Identifizierung und Charakterisierung von Protein-Glykosylierung mit speziellen Endo-und Exoglycosidasen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Verwendung von Glykosat für die enzymatische Deglykosylierung und Analyse der n- und O-verknüpften Glykosylierung an einem Modellglykoprotein zu veranschaulichen. Dies wird erreicht, indem ein Glykoprotein mit PGA's F oder mit dem Protein-Deglykosylierungsmix behandelt wird. Außerdem wurde die Protein-Deglykosylierungsmischung durch eine Mischung aus zusätzlichem Exo-Glyko-Ass ergänzt, die manchmal dazu beitragen, ansonsten resistente Zucker zu entfernen.

Wir veranschaulichen diese Methode anhand eines rekombinanten Modellglykoproteins für humanes Choriongonadotropin beta oder HCG beta auf der nächsten SDS-Seite, gefolgt von einer Kumasi-Blau-Färbung und einer zuckerspezifischen Färbemethode. Pro Q Emerald 300 werden verwendet, um die D-Glykosylierung zu analysieren. Es werden Ergebnisse von HCG-beta-Proben erhalten, die zeigen, dass HCG beta heterogen glykosyliert ist und mehrere Glykoformen enthält, basierend auf den Unterschieden in der Proteinmigration mit und ohne Glykosatbehandlung und dem verminderten Signal bei der ProQ-Färbung, wenn die Glykane sukzessive entfernt werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. der Massenspektrometrie, besteht darin, dass sie einfach ist, gängige Laborgeräte verwendet und gut für den unerfahrenen Glykobiologen geeignet ist. Diese Methode kann Schlüsselfragen im Glykobereich beantworten, wie z.B. ob mein Protein glykosyliert ist. Um mit der enzymatischen Deglykosylierung zu beginnen, tauen Sie die mitgelieferten Puffer aus dem Protein-Deglykosylierungskit auf.

Mischen Sie die Röhrchen gründlich und halten Sie sie bei Raumtemperatur. Stellen Sie die enzymhaltigen Fläschchen auf Eis, lösen Sie den Inhalt des HCG-Beta-Fläschchens in 600 Mikrolitern destilliertem Wasser auf und bewahren Sie es auf Eis auf. Nachdem Sie einen Milliliter eines XG Sieben-Puffers hergestellt haben, indem Sie die 10-fache Brühe in destilliertem Wasser verdünnt haben, verwenden Sie 25 Mikroliter, um 0,5 Mikroliter PGA's f zu verdünnen.

Bereiten Sie die Exo-Glykosat-Mischung vor, indem Sie zwei Mikroliter kombinieren, jede der vier Exo-Glyko-Krankheiten. Als nächstes fügen Sie HCG beta und 10 x Glykoprotein-Denaturierungspuffer zu sieben nummerierten PCR-Röhrchen hinzu, wie im schriftlichen Protokoll angegeben, verschließen Sie die Röhrchen und mischen Sie die Proteine vorsichtig denaturieren Sie sie im Thermocycler, indem Sie sie 10 Minuten bei 94 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von einem vier Grad Celsius Halten Nachdem Sie die Röhrchen aus dem Thermocycler genommen haben, zentrifugieren Sie, um jegliche sichtbare Kondensation in jedem Reaktionsröhrchen zu entfernen, Fügen Sie die restlichen Reagenzien gemäß dem schriftlichen Protokoll hinzu. Verschließen Sie die PCR-Röhrchen mit neuen Kappen.

Mischen Sie dann die Röhrchen, indem Sie nach dem Schleudern des Inhalts viermal vorsichtig klopfen, legen Sie die Röhrchen in den Thermocycler und inkubieren Sie sie vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Anschließend kühlen Sie die Proben auf vier Grad Celsius ab. Um die SDS-Seite einzurichten, bereiten Sie einen neuen SDS-Ladepuffer vor, der dreimal reduziert wird.

Mit DTT fügen Sie 12,5 Mikroliter der vorbereiteten drei x reduzierenden SDS-Ladepuffer zu jeder Probe hinzu, verschließen Sie die Röhrchen mit neuen Kappen und klopfen Sie vorsichtig auf die Röhrchen, um sie zu mischen. Inkubieren Sie die Röhrchen in einem Thermocycler fünf Minuten lang bei 94 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann auf vier Grad Celsius ab. Nach der Inkubationsladung werden 30 Mikroliter jeder Probe und 10 Mikroliter des Proteinmarkers auf ein 10 bis 20%iges Triglycin-Gel gegeben. Speichern des Rests jeder Probe.

Elektrosiert das Gel mit 130 Volt, bis sich die D-Front nahe der Unterseite des Gels befindet. Wenn das Gel fertig gelaufen ist, nimm das Gel aus dem Gips und lege es in eine kleine Plastikdose mit genügend kumasi-blauem Fleck, um den Gelfleck zu bedecken. Das Gel für eine Stunde mit sanftem Rühren Nachdem das Gel gefärbt ist.

Dreimal 30 Minuten lang waschen. In 50 Millilitern Rückhaltelösung werden die Bilder mit einem Weißlicht-Transluminator oder Scanner aufgenommen. Alternativ kann das Gel zwischen Zellophanfolien getrocknet werden.

Lassen Sie den Rest jeder Probe und einen Proteinmarker in einem Rahmen auf ein 10 bis 20 %iges Triglycin-Gel laufen, während das Gel läuft. Lösen Sie das ProQ Smaragdreagenz mit DMF auf und bereiten Sie die Fix-, Wasch- und Oxidationslösungen für den Fleck gemäß dem Produkthandbuch vor, das mit dem Kit geliefert wurde. Wenn die Elektrophorese abgeschlossen ist, nehmen Sie das Gel aus dem Gips und legen Sie es in eine Plastikbox.

Fixieren Sie das Gel, indem Sie 100 Milliliter der vorbereiteten festen Lösung hinzufügen. Lassen Sie das Gel am nächsten Tag über Nacht bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren stehen. Waschen Sie das Gel mit 100 Millilitern der vorbereiteten Waschlösung 10 bis 20 Minuten lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren und wiederholen Sie die Wäsche ein zweites Mal mit frischer Waschlösung.

Als nächstes oxidieren Sie die Kohlenhydrate, indem Sie das Gel 30 Minuten lang unter leichtem Rühren in 25 Millilitern der vorbereiteten Oxidationslösung inkubieren und nach der Inkubation zwei weitere Wäschen durchführen, während das Gel gewaschen wird. Bereiten Sie frischen ProQ Emerald 300 Farbstoff vor, indem Sie 500 Mikroliter der ProQ Emerald 300 Reagenzlösung zu 25 Millilitern Färbepuffer hinzufügen, der im Kit enthalten ist. Färben Sie das Gel, indem Sie in der vorbereiteten Beize unter dunklen Bedingungen unter leichtem Rühren 90 bis 120 Minuten lang nach der Gelfärbung inkubieren.

Wiederholen Sie die beiden Waschschritte wie zuvor beschrieben. Nehmen Sie dann die Bilder mit einem UV-Trans-Strahler bei 300 Nanometern auf. Vergleichen Sie als letzten Schritt die Bilder des Kumasi-Färbegels mit dem ProQ Smaragd-Fleckengel.

Die Veränderungen der Proteinmigration nach enzymatischer Deglykosylierung sind zu sehen, wenn die Kontrollprobe mit der F-Behandlung der PGA verglichen wird. Zur Entfernung von n-Glykanen und zur Behandlung mit dem Deglykosylierungsmix zur Entfernung von n- und O-Glykanen ist nach der Verdauung mit zusätzlichem Glykosat keine weitere Verkleinerung zu beobachten. Neben einer Änderung der Masse werden die Banden schärfer, wenn Glykane entfernt werden.

Eine Bande, die unter dem 17-Kilodalton-Marker verläuft, repräsentiert wahrscheinlich das vollständig deglykosylierte HCG-beta-Polypeptid. Die Bahnen fünf bis sieben zeigen die Banden, die dem Glyko entsprechen. Andere Banden könnten von einer unvollständigen Deglykosylierung oder von mehreren nicht identifizierten Proteinen stammen, die in der HCG-beta-Probe vorhanden sind.

Das smaragdgrüne Reagenz oxidiert und färbt alle in einem Proteinmolekül vorhandenen Glykane. Daher nimmt die Intensität des Signals ab, da HCG beta enzymatisch d-glykosyliert wird. Das Restsignal auf Spur drei und vier weist auf das Vorhandensein von Glykanmotiven hin, die gegen die verwendeten Enzyme resistent sind.

Das zusätzliche Glykosat wird in Bahn vier verwendet. Entferne ein paar überschüssige Zuckerreste. Die Proteinmigration ist die gleiche, aber es ist eine leichte Verringerung der Intensität der Färbung zu beobachten.

Resistente Zuckeranteile waren nicht bei allen Proteinarten vorhanden. Einige Banden wurden von Emerald Green nicht nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass sie weitgehend deglykosyliert waren. Zusätzliche Daten unterstützen die Schlussfolgerung, dass HCG beta heterogen glykosyliert ist. Das untere Band auf Bahn zwei ist auf dem smaragdgrünen Bild schwach

Während die obere Bande auf Spur zwei hell ist, was darauf hindeutet, dass viele GLYKAN-Gruppen noch vorhanden sind, unterstützen diese Daten die Schlussfolgerung, dass rekombinantes HCG beta, das in Mauszellen exprimiert wird, aufgrund der inhärenten Heterogenität der Glykosylierung mehrere Glykoformen enthält. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie hoch ist die Belegungsrate? Wie groß ist das Ausmaß der Glykosylierung, bzw. wie ist die Feinstruktur der Glykane?

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Glykosylat für die enzymatische Deglykosylierung und Analyse von NNO-verknüpften Glykanen verwenden. Über Glykoproteine. Die Wahl des Nachweises kann schwierig sein, da Proteinfärberegionen nur dann nützlich sind, wenn die Deglykosylierung zu einer signifikanten Verschiebung der Molekülmasse für andere Proteine führt.

Wir haben abnormale Migrationen nach der De-Glykosylierung beobachtet und festgestellt, dass jede Veränderung der Migration ein Beweis dafür ist, dass das Protein deglykosyliert wurde.