Name: Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Erfahren Sie die ChIA-PET-Methode zur Analyse von Chromatin-Wechselwirkungen und Transkriptionsregulation. Dieses Protokoll zeigt Chromatin-Immunpräzipitation, Proximity-Ligation und Bibliotheksaufbau für genomweite Studien.

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Die Autoren werden von A * STAR Singapur unterstützt. Darüber hinaus wird durch eine MJF A * STAR National Science Scholarship, ein L&#39;Oreal For Women in Science Fellowship Nationale und Lee Kuan Yew Postdoc-Stipendium unterstützt. YR ist durch NIH ENCODE Zuschüsse (R01 HG004456-01 und R01 HG003521-01) unterstützt. Die Autoren erkennen die Videografie Team von 8 Pixel Productions, Singapur, insbesondere Herr Kelvin Issey, Mr. Chang Xiang Kai und Herr Sherwin Gan für die Dreharbeiten der Szenen, Frau Siti Rahim für die Videobearbeitung und Frau Michelle Teo für die Voice-Over.

<ol><li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SATB1+packages+densely+looped%2C+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li>
<li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li>
<li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li>
<li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li>
<li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22(2010).</li>
<li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li>
<li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12(2007).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+at+a+distance%3A+DNA-looping+and+initiation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li>
<li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

CHIA-PET ist eine Methode entwickelt, um weitreichende Wechselwirkungen in Transkriptionsregulation identifizieren. Einer der kritischen Faktoren, die die Qualität eines CHIA PET-Bibliothek bestimmen, ist die Qualität der Chip-Material. Das Protokoll, in dem Video gezeigt, beinhaltet die Verwendung von EGS und Formaldehyd zu vernetzen die Zellen. Die Verwendung von Formaldehyd mit einem zweiten Vernetzungsmittel mit längerer Spacer-Arm, kann die Bindung von Proteinen, die nicht allein durch Formaldehyd gebunden 3,11,15 könnte helfen. Wir haben Bibliotheken mit dieser Methode, die robust Bindungsstellen und weitreichenden Wechselwirkungen 9 gezeigt haben, gebaut. Jedoch kann die Vernetzung und ChIP Bedingungen sollen für jeden Faktor von Interesse optimiert werden, und es ist wichtig, nicht zu stark vernetzt, wie viel der Vernetzung in Schwierigkeiten bei der Fragmentierung durch Beschallung führt und möglicherweise zu falschen Chromatin-Wechselwirkungen führen . Chromatin-Wechselwirkungenidentifiziert von Chia-PET sollte nach einem anderen Verfahren, wie die Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung 4 validiert werden. Wir empfehlen einen Mindestabstand von 100 ng von Chromatin Material. Während wir gute Qualität Bibliotheken aus 50 ng von Chromatin Material konstruiert haben, haben wir beobachtet, dass große Mengen an Ausgangsmaterial erlaubt Bau von Chia-PET-Bibliotheken mit weniger als 16 PCR-Zyklen und minimiert dadurch Amplikons und Redundanz der einzelnen Bibliotheken. Diese geringere Redundanz mit höheren einmaligen abgebildet Tags und auch einem hohen Anteil an verwertbaren Daten korreliert, wodurch eine umfassendere Interaktion Chromatin Karte mit weniger Fahrspuren der Sequenzierung. Das endgültige Volumen der Kugeln verpackt in jedem Rohr sollte 50 ul und 100 ul für magnetische und Sepharosekügelchen betragen. Wenn die Raupe gepackten Volumen ist kleiner als angegeben, auf das Minimum verpackt Volumen mit ähnlich bereits geklärten unbespielten magnetischen oder Sepharosekügelchen bringen, um den Verlust von DNA-tragenden Wulst minimierens in den nachfolgenden Schritten. Abgesägte Tipps oder großen Kern-Tipps sollten zum Pipettieren Sepharosekügelchen verwendet werden. Folgende Modifikationen wurden nach dem zuvor veröffentlichten CHIA-PET-Protokoll 5 eingearbeitet. Erstens wurden magnetische Beads G verwendet werden, um durch Verluste während Wäschen zu minimieren. Darüber hinaus haben wir festgestellt, unspezifische Banden mit den ungefähren Größen von 100 bp und 138 bp bis Amplikons von selbst ligiert, Halb-Linker oder / und Adapter sein. Daher konnten wir die Konzentration von biotinyliertem halb Linker und 454 GS20 Adapter unspezifische Banden während der PCR Amplifikation zu minimieren. Die Ligationssysteme Volumen von 50 ml bis 10 ml eingeengt, um durch Verluste während nachfolgenden Reinigungsschritte zu minimieren und auch an Reagenz zu sparen. Wir erhöhte auch die Inkubationszeit nach Chia-PET-DNA zu immobilisieren Perlen, um eine maximale Aufnahme von Chia-PET-DNA auf den Streptavidinbeads zu gewährleisten. Während der Nähe Ligationsschritt, chimäre Ligierungen that nicht die wahre in vivo Chromatin-Wechselwirkungen zwangsläufig in einer nicht-spezifischen und zufällige Weise erzeugt. Um daher die Qualität der Daten von jedem CHIA-PET Erfahrung zu evaluieren, wird die Geschwindigkeit des Chimärismus aus der Verwendung von zwei unterschiedlichen Halbwertszeiten Linker mit spezifischen Nukleotid Barcodes TAAG und ATGT 5 geschätzt. Nach dem Hochdurchsatz-Sequenzierung, werden die Chia-PET-Sequenzen zunächst für Barcode-Linker Zusammensetzung und spezifische Sequenzen aus Ligationsprodukte und unspezifische Ligationsprodukte abgeleitet analysiert unterschieden werden 8. Der Prozentsatz der bekannten Chimären (dh Heterodimere AB Linker e) in der hauseigenen MCF-7-RNA-Polymerase II CHIA-PET-Bibliotheken weniger als 15% ist. CHIA PET-Sequenzen anschließend in zwei Kategorien, nämlich Selbst-Ligation Privatsphäre und inter-Ligation Tierbörse. Selbst-Ligation HAUSTIERE sind aus selbständiger Zirkularisierung Ligation der Chromatin-Fragmente erhalten werden, während inter-Ligation Haustiere von i abgeleitet werdennter-Ligation zwischen zwei verschiedenen DNA-Fragmente. Letzteres ist dann in drei verschiedene Kategorien auf der genomischen Abstand von jedem Tag auf dem gleichen Chromosom (intrachromosomale inter-Ligation PET) oder dass beide Variablen werden auf zwei verschiedenen Chromosomen (interchromosomale inter-Ligation PETs) abgebildet basierend unterteilt. Wir haben eine CHIA-PET-Tool-Software-Paket zum Aussortieren der verschiedenen Kategorien 8 entwickelt. Dies wird auf der DNA-Fragmente, die in der Bibliothek gründen. Im Allgemeinen werden kleinere Chip-Fragmente geben eine höhere Auflösung und die sich für diese RNA Polymerase II CHIA-PET-Bibliotheken zugeschnitten ist ca. 4 kb. Darüber hinaus realen Chromatin-Wechselwirkungen von Rauschen kann durch Zählen der Anzahl von inter-Ligation Privatsphäre in einer Interaktion Cluster zu unterscheiden, mit anderen Worten, wird eine Gruppe von PET hohen Anzahl der eine höhere Wahrscheinlichkeit hat, eine echte Wechselwirkung Chromatin 8 weisen . Um unsere Fehlalarme Filter Asteigen von hoch angereichertem Anker, die inter-Ligation Privatsphäre durch Zufall entstehen kann, ist eine statistische Analyse Rahmen auch formuliert worden, um für zufällige Bildung aller zwischenzeitlich Ligation PETs zwischen zwei Ankern 8 ausmachen. Im Ergebnis ermöglicht das Chia-PET-Technik die Abbildung Chromatin Interaktion Netzwerke auf globaler Ebene. Die Umsetzung der ChIP in Chia-PET ermöglicht die Reduzierung der Komplexität und der Bibliothek Hintergrundrauschen. Darüber hinaus fügt ChIP Spezifität für Chromatin-Wechselwirkungen, so dass die Untersuchung von Wechselwirkungen mit spezifischen Chromatin bestimmte Transkriptionsfaktoren 5 zugeordnet.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Gradienten von 4-20% TBE-Gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6225BOX </td><td> Schritt B, 6.3 </td></tr><tr><td> 5 x T4 DNA-Ligase-Puffer mit PEG </td><td> Invitrogen </td><td> 46300018 </td><td> Schritt B, 2.2 </td></tr><tr><td> 6% TBE-Gel </td><td> Invitrogen </td><td> EC6263BOX </td><td> Schritt B, 6.8 </td></tr><tr><td> Agilent DNA-Test 100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-1504 </td><td rowspan="3"> Schritt B, 7,1 </td></tr><tr><td> Agilent High Sensitivity DNA-Test </td><td> Agilent Technologies </td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td> Agilent Bioanalyzer 2100 </td><td> Agilent Technologies </td><td> G2940CA </td></tr><tr><td> Reaktionsgefäßständer Filter (Spin-X) </td><td> Corning &lt;/ Td&gt; <td> CLS8160 </td><td> Schritt B, 3,7 und 6,9 </td></tr><tr><td> Dunkle Reader Transilluminator </td><td> Clare Chemical Research </td><td> DR46B </td><td> Schritt B, 6.8 </td></tr><tr><td> Digitale Sonifier Zelle Disrupter </td><td> Branson </td><td> 450D-0101063591 </td><td> Schritt A, 4.3 </td></tr><tr><td> Dynamag-2 Magneten (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 123-21D </td><td> Schritt A, 7.5.1 Schritt B für alle magnetischen Kügelchen Waschschritte </td></tr><tr><td> Dynamag-15 Magnet (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 123.01D </td><td> Schritt A, 5 und 6 </td></tr><tr><td> Dynamag-PCR (Magnetic Particle Concentrator) </td><td> Invitrogen </td><td> 49-2025 </td><td> Schritt B, 6,5 </td></tr><tr><td> Escherichia coli-DNA-Polymerase I </td><td> NEB </td><td> M0209 </td><td> Schritt B, 5.6 </td></tr><tr><td> GlycoBlue </td><td> Ambion </td><td> AM9516 </td&gt; <td> Schritt A, 7.5.1 Schritt B, 4,3 und 6,5 </td></tr><tr><td> Illumina CBOT Cluster-Generation System </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td> Schritt B, 7.4 </td></tr><tr><td> Illumina Genome Analyzer IIx </td><td> Illumina </td><td> SY-301-1301 </td><td> Schritt B, 7,5 </td></tr><tr><td> Illumina PE-Primer </td><td> Illumina </td><td> PE-102-1004 </td><td> Schritt B, 5,4 (falls erforderlich) </td></tr><tr><td> Intelli-Mixer </td><td> Palico Biotech </td><td> RM-2L </td><td> Schritt B, keine Inkubationen mit Rotation </td></tr><tr><td> LightCycler 480 Real-Time PCR-System </td><td> Roche </td><td> 04 640 268 001 </td><td> Schritt A, 7.5.3 Schritt B, 7.3 </td></tr><tr><td> LightCycler480 DNA SYBR Green I MasterMix </td><td> Roche </td><td> 03 752 186 001 </td><td> Schritt B, 7.5.3 </td></tr><tr><td> M-280 Streptavidin Dynabeads </td><td> Invitrogen </td><td> 11206D </td><td> Schritt B, 5.2 </td></tr> &lt;tr&gt; <td> Magnetische (Dynabeads) Protein G </td><td> Invitrogen </td><td> 100.03D </td><td> Schritt A, 5.1.1 und 5.2.1 </td></tr><tr><td> MaXtract High Density (2 ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129056 </td><td> Schritt A, 7.5.1 </td></tr><tr><td> MaXtract High Density (50ml) </td><td> Qiagen </td><td> 129073 </td><td> Schritt B, 4.2 </td></tr><tr><td> MmeI </td><td> NEB </td><td> R0637 </td><td> R0637 </td></tr><tr><td> RNase ONE Ribonuclease </td><td> Promega </td><td> M426C </td><td> Schritt B, 4,8 </td></tr><tr><td> RNA-Polymerase II (8WG16) monoklonaler Antikörper </td><td> Covance </td><td> MMS-126R </td><td> Schritt A, 5.2.4 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Zentrifugenröhrchen (Polypropylen) </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td> Schritt A, 3.1 </td></tr><tr><td> Oak Ridge Zentrifugenröhrchen (Teflon FEP) </td><td> Nalgene </td><td> 3114-0050 </td><td> Schritt B, 4.3 </td></tr><tr><td> PHUsIonen-High-Fidelity-Master Mix </td><td> Finnzymes </td><td> F-531 </td><td> Schritt B, 6 </td></tr><tr><td> PicoGreen (Quant-iT) dsDNA Reagenz </td><td> Invitrogen </td><td> P11495 </td><td> Schritt A, 7.5.2 </td></tr><tr><td> Polystyrol Rundboden Test Tube </td><td> BD Biosciences </td><td> 352057 </td><td> Schritt A, 4.1 </td></tr><tr><td> Protease Inhibitor Cocktail Tablets (komplett, EDTA-frei) </td><td> Roche </td><td> 11873580001 </td><td> Schritt A, 1,6 ab </td></tr><tr><td> Proteinase K-Lösung (20mg/ml) </td><td> Fermentas </td><td> E00491 </td><td> Schritt A, 4.4, 7.5.1 Schritt B, 4.1 </td></tr><tr><td> T4 DNA-Ligase </td><td> Fermentas </td><td> EL0013 </td><td> Schritt B, 2.2, 3.9 und 5.4 </td></tr><tr><td> T4-DNA-Ligase-Puffer (NEB) </td><td> NEB </td><td> B0202S </td><td> Schritt B, 3.3 und 3.9 </td></tr><tr><td> T4 DNA-Polymerase </td><td> Promega </td><td> M4215 </td><td>Schritt B, 1,2 </td></tr><tr><td> T4-DNA-Polynukleotidkinase </td><td> NEB </td><td> M0201 </td><td> Schritt B, 3.3 </td></tr><tr><td> TruSeq SBS Kit v5-GA </td><td> Illumina </td><td> FC-104-5001 </td><td> Regents für Illumina Genome Analyzer IIx-System </td></tr><tr><td> TruSeq PE Cluster Kit v2-CBOT-GA </td><td> Illumina </td><td> PE-300-2001 </td><td> auf den Einsatz mit Illumina CBOT Cluster Generation System sein </td></tr><tr><td> SYBR Green I </td><td> Invitrogen </td><td> S-7585 </td><td> Schritt B, 6.3 und 6.8 </td></tr><tr><td> XCell SureLock Mini-Cell Elektrophorese-System </td><td> Invitrogen </td><td> EI0001 </td><td> Schritt B, 6.3 und 6.8 </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td colspan="2"> Reihenfolge </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinyliertes halben Linker A (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;GG CCG CGA / iBiodT / ATC TTA TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC gereinigte Interne Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TAA GAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC-gereinigten </td></tr><tr><td rowspan="2"> Biotinyliertes halben Linker B (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;CGC GGC GA / iBiodT / ATA-CAT TCC AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC gereinigte Interne Biotin dT (9) </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;ATG GTT GGA TAT ATC GC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC-gereinigten </td></tr><tr><td rowspan="2"> Nicht biotinylierte Halb-Linker (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;GGC CGC GGA TCC ATC GAT AAC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;GTT GGA TCC ATC GAT GC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adapter A (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCC CATCTG CCT CCC TTC TGT CTC AGN N 3 &#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5&#39;CTG AGA CAG GGA GGG AAC TGG AGA GAC ACG CAG GGA TGA GAT GG 3 &#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> GS20 Adaptor B (200ng/μl) </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;CTG AGA CAC ACA GCA GGG GAT AGG CAA CAG ACA GGC GGG ATA GG 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;CCT ATC CCC GTG TGT CCT TGC CTA TCC CCT GTT TGT CTC GCG AGN N 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td rowspan="2"> Illumina-NN-Adaptern </td><td> Top- </td><td> 5 &#39;ACA CTC TTT ACG ACG CCC TAC CTC TTC CGA TC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC gereinigte Siehe Schritt B, 5,4 </td></tr><tr><td> Bot </td><td> 5 &#39;Phosphat - GAT CGG AAG AGC TCA GCA GGT GGA CCG ATG AG 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab HPLC gereinigten phosphorylierten 5&#39;-Ende Siehe Schritt B, 5,4 </td></tr><tr><td> Illumina 1-454 (Vorwärts)-Primer (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GCG GAT ACG ACC ACC ATC GAG TAC CTA ACC TCC TGC CTT CCT GTG G 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> Illumina 2-454 (Reverse)-Primer (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT CGG TCC ATC TCA TCC CTG CGT GTC 3&#39; </td><td> 250 nmol Maßstab PCR Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 1.1 (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;AAT GCG GAT ACG ACC ACC GAG bei 3&#39; </td><td> 10nmole Skala PCR Grade </td></tr><tr><td> qPCR Primer 2.1 (10 pM) </td><td colspan="2"> 5 &#39;CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA 3&#39; </td><td> 10nmole Skala PCR Grade </td></tr><tr><td> Illumina 3-454 Sequenzierprimers (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;TGC GTG TCC CAT CTG CCT CCC TTC TGT CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole Maßstab HPLC-gereinigten </td></tr><tr><td> Illumina 4-454 Sequenzierprimers (100 uM) </td><td colspan="2"> 5&#39;GTG CCT TGC CTA TCC CCT GTT TGT GCG CTC AG 3 &#39; </td><td> 100nmole SkalaHPLC-gereinigten </td></tr></tbody></table> Tabelle von Oligos und Adapter. Auftrag Oligos von Integrated DNA Technologies (IDT) und bereiten Linker und Adapter in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben 10. Half-Linker und Adapter kann vorher hergestellt werden und für mehrere Monate bei -20 ° C gelagert

chromatin interaction analysis gepaart mit end-tag-sequenzierung (chia-pet) zur abbildung von chromatin-wechselwirkungen zu verstehen und transkriptionsregulation

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genome werden in dreidimensionale Strukturen auf, die zur Annahme höherer Ordnung Konformationen innerhalb der Mikrometergröße nuklearen Räumen 7, 2, 12. Solche Architekturen sind nicht zufällig und beinhalten Wechselwirkungen zwischen Gen-Promotoren und regulatorische Elemente 13. Die Bindung von Transkriptionsfaktoren an regulatorische Sequenzen bewirkt ein Netzwerk der Transkriptionssteuerung und Koordinierung 1, 14. Chromatin Interaction Analysis von Paired-End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) wurde entwickelt, um erkennen diese höherer Ordnung Chromatinstrukturen 5,6. Die Zellen werden fixiert und wechselwirkenden Loci durch kovalente DNA-Protein-Vernetzungen erfasst. Um nicht-spezifische Geräusche zu minimieren und die Komplexität zu reduzieren, sowie um die Spezifität des Chromatins Interaktionsanalyse zu erhöhen, wird Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) gegen spezifische Protein-Faktoren verwendet, um Chromatin-Fragmente von Interesse vor Ligationssysteme bereichern. Ligation mit Halb-Linker bildet anschließend kovalente Verbindungen zwischen Paaren von DNA-Fragmenten zusammen innerhalb einzelner Chromatin-Komplexe gebunden. Die flankierenden MmeI Restriktionsenzymstellen in den Halb-Linker erlauben Extraktion von gepaarten End-Tag-Linker-Tag-Konstrukte (PET) auf MmeI Verdauung. Da die halbe Linker biotinyliert werden, werden diese PET-Konstrukte unter Verwendung Streptavidin-magnetischen Kügelchen. Die gereinigten Haustiere sind mit Next-Generation-Sequencing-Adapter und einem Katalog von wechselwirkenden Fragmente erfolgt über Next-Generation-Sequenzern wie dem Illumina Genome Analyzer generiert ligiert. Mapping und bioinformatische Analyse wird dann durchgeführt, um ChIP angereicherte Bindungsstellen und Chip-angereicherten Chromatin-Wechselwirkungen 8 zu identifizieren. Wir haben ein Video produziert, um kritische Aspekte des Chia-PET-Protokoll, insbesondere die Vorbereitung der ChIP demonstrieren, wie die Qualität von CHIP spielt eine wichtige Rolle für das Ergebnis eines CHIA-PET-Bibliothek. Da die Protokollesehr lang, werden nur die kritischen Schritte in dem Video gezeigt.

Chromatin Interaction Analysis von Paired-End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) ist eine Methode zur<em&gt; De-novo-</em&gt; Nachweis von Chromatin-Wechselwirkungen, zum besseren Verständnis der transkriptionellen Kontrolle.

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Genome sind in dreidimensionalen Strukturen organisiert und nehmen innerhalb der mikrometergroßen Kernräume höhergeordnete Konformationen ein 7, 2, 12. Solche ...

Die COMIN-Interaktionsanalyse unter Verwendung von Powder- und Tag-Sequenzierung ist eine Methode zur genomweiten Analyse langreichweitiger COMIN-Interaktionen. Kurz gesagt, nennen wir dies Magic Share Pad. Diese Methode umfasst zahlreiche molekularbiologische Schritte und kann kompliziert sein.Daher zeigen wir in diesem folgenden Video einige der wichtigsten Schritte, die bei der Chromatin-Immunpräzipitation und der Bibliothekskonstruktion für die ChIP-PET-Analyse durchgeführt werden. Die Chromatin-Immunpräzipitation, auch als ChIP bekannt, ist der erste entscheidende Schritt bei der Erstellung einer ChIP-PET-Bibliothek. Dabei werden Chromatinproben aus Zellkulturen vernetzt, sonifiziert und immunpräzipitiert.Anschließend werden separate Aliquote der Chip-DNA an barcodierte Halb-Linker ligiert, und die Ligierung unter räumlicher Nähe (Proximity-Ligation) wird durchgeführt. Die PETs werden durch Restriktionsverdauung freigesetzt, an beschichteten magnetischen Perlen gereinigt und an Adapter für die Sequenzierung der nächsten Generation ligiert. Chimäre ChIA-PETs werden über die AB-Linker-Zusammensetzung und flankierende Tags identifiziert.Die zentrale Linkersequenz wird ausgelesen und auf das Genom abgebildet. In diesem Video zeigen wir den Standard-ChIP-Protokoll, das routinemäßig in unserem Labor an der Brustkrebszelllinie MCF7 verwendet wird. Aus unseren Daten geht hervor, dass eine stärkere ChIP-Anreicherung mit spezifischen Antikörpern bessere ChIA-PET-Daten liefert. Daher empfehlen wir dringend die Optimierung des ChIP-Protokolls sowie die Validierung der Anreicherung mittels qPCR.Bevor mit dem Aufbau der Chair-PET-Bibliothek fortgefahren wird, werden CF7-Zellen in einer 500 cm² großen Zellkulturschale bis zu einer Konfluenz von etwa 75 % kultiviert, was ungefähr 20 Millionen Zellen vor der Vernetzung entspricht. Entsorgen Sie das Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit warmer PBS. Fixieren Sie die Zellen mit frisch zubereiteten 1,5 mmol EGS für 45 Minuten auf einem Rotator bei Raumtemperatur, geben Sie anschließend 37 % Formaldehyd hinzu, um eine Endkonzentration von 1 % zu erreichen, und inkubieren Sie für 20 Minuten.Die Vernetzungseffizienz ist entscheidend und variiert je nach Zelllinie und dem Protein von Interesse. Die Konzentration, Inkubationszeit und Temperatur für die Vernetzung sollten optimiert werden. Quenchen Sie die Vernetzer mit einer Endkonzentration von 200 Millimolar Glycin für 10 Minuten.Entsorgen Sie die abgeschreckten Vernetzer und waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem PBS. Sammeln Sie die Zellen durch Abkratzen des Pellets mit einem gekühlten Tischzentrifugen. Das Pellet ist nun bereit für die Zelllyse. Alternativ können Sie das Pellet bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Falls das Zellpellet eingefroren ist, tauen Sie es auf Eis auf und resuspendieren Sie das Pellet in 0,1 % SDS-Lysepuffer, bevor Sie mit der Zelllyse fortfahren.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius mit einer gekühlten Zentrifuge, verwerfen Sie das Überstand und wiederholen Sie die Zelllyse. Führen Sie die nukleäre Lyse durch, um vernetztes Chromatin freizusetzen, bevor das Chromatin fragmentiert wird. Das Fehlen der nuklearen Membran ermöglicht es, das vernetzte Chromatin unter schonenderen Bedingungen zu sonifizieren.Wiederholen Sie die Band-Nuklearpalette in 1 % SDS-Lysepuffer. Überführen Sie die Suspension in ein Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen. Drehen Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius.Entfernen Sie nuklearen Zelltrümmern durch Zentrifugation. Die chromatische Palette sollte folgendermaßen aussehen. Verwenden Sie eine P-1000-Pipettenspitze, um die Palette in Stücke zu zerlegen, und waschen Sie sie zweimal mit 0,1 % SDS-Lysepuffer.Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius mit einer gekühlten Zentrifuge. Das nukleäre Pälatin ist nun bereit für die Sonikation. Alternativ können Sie das Pälatin bei minus 80 Grad Celsius einfrieren.Überführen Sie das Gaumendach in ein klares Röhrchen. Geben Sie 0,1 % SDS-Lysepuffer zum Gaumendach hinzu und entfernen Sie alle Luftblasen. Halten Sie die Proben während der Beschallung stets kühl, um eine Überhitzung zu vermeiden. Verschiedene Bedingungen wie Puffervolumen, Sondentiefe, Beschallungsstärke, Anzahl der Zyklen und Ausmaß der Vernetzung können die Effizienz der Beschallung beeinflussen.Reversieren Sie die Vernetzung und aliquotieren Sie das Chromatin unter Verwendung von Proteinase K und führen Sie ein Agarosegel durch. Zur Überprüfung der Fragmentierungseffizienz wird eine Optimierung empfohlen, um den gewünschten DNA-Größenbereich zwischen 200 und 600 Basenpaaren zu erhalten. Entfernen Sie Zelltrümmer durch Zentrifugation.Das Chromatin ist nun bereit, mit magnetischen Kügelchen vorgereinigt zu werden. Alternativ kann die Probe bis zur Sammlung einer ausreichenden Menge Chromatin bei minus 80 Grad Celsius angehalten werden. Um einen ChIP zu beginnen, waschen Sie die Kügelchen dreimal mit Kügelchen-Waschpuffer; diese und alle zukünftigen Waschschritte mit magnetischen Protein-Kügelchen umfassen die folgenden Schritte.Fügen Sie sonifiziertes Chromatin zu den vorgewaschenen Kügelchen hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius in einem separaten Gefäß. Beschichten Sie die vorgewaschenen Kügelchen mit Antikörper und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Waschen Sie die mit Antikörper beschichteten Kügelchen zweimal mit Kügelchen-Waschpuffer.Die hohe Komplexität des Substrats für die Proximity-Ligation führt zwangsläufig zu erheblichem unspezifischem Rauschen, wodurch die Sequenzierungskosten steigen. Neben der Verringerung der Komplexität und des Hintergrundrauschens verwendeten wir einen monoklonalen Maus-Antikörper gegen RNA-Polymerase zwei, um Chromatin-Interaktionen zu identifizieren, die an der Transkriptionsregulation beteiligt sind.Dies ermöglicht die Untersuchung aktiver Promotoren und ihrer entsprechenden regulatorischen Regionen und erlaubt so das Verständnis effizienter und möglicherweise kooperativer Transkription. Verwerfen Sie den Waschpuffer von den Antikörper-beschichteten Perlen, kombinieren Sie das vorab gereinigte Chromatin mit den antikörperbeschichteten Perlen und inkubieren Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Nach der Über-Nacht-Inkubation werden die Perlen einer Reihe von Waschschritten unterzogen, um ungebundenes Chromatin zu entfernen, und anschließend in TE-Puffer alikquotiert. Eine geringe Menge wird für die quantitative und Anreicherungs-Überprüfung verwendet. Die Analyse chromosomaler Interaktionen mittels PAD- und TAG-Sequenzierung ist eine Technik, die für die umfassende de-novo-Analyse wechselwirkender Chromatinstrukturen höherer Ordnung entwickelt wurde.DNA-Fragmente, die durch Chromatin-Immunpräzipitation angereichert wurden, werden mittels Ligationsreaktion in räumlicher Nähe erfasst. Die Pad- und Tag-Strategie wird bei der Konstruktion von CHI-PET-Bibliotheken angewandt, die mittels Hochdurchsatz-Next-Generation-Sequenzierungstechnologien sequenziert werden. In diesem Video zeigen wir die entscheidenden experimentellen Aspekte bei der Erstellung von CHI-PET-Bibliotheken.Die erste Hälfte der Bibliothekskonstruktion umfasst die Manipulation von Protein A- oder G-Kügelchen, an die die DNA-Fragmente gebunden sind, um die Enzyme und Puffer-Salze zu entfernen. Nach jeder enzymatischen Reaktion Zentrifugation mit geringer Kraft und vorsichtiges Schwenken für jeden Waschschritt verwenden. Den Überstand mehrmals pipettieren, um die Erfassung der Kügelchen zu maximieren, wenn sie auf einem magnetischen Partikel platziert werden.Zentrifugieren Sie bei allen Inkubationsschritten, die Kügelchen in der Reaktionsmischung enthalten. Bereiten Sie die Master-Mix-Lösung im Voraus vor und geben Sie das Enzym zuletzt hinzu, nachdem die Kügelchen gleichmäßig resuspendiert wurden. Stellen Sie sicher, dass die Kügelchen während der gesamten Inkubation gut durchmischt sind. Die halben Linker-Oligonukleotide sind mit einem internen Barcode aus vier Nukleotiden sowie einer Erkennungsstelle für das Typ-II-Restriktionsenzym MME1 konstruiert.Nachdem die Halb-Linker an die gebundenen DNA-Fragmente in C-chromatischen Komplexen ligiert wurden, werden die wechselwirkenden DNA-Fragmente über eine vollständige Linkersequenz verbunden. Diese Halb-Linker erzeugen Sequenzen mit heterodimeren ab-Linkern, die aus unspezifischen Ligationsprodukten stammen, oder Sequenzen mit homodimeren AA- oder BB-Linkern, die aus spezifischen Ligationsprodukten hervorgehen. Daher ermöglicht die Verwendung zweier Halb-Linker mit unterschiedlichen Nukleotid-Barcodes die Unterscheidung verschiedener Experimente oder Replikate sowie die Überwachung der unspezifischen chimären Ligationsraten zwischen verschiedenen Chip-Komplexen.Es ist wichtig, die Reaktion auf Eis einzurichten und die Halb-Linker vorsichtig auf Eis auftauen zu lassen. Kombinieren Sie die Halb-Linker zunächst gut mit Wasser und anschließend mit einem PEG-haltigen Ligasepuffer. Stellen Sie sicher, dass die Master-Mix gut vermischt ist, bevor die Resuspension erfolgt.Den Chip-DNA mit T4-DNA-Ligase suspendieren, erst nachdem die halben Linker und Chip-DNA-Fragmente gut vermischt wurden, um eine Verkettung der halben Linker zu verhindern. Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm und inkubieren Sie über Nacht bei 16 Grad Celsius unter Rotation. Intakte Chromatin-Komplexe werden anschließend durch Zugabe von SDS im Puffer EB von der Kugel eluiert, um die SDS-Konzentration zu senken, und durch Zugabe von Triton X-100 wird das gesamte SDS neutralisiert. Die Zirkularisierung der Chromatin-Komplexe wird durch die Ligierung zweier halber Linker erleichtert, wodurch am Interaktionsübergang eine vollständige Linker-Sequenz entsteht. Ligieren Sie die eluierten Chromatin-Komplexe unter extrem verdünnten Bedingungen, um Ligierungen zwischen verschiedenen DNA-Protein-Komplexen zu minimieren, mit T4-DNA-Ligase erst, nachdem die eluierten chromatischen Komplexe in der Reaktionsmischung gut verdünnt wurden. Nach dem Reverse Cross-Linking, um assoziierte Proteine von der DNA zu entfernen, reinigen Sie die zirkularisierten DNA-Fragmente mittels Phenol-Chloroform-Extraktion. Verwenden Sie das KaiGen Phase-Lock-Gel-System für eine einfache Trennung.Nach der Phenolextraktion verwenden Sie GlycoBlue, einen DNA-Träger, um die Masse und Sichtbarkeit des Palates zu erhöhen. Halbe Linker-Oligonukleotide enthalten flankierende MmeI-Erkennungsstellen. MmeI, eine Typ-II-S-Restriktionsendonuklease, schneidet 18 und 20 Basenpaare stromabwärts ihrer Zielbindungsstellen, um kurze Tags des Chromatinfragments zu erzeugen, wodurch PET-Tag-Linker-Tag-Konstrukte entstehen, abgekürzt als PETs.Zusätzlich wird jeder Halb-Linker mit Biotin modifiziert, um die Reinigung der Pet-Konstrukte mittels mit Streptavidin beschichteter magnetischer Kügelchen zu ermöglichen. Führen Sie einen MME-One-Schnitt durch, um die Tag-Linker-Konstrukte freizusetzen. Reinigen Sie die Pets durch selektive Bindung an gebundene Aden-Kügelchen und ligieren Sie die Pet-Konstrukte mit Adaptern für die Hochdurchsatzsequenzierung.Verwenden Sie eine Fusions-DNA-Polymerase, um die CHI PET Library Fusion zu amplifizieren. Die DNA-Polymerase wird verwendet, um Vorlagen mit hoher Genauigkeit und Effizienz zu erzeugen. Richten Sie die PCR-Reaktion kalt ein und geben Sie die Fusions-DNA-Polymerase zuletzt hinzu.Da das Enzym eine 3' zu 5'-Exonuklease-Aktivität aufweist, die Primer in Abwesenheit von DNTPs degradieren kann. Wenn die CHAMP-Bibliothek erfolgreich konstruiert wurde, sollte ein deutliches, scharf begrenztes Band bei etwa 223 Basenpaaren sichtbar sein. Vermeiden Sie unspezifische Banden beim Ausschneiden des 223-Basenpaar-Bandes aus dem Gel und reinigen Sie das ausgeschnittene Band mithilfe des Gel-Crush-Protokolls.Führen Sie eine Qualitätskontrolle mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer und einem DNA 1000 Kit vor der Hochdurchsatzsequenzierung durch. Wir haben soeben das CHI-PET-Verfahren zur unvoreingenommenen Detektion chromosomaler Wechselwirkungen im gesamten Genom demonstriert. Die Qualität der CHI-PET-Daten hängt von der Wirksamkeit des verwendeten Chip-Antikörpers und der Sequenziertiefe ab.Hier verwenden wir 18 bis 20 Millionen Reads für die Interaktionskartierung. Dieses spezifische Protokoll wurde bereits erfolgreich zur Charakterisierung von Chromatin-Interaktionsnetzwerken eingesetzt, die durch den Östrogenrezeptor und die RNA-Polymerase im menschlichen Genom gebunden sind. Wir erwarten, dass dieser Assay nach den Untersuchungen zur dreidimensionalen Architektur der Transkriptionsbiologie im gesamten Genomkontext ein leistungsfähiges Werkzeug für zukünftige Studien sein wird.Wir hoffen, dass dieses Video für Sie nützlich sein wird. Vielen Dank fürs Zuschauen.I.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Die Kombination von Chromatinimmunpräzipitation und ultra-Sequenzierung mit hohem Durchsatz (Chip-seq) zu identifizieren und abzubilden Protein-DNA-Wechselwirkungen in einem bestimmten Gewebe oder Zelllinie. Skizziert ist, wie man eine hohe Qualität ChIP Vorlage für anschließende Sequenzierung mit Erfahrung mit dem Transkriptionsfaktor TCF7L2 als Beispiel zu generieren.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

Die Frage, wie Chromatin Regulierungsbehörden und Chromatin-Staaten betreffen das Genom in vivo ist der Schlüssel zum Verständnis, wie frühe Zellschicksal Entscheidungen werden in den sich entwickelnden Embryo gemacht. ChIP-Seq-die beliebteste Ansatz zur Chromatin Funktionen auf globaler Ebene, wird hier für Xenopus Embryonen beschrieben untersuchen.

Genomweite Snapshot von Chromatin Regulierungsbehörden und Staaten in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen von ChIP-Seq

Chromatinimmunpräzipitation ist eine leistungsstarke Technik zur Identifizierung von DNA-Bindungsstellen von Arabidopsis-Proteine ​​in vivo. Dieses Verfahren besteht aus Chromatin Vernetzung und Fragmentierung, Immunopräzipitation mit selektiver Antikörper gegen das Protein von Interesse und qPCR-Analyse der gebundenen DNA. Wir beschreiben eine einfache ChIP Assay für Arabidopsis-Pflanzen optimiert.

Chromatinimmunpräzipitation Assay zur Identifizierung von Arabidopsis-Protein-DNA-Wechselwirkungen<em&gt; In-vivo-</em

Wir beschreiben die Chromatin-endogene Spaltung, gekoppelt mit der Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChEC-seq), einer Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) -orthogonalen Methode zur Kartierung von Proteinbindungsstellen genomweit mit Mikrokokken-Nuklease (MNase) -Fusionsproteinen.

Genom-weite Abbildung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier beschreiben wir eine optimierte Hochdurchsatz-ChIP-Sequenzierung Protokoll und rechnerische Analysen Pipeline für die Bestimmung der genomweiten Chromatin Zustand Muster von gefrorenen Tumorgewebe und Zell-Linien.

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.

CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen

Die Kennung der physikalischen Wechselwirkungen zwischen Genen und regulatorische Elemente ist anspruchsvoll aber erfassen Bezahlungsmethode Chromosom Konformation erleichtert worden. Diese Modifikation des 4C-Seq-Protokolls mildert PCR Bias durch Minimierung der Überverstärkung PCR-Vorlagen und maximiert die Mappability von Lesevorgängen durch den Einbau eines Zusatz Restriktionsenzym verdauen Schritt.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

Wir beschreiben eine Schritt für Schritt Protokoll für Tandem Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung (tChIP-Seq), die es die Analyse der Zelle-typspezifischen genomweite Histon-Modifikation ermöglicht.

TChIP-Seq: Cell-Type-Specific Epigenom Profilierung

Eine präzise Bestimmung von Proteinbindungsstellen im genomischen Ist wichtig für das Verständnis der Genregulation. Hier beschreiben wir eine genomische Kartierungsmethode, die chromatinimmunpräzipierte DNA mit Exonukleaseverdauung (ChIP-exo) behandelt, gefolgt von hochdurchsatzhoher Sequenzierung. Diese Methode erkennt Protein-DNA-Wechselwirkungen mit nahezu Base-Pair-Mapping-Auflösung und einem hohen Signal-Rausch-Verhältnis in Säugetierneuronen.

Hochauflösende Kartierung von Protein-DNA-Wechselwirkungen in Mausstammzell-abgeleiteten Neuronen mit Chromatin-Immunpräzipitation-Exonuklease (ChIP-Exo)

Hier stellen wir ein schnelles und einfaches ATAC-seq-Protokoll vor, das im L4-Stufen-Caenorhabditis elegans-Ganzwurm mit nur 30 μL Wurmpellet implementiert werden kann.

Chromatin-Barriereprofilierung bei ganzen L4-Larven von Caenorhabditis elegans

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erfassung RNA-assoziierter Chromatin-DNA-Interaktionen zur Kartierung der RNA-bezogenen dreidimensionalen Genomorganisation.

RNA-assoziierte Chromatin-DNA-Interaktionsmethode

Erfahren Sie die ChIA-PET-Methode zur Analyse von Chromatin-Wechselwirkungen und Transkriptionsregulation. Dieses Protokoll zeigt Chromatin-Immunpräzipitation, Proximity-Ligation und Bibliotheksaufbau für genomweite Studien.

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation (Video) | JoVE Journal

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

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