Generation der induzierte regulatorische T-Zellen aus primären humanen naiven und Gedächtnis-T-Zellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, humane regulatorische T-Zellen aus primären T-Zellen zu erzeugen. Zunächst werden mononukleäre Zellen aus peripherem Blut aus menschlichen Blutproben isoliert. Anschließend werden CD4-positive T-Zellen aus dem PBMC-Gemisch gereinigt und kultiviert.

Nach sechs Tagen werden die Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers in naive, Gedächtnis-, Effektor- und induzierte regulatorische T-Zell-Subpopulationen sortiert, wobei Suppressorassays durchgeführt werden. Die Verwendung dieser Zellen zeigt, dass diese Methode humane regulatorische T-Zellen mit Suppressoraktivität erzeugt. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber Methoden, die Mundzellen verwenden, bestehen darin, dass unsere humane Methode eine größere physiologische und klinische Relevanz aufweist und den Vergleich von Tregs mit anderen Zellpopulationen innerhalb eines einzelnen Spenders ermöglicht.

Reduzierung der inneren Subjektvariabilität. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der regulatorischen Zellen beantworten, beispielsweise, welche regulativen Vorgänge den Übergang zwischen konventionellen T-Zellen und regulatorischen Zellen modulieren, oder welche signaltransduktiven und transkriptionellen Ereignisse spezifisch für regulatorische Zellen sind. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf Therapien bei Autoimmunerkrankungen, entzündlichen Erkrankungen und Krebs aufgrund der entscheidenden Rolle, die regulatorische T-Zellen (Tregs) bei der Aufrechterhaltung der immunologischen Homöostase spielen.

Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Technik sind, aufgrund der Vielzahl verwendeter Methoden und einiger Schritte mit einem engen Fenster für optimale Zellkulturbedingungen Schwierigkeiten. Obwohl diese Methode Einblicke in die Reg-Entwicklung ermöglicht, kann sie auch dazu verwendet werden, die Plastizität der T-Zell-Linien-Differenzierung zu überwachen oder die Fähigkeit von T-Zell-Milli zu analysieren, diese zu induzieren oder zu verhindern. Reg-Entwicklung Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Andrea McCool und die Doktoranden Marie Catherine Ranier Gavin Ellis sowie Catalina Vale Ortega.

Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Isolierung menschlicher peripherer mononuklearer Blutzellen aus 40 bis 60 Litern B-Buffycoat. Verdünnen Sie den Buffycoat, indem Sie ihn in eine autoklavierte 500-Milliliter-Glasflasche überführen, die 150 Milliliter sterilem PBS enthält. Fügen Sie anschließend weiteres steriles PBS hinzu, um das Endvolumen auf 250 Milliliter aufzufüllen. Füllen Sie danach 10 konische 50-Milliliter-Röhrchen, jedes mit 20 Milliliter Lympho-Prep-Lösung.

Danach vorsichtig 25 Milliliter des verdünnten Buffy Coats über die Lympho-Prep-Lösung schichten, wobei darauf geachtet werden muss, die Lympho-Prep-Lösung nicht zu stören. Die Röhrchen 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 500 × g zentrifugieren. Sicherstellen, dass die Bremse der Zentrifuge ausgeschaltet ist, um die Lymphozyten-Fraktion nicht zu stören.

Nach der Zentrifugation befindet sich die PBM-CS an der Grenzfläche zwischen der Lympho-Prep- und der Plasmaschicht, um diese zu sammeln. Aspirieren Sie das Plasmedium, bis etwa ein Milliliter die Buffy-Coat-Schicht, die die PBMC enthält, bedeckt. Überführen Sie die PBMC mit einer 10-Milliliter-Pipette in ein neues 50-Milliliter-Gefäß.

Nachdem die Zellen zweimal mit PBS gewaschen wurden, resuspendieren Sie sie in 50 Milliliter kaltem RPMI und zählen Sie sie mithilfe eines Hämozytometers. Die typische Ausbeute beträgt acht mal 10 hoch acht bis ein mal 10 hoch neun p BMCs, nachdem die Konzentration bestimmt wurde. Resuspendieren Sie die PBM Cs in einer Endkonzentration von fünf mal 10 hoch sieben pro Milliliter in PBS, der 2 % FBS und ein Millimolar EDTA enthält, und überführen Sie die Zellen in ein frisches 14-Milliliter-Polypropylen-Rundbodengefäß.

Anschließend wird das EAs-Kit zur negativen Selektion der gewünschten Zellen verwendet. Die mit dem Kit bereitgestellten T-Zell-Anreicherungscocktails enthalten einen tetrameren Antikörperkomplex, der auf der einen Seite einen Anti-Dextrin-Antikörper und auf der anderen Seite einen Antikörper gegen unerwünschte Zelloberflächenantigene besitzt. Wenn der Cocktail den Zellen zugegeben wird, verbindet der tetramere Antikörperkomplex die unerwünschten Zellen.

Magnetische Partikel mit Dextran-Beschichtung werden anschließend hinzugefügt, die an den tetrameren Antikörperkomplex binden und so die unerwünschten Zellen mit dem magnetischen Partikel verbinden. Ein Magnet wird dann verwendet, um die unerwünschten Zellen von den Zellen von Interesse zu trennen, die anschließend gesammelt werden, um CD-vier-positive T-Zellen zu isolieren. Pipettieren Sie ein Mal 10 hoch acht bis 4,25 Mal 10 hoch acht PBMC in ein 15-Milliliter-Konischrohr. Fügen Sie dann 50 Mikroliter humanes Anreicherungs-Cocktail für CD-vier-positive T-Zellen, bestehend aus Antikörpern, pro Milliliter PBMC hinzu.

Mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Verteilen Sie die magnetischen Partikel gleichmäßig in der Lösung. Fügen Sie 100 Mikroliter magnetische Partikel pro Milliliter PBMC hinzu.

Mischen Sie durch vorsichtiges Pipettieren zwei bis drei Mal und inkubieren Sie anschließend bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Geben Sie PBS mit FBS und EDTA hinzu, um das Volumen auf 10 Milliliter pro Röhrchen aufzufüllen, wobei das Mischen durch vorsichtiges Pipettieren zwei bis drei Mal erfolgt. Danach stellen Sie das ungekapselte Röhrchen für fünf Minuten in das Magnetfeld, wobei sich das Röhrchen weiterhin im Magneten befindet.

Geben Sie die Flüssigkeit in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen, um die Zellen von Interesse zur besseren Rückgewinnung zu isolieren. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie dem Röhrchen zusätzliches P-B-S-F-B-S-E-D-T-A hinzufügen, mischen und die Probe erneut in den Magneten stellen. Nach der Isolierung der Zellen zählen Sie diese, zentrifugieren dann fünf Minuten bei 500 ×g und Raumtemperatur.

Resuspendieren Sie das Zellpellet in Differenzierungsmedium, um eine Konzentration von zwei mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter zu erreichen. Fahren Sie anschließend mit der Kultivierung wie im nächsten Abschnitt des Videos beschrieben fort, um regulatorische T-Zellen zu induzieren. Erwärmen Sie anti-CD3-beschichtete 6-Well-Gewebekulturplatten vorab auf 37 Grad Celsius.

Nachdem die Platten warm sind, aspirations das PBS aus den Vertiefungen. Anschließend vier Milliliter der CD4-positiven angereicherten Zellsuspension zu jeder Vertiefung hinzufügen. Eventuell vorhandene leere Vertiefungen mit PBS auffüllen, um die Verdunstung des Mediums zu reduzieren, und drei Tage lang inkubieren. Nach der Inkubation fortfahren.

Zentrifugieren Sie die Platte fünf Minuten bei 500 × g. Entfernen Sie dann, ohne die Zellen am Boden der Platte zu stören, die Hälfte des Mediums und ersetzen Sie es durch frisches Medium. Inkubieren Sie für zwei bis drei weitere Tage. Die Zellen können nun mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung wie im nächsten Abschnitt beschrieben sortiert oder als Zielzellen für einen Suppressionsassay verwendet werden, wie später beschrieben. Nachdem zwei bis drei Tage vergangen sind, bereiten Sie die Zellen und die geeigneten Kompensationskontrollen für die fluoreszenzaktivierten Zellen vor. Zum Sortieren, um induzierte regulatorische naive und Gedächtnis-T-Zellen zu trennen, färben Sie die zu sortierenden Zellen mit anti-CD25 PE, anti-CD45RA PE-Cy5 und anti-CD127 APC, wie in dem begleitenden Dokument beschrieben.

Stellen Sie außerdem sicher, dass Antikörper zu den entsprechenden Kompensationskontrollen für die Fax-Analyse hinzugefügt werden. Nach der Färbung die Zellen in einer Konzentration von einem Mal 10 hoch 7 Zellen pro Milliliter Waschpuffer resuspendieren, dann 1,5 Mikroliter DNAs zwei pro Milliliter Zellen hinzufügen und die Zellen durch einen 40-Mikron-Nylon-Zellsieb filtern. Überführen Sie die Zellen in 5-Milliliter-Rundbodenzentrifugenrohre aus Polypropylen mit nicht mehr als 3,5 Millilitern pro Rohr.

Resuspendieren Sie die Kompensationskontrollzellen in 300 Mikrolitern Waschpuffer. Stellen Sie die Kompensation am Durchflusszytometer so ein, dass eine Kreuzdetektion durch die PE-, APC- und PE-Cy5-Filter minimiert wird. Setzen Sie die Gates, um Tregs, naive und Gedächtnis-T-Zellen in 5-Milliliter-Rundbodentuben aus Polystyrol zu sortieren, die ein Milliliter neugeborenes Kälberserum enthalten, um zu überprüfen, ob die während des Sortierens generierten regulatorischen T-Zellen in der Lage sind, die Proliferation von T-Zellen zu unterdrücken.

Es wird ein Suppressionsassay durchgeführt. Die nicht sortierten, CD4-positiven, angereicherten Zellen dienen als Zielzellen. Diese sollten keine CD25-positiven induzierten regulatorischen T-Zellen enthalten.

Beginnen Sie damit, die Zielzellen mit CFSE mithilfe eines Zelltracing-Kits gemäß den Herstelleranweisungen zu markieren, wobei ein Mikroliter der fünf Molaren Stammlösung pro Milliliter Zellen anstelle von zwei Mikrolitern verwendet wird. Anschließend pelletieren Sie eine Anzahl an Treg-Suppression-Inspector-Perlen, die der Gesamtzellzahl entspricht, durch kurze Zentrifugation in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Perlen einmal mit RPMI und pelletieren Sie sie erneut nach der Zentrifugation.

Aspirieren Sie das RPMI und resuspendieren Sie die Zellen in acht Mikrolitern Suppressionsassay-Medium pro Vertiefung in einer 96-Loch-Rundboden-Zellkulturplatte auf die geeignete Konzentration. Geben Sie acht Mikroliter CFSE-gefärbte Zielzellen hinzu. Überführen Sie die Perlen und polarisierten sortierten Zellen in ein Endvolumen an frischem Suppressionsassay-Medium.

Medium von 200 Mikrolitern. Alle Bedingungen werden im Dreifachansatz gepflanzt. Zur Herstellung der Kontrollen 100 Mikroliter CFSE-gefärbter Zellen, acht Mikroliter Inspektor-Perlen und eine mal 10 hoch 5 frische, ungefärbte Zellen in 92 Mikrolitern Suppressor-Assay hinzufügen.

Medium je Vertiefung auf die ersten beiden Kontrollvertiefungen. Dann 100 Mikroliter CFSE-gefärbte Zellen und eine mal zehn hoch fünf frische, ungefärbte Zellen in 92 Mikrolitern Suppressor-Assay-Medium je Vertiefung auf die zweiten beiden Kontrollvertiefungen.

Decken Sie die Platte mit Aluminiumfolie ab und stellen Sie sie fünf Tage lang im Dunkeln in den Inkubator. Sammeln Sie die Zellen aus jedem Well durch Pipettieren und geben Sie sie in ein fünf Milliliter fassendes Rundbodenglas aus Polystyrol. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie die Zellen in 300 µL kaltem FACS-Waschpuffer. Um den Fortschritt der induzierten Differenzierung regulatorischer T-Zellen zu überwachen, wurden gereinigte humane primäre CD4-positive, CD25-negative T-Zellen in iTreg-Medium kultiviert. Aliquots, die am Tag 0, 1, 3 und 5 entnommen wurden, wurden mittels Durchflusszytometrie auf die Expression der Marker CD45RA, FoxP3, CTLA-4 und CD25 analysiert. Wie in diesen Pseudofärbungs-Diagrammen über einen Zeitraum von fünf Tagen zu sehen ist, proliferieren und differenzieren die Zellen in vitro als Reaktion auf CD3-Vernetzung in Gegenwart von TGF-β und IL-2 und entwickeln sich schließlich zu einem Profil mit CD45RA-negativ, FoxP3-hoch, CTLA-4-hoch und CD25-hoch. Dies weist auf die Entwicklung induzierter Tregs aus konventionellen T-Zell-Vorläufern hin, um die relative Fähigkeit der generierten Tregs zur Suppression der T-Zell-Proliferation zu bewerten.

CFSE-markierte Zellen wurden mit Treg-Suppressions-Inspektor-Beads in Gegenwart sortierter naiver Gedächtnis- und I-Treg-Zellen kultiviert, wie in diesem Histogramm zu sehen ist. Zellen CD 25 hoch, CD 45 RA negativ CD 1 27 negativ. Niedrig induzierte regulatorische T-Zellen sind die einzige Teilpopulation aus einer fünftägigen Kultur, die eine regulatorische Suppressionsfähigkeit erworben hat.

Dies zeigt an, dass die in diesem System erzeugten Zellen phänotypisch und funktionell suppressive regulatorische T-Zellen und keine aktivierten konventionellen T-Zellen sind, die vorübergehend FOX P drei und CD 25 exprimieren können, jedoch nicht immunsuppressiv wirken. Das Vorhandensein induzierter regulatorischer T-Zellen beseitigt die Proliferation von CD vier-positiven T-Zellen vollständig. Die Zahlen geben den Prozentsatz der CFSC-markierten Zellen an, die eine Teilung durchlaufen haben, um zu bestätigen, dass dies ebenfalls für gereinigte T-Zell-Teilpopulationen gilt.

Menschliche primäre naive und Gedächtnis-T-Zellen wurden mit CFSE gefärbt und darin kultiviert. Nach fünf Tagen in Treg-Medium wurden die Zellen phänotypisiert und die Zellteilungsraten wie sichtbar geschätzt. Hier wurden Tregs aus einem Pool naiver T-Zellen und einem Pool von Gedächtnis-T-Zellen nach einer fünftägigen Kultur induziert.

Im standardmäßigen IT-Reg-Medium, CFSE. Die Färbung der anfänglichen Zellen zeigt, dass entweder naive oder Gedächtnis-T-Zellen sich erst nach mehreren Zellteilungsrunden zu regulatorischen T-Zellen differenzieren. Vergleichende CFSE-Färbeprofile identifizieren die induzierten regulatorischen T-Zellen als die am stärksten proliferierenden Zellen während der fünftägigen Kultur. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man induzierte TX-Zellen aus einer Population von naiven, Gedächtnis- oder gesamten T-Zellen, die von einem einzelnen Spender stammen, gewinnen kann, während man dieses Verfahren durchführt.

Es ist wichtig, während des gesamten Verfahrens sterile Technik anzuwenden und eine Lichteinwirkung auf CFSE zu vermeiden. Nach der Durchführung dieses Protokolls können weitere Methoden wie funktionelle Assays durchgeführt werden, um weitere Fragestellungen zu klären, beispielsweise welche Unterschiede in den Zellteilungsraten, der spezifischen Zytokinsynthese und der Nutzung von Ionenkanälen zwischen regulatorischen und konventionellen T-Zellen bestehen. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, Autoimmunerkrankungen und andere mit regulatorischen T-Zellen assoziierte Erkrankungen bei menschlichen Patienten zu untersuchen.

Es darf nicht vergessen werden, dass die Arbeit mit menschlichem Blut äußerst gefährlich ist und Vorsichtsmaßnahmen wie ausreichende Blutbanktests sowie eine ordnungsgemäße Entsorgung stets beachtet werden sollten, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.