Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Die COMIN-Interaktionsanalyse unter Verwendung von Powder- und Tag-Sequenzierung ist eine Methode zur genomweiten Analyse langreichweitiger COMIN-Interaktionen. Kurz gesagt, nennen wir dies Magic Share Pad. Diese Methode umfasst zahlreiche molekularbiologische Schritte und kann kompliziert sein.

Daher zeigen wir in diesem folgenden Video einige der wichtigsten Schritte, die bei der Chromatin-Immunpräzipitation und der Bibliothekskonstruktion für die ChIP-PET-Analyse durchgeführt werden. Die Chromatin-Immunpräzipitation, auch als ChIP bekannt, ist der erste entscheidende Schritt bei der Erstellung einer ChIP-PET-Bibliothek. Dabei werden Chromatinproben aus Zellkulturen vernetzt, sonifiziert und immunpräzipitiert.

Anschließend werden separate Aliquote der Chip-DNA an barcodierte Halb-Linker ligiert, und die Ligierung unter räumlicher Nähe (Proximity-Ligation) wird durchgeführt. Die PETs werden durch Restriktionsverdauung freigesetzt, an beschichteten magnetischen Perlen gereinigt und an Adapter für die Sequenzierung der nächsten Generation ligiert. Chimäre ChIA-PETs werden über die AB-Linker-Zusammensetzung und flankierende Tags identifiziert.

Die zentrale Linkersequenz wird ausgelesen und auf das Genom abgebildet. In diesem Video zeigen wir den Standard-ChIP-Protokoll, das routinemäßig in unserem Labor an der Brustkrebszelllinie MCF7 verwendet wird. Aus unseren Daten geht hervor, dass eine stärkere ChIP-Anreicherung mit spezifischen Antikörpern bessere ChIA-PET-Daten liefert. Daher empfehlen wir dringend die Optimierung des ChIP-Protokolls sowie die Validierung der Anreicherung mittels qPCR.

Bevor mit dem Aufbau der Chair-PET-Bibliothek fortgefahren wird, werden CF7-Zellen in einer 500 cm² großen Zellkulturschale bis zu einer Konfluenz von etwa 75 % kultiviert, was ungefähr 20 Millionen Zellen vor der Vernetzung entspricht. Entsorgen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit warmer PBS. Fixieren Sie die Zellen mit frisch zubereiteten 1,5 mmol EGS für 45 Minuten auf einem Rotator bei Raumtemperatur, geben Sie anschließend 37 % Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen, und inkubieren Sie für 20 Minuten.

Die Vernetzungseffizienz ist entscheidend und variiert je nach Zelllinie und dem Protein von Interesse. Die Konzentration, Inkubationszeit und Temperatur für die Vernetzung sollten optimiert werden. Quenchen Sie die Vernetzer mit einer Endkonzentration von 200 Millimolar Glycin für 10 Minuten.

Entsorgen Sie die abgeschreckten Vernetzer und waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem PBS. Sammeln Sie die Zellen durch Abkratzen des Pellets mit einem gekühlten Tischzentrifugen. Das Pellet ist nun bereit für die Zelllyse. Alternativ können Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Falls das Zellpellet eingefroren ist, tauen Sie es auf Eis auf und resuspendieren Sie das Pellet in 0,1 % SDS-Lysepuffer, bevor Sie mit der Zelllyse fortfahren.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius mit einer gekühlten Zentrifuge, verwerfen Sie das Überstand und wiederholen Sie die Zelllyse. Führen Sie die nukleäre Lyse durch, um vernetztes Chromatin freizusetzen, bevor das Chromatin fragmentiert wird. Das Fehlen der nuklearen Membran ermöglicht es, das vernetzte Chromatin unter schonenderen Bedingungen zu sonifizieren.

Wiederholen Sie die Band-Nuklearpalette in 1 % SDS-Lysepuffer. Überführen Sie die Suspension in ein Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen. Drehen Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie nuklearen Zelltrümmern durch Zentrifugation. Die chromatische Palette sollte folgendermaßen aussehen. Verwenden Sie eine P-1000-Pipettenspitze, um die Palette in Stücke zu zerlegen, und waschen Sie sie zweimal mit 0,1 % SDS-Lysepuffer.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius mit einer gekühlten Zentrifuge. Das nukleäre Pälatin ist nun bereit für die Sonikation. Alternativ können Sie das Pälatin bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.

Überführen Sie das Gaumendach in ein klares Röhrchen. Geben Sie 0,1 % SDS-Lysepuffer zum Gaumendach hinzu und entfernen Sie alle Luftblasen. Halten Sie die Proben während der Beschallung stets kühl, um eine Überhitzung zu vermeiden. Verschiedene Bedingungen wie Puffervolumen, Sondentiefe, Beschallungsstärke, Anzahl der Zyklen und Ausmaß der Vernetzung können die Effizienz der Beschallung beeinflussen.

Reversieren Sie die Vernetzung und aliquotieren Sie das Chromatin unter Verwendung von Proteinase K und führen Sie ein Agarosegel durch. Zur Überprüfung der Fragmentierungseffizienz wird eine Optimierung empfohlen, um den gewünschten DNA-Größenbereich zwischen 200 und 600 Basenpaaren zu erhalten. Entfernen Sie Zelltrümmer durch Zentrifugation.

Das Chromatin ist nun bereit, mit magnetischen Kügelchen vorgereinigt zu werden. Alternativ kann die Probe bis zur Sammlung einer ausreichenden Menge Chromatin bei minus 80 Grad Celsius angehalten werden. Um einen ChIP zu beginnen, waschen Sie die Kügelchen dreimal mit Kügelchen-Waschpuffer; diese und alle zukünftigen Waschschritte mit magnetischen Protein-Kügelchen umfassen die folgenden Schritte.

Fügen Sie sonifiziertes Chromatin zu den vorgewaschenen Kügelchen hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius in einem separaten Gefäß. Beschichten Sie die vorgewaschenen Kügelchen mit Antikörper und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die mit Antikörper beschichteten Kügelchen zweimal mit Kügelchen-Waschpuffer.

Die hohe Komplexität des Substrats für die Proximity-Ligation führt zwangsläufig zu erheblichem unspezifischem Rauschen, wodurch die Sequenzierungskosten steigen. Neben der Verringerung der Komplexität und des Hintergrundrauschens verwendeten wir einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen RNA-Polymerase zwei, um Chromatin-Interaktionen zu identifizieren, die an der Transkriptionsregulation beteiligt sind.

Dies ermöglicht die Untersuchung aktiver Promotoren und ihrer entsprechenden regulatorischen Regionen und erlaubt so das Verständnis effizienter und möglicherweise kooperativer Transkription. Verwerfen Sie den Waschpuffer von den Antikörper-beschichteten Perlen, kombinieren Sie das vorab gereinigte Chromatin mit den antikörperbeschichteten Perlen und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Über-Nacht-Inkubation werden die Perlen einer Reihe von Waschschritten unterzogen, um ungebundenes Chromatin zu entfernen, und anschließend in TE-Puffer alikquotiert. Eine geringe Menge wird für die quantitative und Anreicherungs-Überprüfung verwendet. Die Analyse chromosomaler Interaktionen mittels PAD- und TAG-Sequenzierung ist eine Technik, die für die umfassende de-novo-Analyse wechselwirkender Chromatinstrukturen höherer Ordnung entwickelt wurde.

DNA-Fragmente, die durch Chromatin-Immunpräzipitation angereichert wurden, werden mittels Ligationsreaktion in räumlicher Nähe erfasst. Die Pad- und Tag-Strategie wird bei der Konstruktion von CHI-PET-Bibliotheken angewandt, die mittels Hochdurchsatz-Next-Generation-Sequenzierungstechnologien sequenziert werden. In diesem Video zeigen wir die entscheidenden experimentellen Aspekte bei der Erstellung von CHI-PET-Bibliotheken.

Die erste Hälfte der Bibliothekskonstruktion umfasst die Manipulation von Protein A- oder G-Kügelchen, an die die DNA-Fragmente gebunden sind, um die Enzyme und Puffer-Salze zu entfernen. Nach jeder enzymatischen Reaktion Zentrifugation mit geringer Kraft und vorsichtiges Schwenken für jeden Waschschritt verwenden. Den Überstand mehrmals pipettieren, um die Erfassung der Kügelchen zu maximieren, wenn sie auf einem magnetischen Partikel platziert werden.

Zentrifugieren Sie bei allen Inkubationsschritten, die Kügelchen in der Reaktionsmischung enthalten. Bereiten Sie die Master-Mix-Lösung im Voraus vor und geben Sie das Enzym zuletzt hinzu, nachdem die Kügelchen gleichmäßig resuspendiert wurden. Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen während der gesamten Inkubation gut durchmischt sind. Die halben Linker-Oligonukleotide sind mit einem internen Barcode aus vier Nukleotiden sowie einer Erkennungsstelle für das Typ-II-Restriktionsenzym MME1 konstruiert.

Nachdem die Halb-Linker an die gebundenen DNA-Fragmente in C-chromatischen Komplexen ligiert wurden, werden die wechselwirkenden DNA-Fragmente über eine vollständige Linkersequenz verbunden. Diese Halb-Linker erzeugen Sequenzen mit heterodimeren ab-Linkern, die aus unspezifischen Ligationsprodukten stammen, oder Sequenzen mit homodimeren AA- oder BB-Linkern, die aus spezifischen Ligationsprodukten hervorgehen. Daher ermöglicht die Verwendung zweier Halb-Linker mit unterschiedlichen Nukleotid-Barcodes die Unterscheidung verschiedener Experimente oder Replikate sowie die Überwachung der unspezifischen chimären Ligationsraten zwischen verschiedenen Chip-Komplexen.

Es ist wichtig, die Reaktion auf Eis einzurichten und die Halb-Linker vorsichtig auf Eis auftauen zu lassen. Kombinieren Sie die Halb-Linker zunächst gut mit Wasser und anschließend mit einem PEG-haltigen Ligasepuffer. Stellen Sie sicher, dass die Master-Mix gut vermischt ist, bevor die Resuspension erfolgt.

Den Chip-DNA mit T4-DNA-Ligase suspendieren, erst nachdem die halben Linker und Chip-DNA-Fragmente gut vermischt wurden, um eine Verkettung der halben Linker zu verhindern. Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm und inkubieren Sie über Nacht bei 16 Grad Celsius unter Rotation. Intakte Chromatin-Komplexe werden anschließend durch Zugabe von SDS im Puffer EB von der Kugel eluiert, um die SDS-Konzentration zu senken, und durch Zugabe von Triton X-100 wird das gesamte SDS neutralisiert. Die Zirkularisierung der Chromatin-Komplexe wird durch die Ligierung zweier halber Linker erleichtert, wodurch am Interaktionsübergang eine vollständige Linker-Sequenz entsteht. Ligieren Sie die eluierten Chromatin-Komplexe unter extrem verdünnten Bedingungen, um Ligierungen zwischen verschiedenen DNA-Protein-Komplexen zu minimieren, mit T4-DNA-Ligase erst, nachdem die eluierten chromatischen Komplexe in der Reaktionsmischung gut verdünnt wurden. Nach dem Reverse Cross-Linking, um assoziierte Proteine von der DNA zu entfernen, reinigen Sie die zirkularisierten DNA-Fragmente mittels Phenol-Chloroform-Extraktion. Verwenden Sie das KaiGen Phase-Lock-Gel-System für eine einfache Trennung.

Nach der Phenolextraktion verwenden Sie GlycoBlue, einen DNA-Träger, um die Masse und Sichtbarkeit des Palates zu erhöhen. Halbe Linker-Oligonukleotide enthalten flankierende MmeI-Erkennungsstellen. MmeI, eine Typ-II-S-Restriktionsendonuklease, schneidet 18 und 20 Basenpaare stromabwärts ihrer Zielbindungsstellen, um kurze Tags des Chromatinfragments zu erzeugen, wodurch PET-Tag-Linker-Tag-Konstrukte entstehen, abgekürzt als PETs.

Zusätzlich wird jeder Halb-Linker mit Biotin modifiziert, um die Reinigung der Pet-Konstrukte mittels mit Streptavidin beschichteter magnetischer Kügelchen zu ermöglichen. Führen Sie einen MME-One-Schnitt durch, um die Tag-Linker-Konstrukte freizusetzen. Reinigen Sie die Pets durch selektive Bindung an gebundene Aden-Kügelchen und ligieren Sie die Pet-Konstrukte mit Adaptern für die Hochdurchsatzsequenzierung.

Verwenden Sie eine Fusions-DNA-Polymerase, um die CHI PET Library Fusion zu amplifizieren. Die DNA-Polymerase wird verwendet, um Vorlagen mit hoher Genauigkeit und Effizienz zu erzeugen. Richten Sie die PCR-Reaktion kalt ein und geben Sie die Fusions-DNA-Polymerase zuletzt hinzu.

Da das Enzym eine 3' zu 5'-Exonuklease-Aktivität aufweist, die Primer in Abwesenheit von DNTPs degradieren kann. Wenn die CHAMP-Bibliothek erfolgreich konstruiert wurde, sollte ein deutliches, scharf begrenztes Band bei etwa 223 Basenpaaren sichtbar sein. Vermeiden Sie unspezifische Banden beim Ausschneiden des 223-Basenpaar-Bandes aus dem Gel und reinigen Sie das ausgeschnittene Band mithilfe des Gel-Crush-Protokolls.

Führen Sie eine Qualitätskontrolle mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer und einem DNA 1000 Kit vor der Hochdurchsatzsequenzierung durch. Wir haben soeben das CHI-PET-Verfahren zur unvoreingenommenen Detektion chromosomaler Wechselwirkungen im gesamten Genom demonstriert. Die Qualität der CHI-PET-Daten hängt von der Wirksamkeit des verwendeten Chip-Antikörpers und der Sequenziertiefe ab.

Hier verwenden wir 18 bis 20 Millionen Reads für die Interaktionskartierung. Dieses spezifische Protokoll wurde bereits erfolgreich zur Charakterisierung von Chromatin-Interaktionsnetzwerken eingesetzt, die durch den Östrogenrezeptor und die RNA-Polymerase im menschlichen Genom gebunden sind. Wir erwarten, dass dieser Assay nach den Untersuchungen zur dreidimensionalen Architektur der Transkriptionsbiologie im gesamten Genomkontext ein leistungsfähiges Werkzeug für zukünftige Studien sein wird.

Wir hoffen, dass dieses Video für Sie nützlich sein wird. Vielen Dank fürs Zuschauen.I.