Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Das allgemeine Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Verwendung von Glykosidase zur enzymatischen Entzuckerung und Analyse von N- und O-gebundenen Glykosylierungen an einem Modell-Glykoprotein zu veranschaulichen. Dies wird erreicht, indem ein Glykoprotein entweder mit PGA's F oder mit der Protein-Entzuckerungsmischung behandelt wird. Außerdem wurde die Protein-Entzuckerungsmischung mit einer Zusatzmischung von exo-Glykosidasen ergänzt, die manchmal dabei hilft, andernfalls resistente Zuckerreste zu entfernen.

Wir veranschaulichen diese Methode anhand eines modellhaften Glykoproteins, dem rekombinanten humanen Choriongonadotropin-Beta (HCG-Beta), das anschließend mittels SDS-PAGE getrennt wird, gefolgt von Kumasi-Blau-Färbung und einer zuckerspezifischen Färbemethode. Pro Q Emerald 300 wird verwendet, um die D-glykosylierten HCG-Beta-Proben zu analysieren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass HCG-Beta heterogen glykosyliert ist und aufgrund der Unterschiede in der Proteinwanderung mit und ohne Glykosylierungsbehandlung sowie des abnehmenden Signals in der ProQ-Färbung bei sukzessiver Entfernung der Glykane mehrere Glykoformen enthält.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Massenspektrometrie-Analyse liegt in ihrer Einfachheit, der Verwendung gängiger Laborgeräte und ihrer Eignung für Anfänger in der Glykobiologie. Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im glykobiologischen Bereich beantworten, beispielsweise, ob mein Protein glykosyliert ist. Beginnen Sie die enzymatische Entglykosylierung, indem Sie die mitgelieferten Puffer aus dem Protein-Entglykosylierungs-Kit auftauen.

Mischen Sie die Röhrchen gründlich und lassen Sie sie bei Raumtemperatur. Stellen Sie die Gefäße mit Enzym auf Eis, lösen Sie den Inhalt des HCG-beta-Gefäßes in 600 Mikrolitern destilliertem Wasser auf und bewahren Sie es auf Eis auf. Nachdem Sie einen Milliliter 1x-G7-Puffer hergestellt haben, indem Sie den 10x-Stammpuffer mit destilliertem Wasser verdünnt haben, verwenden Sie 25 Mikroliter, um 0,5 Mikroliter PGA's f zu verdünnen.

Bereiten Sie die Exo-Glykosid-Mischung vor, indem Sie jeweils zwei Mikroliter der vier Exo-Glykosidasen kombinieren. Geben Sie anschließend HCG-Beta und 10×-Glykoprotein-Denaturierungspuffer in sieben nummerierte PCR-Röhrchen gemäß dem schriftlichen Protokoll, verschließen Sie die Röhrchen und mischen Sie vorsichtig. Denaturieren Sie die Proteine im Thermocycler durch 10-minütiges Inkubieren bei 94 Grad Celsius, gefolgt von einer Haltephase bei vier Grad Celsius. Nach dem Entnehmen der Röhrchen aus dem Thermocycler kurz zentrifugieren, um sichtbare Kondensationsflüssigkeit zu entfernen. Fügen Sie dann jedem Reaktionsröhrchen die restlichen Reagenzien gemäß dem schriftlichen Protokoll hinzu. Verschließen Sie die PCR-Röhrchen mit neuen Deckeln.

Anschließend die Röhrchen vorsichtig viermal durch leichtes Antippen mischen, nachdem der Inhalt abzentrifugiert wurde, und die Röhrchen in den Thermocycler geben. Bei 37 Grad Celsius vier Stunden lang inkubieren. Danach die Proben auf 4 Grad Celsius abkühlen lassen. Zum Aufbau der SDS-Gelelektrophorese frischen dreifachen reduzierenden SDS-Puffern zum Beladen vorbereiten.

Mit DTT 12,5 µL des hergestellten dreifachen reduzierenden SDS-Lade-Puffers zu jeder Probe hinzufügen, die Röhrchen mit neuen Verschlüssen verschließen und vorsichtig klopfen, um zu mischen. Die Röhrchen im Thermocycler bei 94 °C für fünf Minuten inkubieren und anschließend auf 4 °C abkühlen lassen. Nach der Inkubation jeweils 30 µL jeder Probe und 10 µL des Proteinmarkers auf ein 10–20 % Triglycin-Gel laden. Den verbleibenden Rest jeder Probe aufbewahren.

Laufen Sie das Gel bei 130 Volt, bis sich die D-Front nahe dem unteren Rand des Gels befindet. Wenn der Laufvorgang des Gels abgeschlossen ist, nehmen Sie das Gel aus der Gussform und legen es in eine kleine Plastikbox mit ausreichend Kumasi-Blau-Färbemittel, um das Gel vollständig zu bedecken. Färben Sie das Gel eine Stunde lang unter leichtem Rühren. Nach der Färbung des Gels.

Dreimal für jeweils 30 Minuten waschen. Die Bilder mit einem Transilluminator für Weißlicht oder einem Scanner in 50 Milliliter Detain-Lösung aufnehmen. Alternativ kann das Gel zwischen Cellophan-Folien getrocknet werden.

Laufen Sie in einer Kammer den Rest jeder Probe sowie einen Proteinmarker auf einem 10 bis 20 %igen Tri-Glycin-Gel, während das Gel läuft. Lösen Sie das ProQ-Emerald-Reagenz in DMF und bereiten Sie die Stammfixier-, Wasch- und Oxidationslösungen für die Färbung gemäß der mit dem Kit bereitgestellten Produktanleitung vor. Sobald die Elektrophorese abgeschlossen ist, nehmen Sie das Gel aus der Gussform und legen es in eine Plastikbox.

Fixieren Sie das Gel, indem Sie 100 Milliliter der zubereiteten Fixierungslösung hinzufügen. Lassen Sie das Gel über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren. Waschen Sie das Gel am folgenden Tag zweimal mit jeweils 100 Milliliter der zubereiteten Waschlösung für 10 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren, wobei der zweite Waschschritt mit frischer Waschlösung durchgeführt wird.

Als Nächstes oxidieren Sie die Kohlenhydrate, indem Sie das Gel unter leichtem Schütteln 30 Minuten lang in 25 Milliliter der hergestellten Oxidationslösung inkubieren, und führen Sie anschließend zwei weitere Waschschritte durch, während das Gel gewaschen wird. Bereiten Sie frische ProQ Emerald 300-Färbung vor, indem Sie 500 Mikroliter der ProQ Emerald 300-Reagenzlösung zu 25 Milliliter des im Kit enthaltenen Färbebuffers hinzufügen. Färben Sie das Gel, indem Sie es nach der Gel-Färbung unter Lichtausschluss unter leichtem Schütteln 90 bis 120 Minuten lang in der hergestellten Färbung inkubieren.

Wiederholen Sie die beiden Waschschritte wie zuvor beschrieben. Nehmen Sie dann die Bilder mit einem UV-Durchlicht-Transilluminator bei 300 Nanometern auf. Vergleichen Sie abschließend die Bilder des mit Kumasi gefärbten Gels mit denen des mit ProQ Emerald gefärbten Gels.

Die Veränderungen in der Proteinaufwärtsmigration nach enzymatischer Entglykosylierung sind erkennbar, wenn die Kontrollprobe mit der PGA's F-Behandlung verglichen wird. Um N-Glykane zu entfernen, und durch die Behandlung mit der Entglykosylierungsmischung, um N- und O-Glykane zu entfernen, wird nach dem Verdauen mit zusätzlichem Glykosid keine weitere Größenreduktion beobachtet. Neben einer Massenänderung werden die Banden schärfer, wenn die Glykane entfernt werden.

Ein Band unterhalb des 17-Kilodalton-Markers stellt vermutlich das vollständig deglykosylierte HCG-Betapolypeptid dar. In den Bahnen fünf bis sieben sind die Bänder zu sehen, die den Glykos entsprechen. Weitere Bänder könnten auf unvollständige Deglykosylierung oder auf mehrere nicht identifizierte Proteine in der HCG-Beta-Probe zurückzuführen sein.

Das smaragdgrüne Reagenz oxidiert und färbt alle Glykane, die in einem Proteinmolekül vorhanden sind. Daher nimmt die Signalintensität ab, wenn HCG-Beta enzymatisch d-glykosyliert wird. Das verbleibende Signal in den Bahnen drei und vier weist auf das Vorhandensein von Glykanmotiven hin, die gegenüber den verwendeten Enzymen resistent sind.

Das zusätzliche Glycosid wird in Spur vier verwendet. Entfernen Sie einige zusätzliche Zuckerreste. Die Proteinaufwandsmigration ist identisch, jedoch ist eine leichte Verringerung der Färbungsintensität erkennbar.

Resistente Zuckermoietäten waren nicht bei allen Proteinspezies vorhanden. Einige Banden wurden durch Emerald Green nicht detektiert, was darauf hindeutet, dass sie stark deglykosyliert waren. Zusätzliche Daten stützen die Schlussfolgerung, dass hCG-Beta heterogen glykosyliert ist. Die untere Bande in Spur zwei ist im Emerald-Grün-Bild schwach sichtbar.

Während das obere Band in Spur zwei hell ist und darauf hinweist, dass noch viele GLYCAN-Gruppen vorhanden sind, unterstützen diese Daten die Schlussfolgerung, dass rekombinantes HCG-Beta, das in Mauszellen exprimiert wird, aufgrund der inhärenten Heterogenität der Glykosylierung mehrere Glykoformen aufweist. Nach Durchführung dieses Verfahrens können weitere Methoden wie die Massenspektrometrie angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise: Wie hoch ist die Besetzungsrate? Wie umfangreich ist die Glykosylierung, oder wie ist die Feinstruktur der Glykane?

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Glykosylat zur enzymatischen Entfernung und Analyse von N-gebundenen Glykanen an Glykoproteinen verwendet. Die Wahl der Detektion kann schwierig sein, da Protein-Färbemethoden nur nützlich sind, wenn die Entfernung der Glykane zu einer signifikanten Verschiebung der molaren Masse bei anderen Proteinen führt.

Wir haben abnormale Wanderungen nach der Entzuckerung beobachtet und festgestellt, dass jede Veränderung der Wanderung ein Hinweis darauf ist, dass das Protein entzuckert wurde.