vivo-Transduktion mit Adenovirus-treibender Cre-Expression mit einem CMV-Promotor sowie die In-vitro- sowie In-vivo-Charakterisierung.

Ex vivo Organoid-Modell von Adenovirus-Cre-vermittelten Gendeletionen in Urothelzellen der Maus

Es werden Methoden zur Erzeugung großer Mengen rekombinanter Adenoviren beschrieben, die dann zur Transduktion des nativen Nagetier-Urothels verwendet werden können, was die Expression von Transgenen oder die Herunterregulierung endogener Genprodukte ermöglicht.

Expression von Transgenen im nativen Blasenurothel mittels Adenovirus-vermittelter Transduktion

Die Stria vascularis ist für die Bildung des endocochleären Potentials von entscheidender Bedeutung. In dieser Arbeit stellen wir die Präparation der adulten Stria vascularis der Maus für die Einzelkernsequenzierung oder Immunfärbung vor.

Präparation von Stria vascularis der adulten Maus zur Einzelkernsequenzierung oder Immunfärbung

Lernen Sie die Dissektion des erwachsenen Mäuse-Utriculus und die adenovirusvermittelte Infektion von Hilfszellen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Haarzellregeneration und Überleben in vitro.

Dissektion der erwachsenen Maus Utriculus und Adenovirus-vermittelten Hilfs-Zell-Infektion

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