Name: Mausmodell von Allergen-induzierte Asthma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie ein Mausmodell von allergen-induziertem Asthma entwickelt wird, um Immunantworten und Atemwegsentzündungen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Zellinfiltration und IgE-Spiegeln.

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Diese Arbeit wurde vom NIH Grant HL093196 (RCR) und den Atlanta Research and Education Foundation (AREF) unterstützt.

I. Sensibilisierung und Allergen-Challenge (siehe Abbildung 1) A. Für Intratracheale Herausforderung <ol><li> Für die anfängliche Sensibilisierung, injizieren männliche oder weibliche C57BL / 6 oder BALB / c Mäuse (6-8 Wochen alt) intraperitoneal an Tag 0 und wieder am Tag 7 mit 20 ug Ovalbumin (OVA, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emulgiert in 0,2 ml steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), enthaltend 2 mg Aluminiumhydroxid (Sigma-Aldrich) oder mit 2 mg Aluminiumhydroxid in 0,2 ml steriler PBS als Kontrolle. </li><li> Herausforderung mit Antigen gegebenenfalls (z. B. an den Tagen 14, 16, 18 und 20). Challenge-Verfahren folgt. </li><li> Anesthetize Maus mit einer intraperitonealen (ip) Injektion einer Mischung aus Ketamin (90 mg / kg) und Xylazin (10 mg / kg). Stellen Sie sicher, die Maus ist voll narkotisiert für mindestens 10 min. </li><li> Betätigungsfläche Winkel von 45 Grad oder mehr. Bewegen Sie die Maus auf dieser Oberfläche zu halten Bauchseite nach oben und den Kopf oben. </li><li> Haken thread unter vorderen Schneidezähnen an den Kopf nach hinten halten. Stufe die Pfoten miteinander, um sicherzustellen, der Luftröhre ist gerade und verwenden Etikettenband zu den Beinen halten. Weichen Sie Operationsstelle mit 70% EtOH und Tupfer. </li><li> Anwenden Bupivacain (0,1 bis 0,2 ml 0,25% ige Lösung) topisch an der Einschnittstelle. </li><li> Nip Haut an der Kehle mit einer Pinzette und ziehen Sie vorsichtig nach außen. Machen Sie einen kleinen vertikalen Schnitt mit Scheren. Minimieren Größe des Einschnitts. </li><li> Bereiten Sie eine 1 ml Spritze mit 50 ul PBS oder 0,1% OVA in PBS und legen Sie sie in einem sich wiederholenden Pipette (Tridak Stepper, Torrington, CT). Nehmen Sie die Pipette in der einen Hand und mit der anderen, um das Gewebe zurückhalten mit der Pinzette und setzen die Luftröhre. </li><li> Halten Sie die Spritze als parallel zur Luftröhre wie möglich, legen Nadel durch Tracheawand und injizieren Sie die Lösung. </li><li> Pflegen Maus in einer vertikalen Ausrichtung nach der Injektion zu Zeit zur Herstellung einer in der Lunge absetzen können. </li><li> Sanft und steril nahe Wundgebiet mitPinzette und Dichtung mit Naht. </li><li> Bewegen Sie die Maus Brustbein-down auf einem Heizkissen und lassen Sie es bis zur vollständigen ambulanten erholen. Nach der Erholung, kehren die Maus in die Tierstation und überwachen sie täglich auf Anzeichen von Serom, Entzündung oder Infektion, und Wunddehiszenz, bis die Wunde vollständig verheilt ist. </li></ol> B. Für die Herausforderung durch Vernebelung <ol><li> Sensibilisieren Mäusen am Tag 0 durch intraperitoneale Injektion von 20 ug OVA (Sigma-Aldrich) in 0,2 ml steriler PBS, enthaltend 2 mg Aluminiumhydroxid (Sigma-Aldrich) oder mit 2 mg Aluminiumhydroxid in 0,2 ml steriler PBS emulgiert als Kontrolle . </li><li> Am Tag 14 zu erhöhen Sensibilisierung durch ip-Injektion, wie oben beschrieben. </li><li> Am 21., 22., 23., 24. und 25. Tag nach der anfänglichen Sensibilisierung, Mäuse Herausforderung durch die Exposition für 30 min bis 1% vernebelten OVA oder PBS allein über einen Ultraschall-Vernebler (Buxco Research Systems, Wilmi geliefertngton, NC). </li><li> Ort Mäuse in der Hauptkammer des WBP, akklimatisieren sie innerhalb der Plethysmographie Kammer für mindestens 10 min. </li><li> Platz 1 ml 0,1% OVA in sterilem PBS oder sterilem PBS allein, wie in den Schritten 4-6 beschrieben, über einen Vernebler Tasse. Inhalationsgerät für 30 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Verneblerbecher verbleibende Lösung. </li><li> Vernebelung kann bei den Mäusen gleichzeitig unter Verwendung eines Zerstäubungs Kammer durchgeführt werden. </li></ol> II. Bestimmung der Atemwegshyperreaktivität zu Methacholin A. Nicht invasive Messung der Überempfindlichkeit der Atemwege durch Ganzkörper-Plethysmographie (WBP; Buxco Research Systems, Wilmington, NC) <ol><li> Lassen Sie das pulverisierte Methacholin Flasche auf Raumtemperatur aufwärmen vor dem Öffnen (Methacholin ist sehr hygroskopisch und wird nutzlos, Klumpen zu bilden, wenn erlaubt, Wasser zu absorbieren). Bereiten Sie eine 200 mg / ml Stammlösung in sterilem PBS, dann machen serielle 2-fache Verdünnungen (zB 100, 50, 25, 12,5 und 60,25 mg / ml). Halten Lösungen kalt. </li><li> Richten Sie Geräte wie folgt: connect Haupteinlass der WBP zu Vernebler, Bias-Flow Einlass zum Luftpumpe, und WBP Steckdose zu Gasfalle mit eng anliegenden Gummischlauch. Bringen Sie Druckaufnehmer, um die Ausgänge der Haupt-und Referenz-Kammern des WBP zu überbrücken. Schließen Sie Druckwandler Vorverstärker mit den mitgelieferten Kabel, und verbinden Vorverstärker an den PC unter Verwendung spezifischer Daten-Übernahme-Karte. </li><li> Kalibrieren Sie den Vorverstärker mit Hilfe der Software gemäß den Empfehlungen des Herstellers. </li><li> Ort Mäuse in der Hauptkammer des WBP, akklimatisieren sie innerhalb der Plethysmographie Kammer für mindestens 10 min, dann Rekord Grundlinie Lesungen (Penhbase) für 3 min. </li><li> Platz 1 ml steriler PBS in der Verneblerbecher. Vernebeln für 2 min und dann überwachen respiratorischen Variablen für einen zusätzlichen 6 min während der Trocknungsphase. Entfernen und entsorgen Verneblerbecher alle verbleibenden PBS. </li><li> Platz 1 ml 6,25 mg / ml in der Methacholin Verneblerbecher und rEPEAT Vernebelung für 2 Minuten plus einer 6-Minuten-Monitoring-Zyklus. </li><li> Wiederholen Sie die Messung mit 12,5, 25, 50 und 100 mg / ml Methacholin, mit dem gleichen 2-min-Periode Vernebelung und 6-Minuten-Monitoring-Zyklus. </li><li> Entfernen Sie die Mäuse aus den Kammern auf und schickt sie in ihre Käfige. </li><li> Refill Verneblerbecher mit 1 ml sterilem PBS und führen Sie eine weitere Sequenz, um den Schlauch zu spülen. </li><li> Beenden Sie die Luftströme, zerlegen, reinigen und wischen alle Kammern, bevor Sie einen zweiten Satz von Tieren. </li></ol> B. invasive Messung der Atemwegsempfindlichkeit durch Computer-gesteuerte Ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Kanada) <ol><li> Wiegen Sie die Maus und betäuben durch intraperitoneale (ip) Injektion von 60 mg pro kg Körpergewicht Pentobarbital-Natrium. </li><li> Im Anschluss an eine adäquate Anästhesie, Position die Mäuse ventro-dorsal zur Tracheotomie. </li><li> Desinfizieren Sie die Haut des Halses mit 70% Ethanol. Anwenden Bupivacain (0,1 bis 0,2 ml 0,25% ige Lösung) topisch an der incision Website. Einschneiden und öffnen Sie die Haut des Halses. Trennen Sie die Nackenmuskulatur und setzen die Luftröhre. </li><li> Machen Sie eine 1 - bis 2-mm-Schnitt in der Luftröhre mit einer feinen Schere (nicht sicher sein, um die Luftröhre zu durchtrennen) und stecken Sie den Trachealtubus vorsichtig. Binden Sie eine Naht um die Luftröhre, um eine Undichtigkeit zu verhindern. </li><li> Legen Sie die Maus in die Bodyplethysmographen Kammer und schließen Sie das eingefügt Trachealtubus mit dem Beatmungsgerät. </li><li> Starten mechanischen Beatmung. Festlegen geeigneter Atemfrequenz und Gezeiten / Hubvolumen (150 Hübe / min und 200 ul bzw. für eine 20-g-Maus). Achten Sie darauf, dass der Brustkorb wird synchron bewegt sich mit dem Beatmungsgerät. Wenn die Maus &quot;kämpfen&quot; wird mit dem Ventilator (Selbst-Atmung), injizieren mehr Betäubung und warten Sie für die Synchronisation. </li><li> Nach Baseline-Messungen, halten Mäuse unter Baseline-Belüftung für eine weitere 3 min, und von dort aus 2 nd der Impedanzmessungen gesetzt. Diese 2 nd der Baseline-Messungen eingestellt ist, dass Calc verwendetulate Der durchschnittliche Ausgangswert Werte. </li><li> Deliver PBS oder Methacholin (MCH) Herausforderungen (6,25, 12,5, 25, 50 und 100 mg / ml) durch die Kanalisierung inspiratorischen Flow aus dem Ventilator durch einen Ultraschall-Vernebler. </li><li> Im Anschluss an jede Herausforderung mit MCH (6,25, 12,5, 25, 50 und 100 mg / ml), Rückkehr in den Kolben, um die Bereitstellung einer VT von 10 ml / kg bei 120 Atemzüge / min und nehmen Impedanzmessungen. </li></ol> III. Die Messung der zellulären Infiltration in den Luftraum A. Führen Sie bronchoalveolären Lavage (BAL) <ol><li> Nach der Messung der AHR, einschläfern Mäuse mit CO 2, und positionieren Sie jede Maus auf dem Rücken auf dem OP-Pad. </li><li> Weichen Sie den Bereich mit 70% EtOH. </li><li> Beginnend am unteren Abdomen, schnitt den Bauchraum und zu entfernen Haut / obere Muskel, hangaufwärts in Richtung der Rippen. </li><li> Sobald die Rippen sichtbar sind, mit einer Schere vorsichtig die Membran durchstechen. Lungen sollte verdecken von der Membran weg. Seien Sie besonders ca.umsichtig nicht auf nick die Lunge oder Herz. </li><li> Schneiden Sie den Brustkorb, um die Lunge vollständig freizulegen / Herz (Schneiden zu vermeiden, keine größeren Blutgefäße, um Blut aus Füllen der Stelle zu halten). </li><li> Mit einer 1 ml Spritze mit einer 27 Gauge-Nadel (BD Spritzen, Franklin Lakes, NJ), durchstechen die Herzkammern und langsam und vorsichtig nach hinten ziehen Sie die Spritze, um das Blut zu sammeln. Darauf achten, dass das Herz kollabiert. </li><li> Sammeln Sie das Serum aus diesem Blut unter Verwendung von Standard-Protokoll. Lagerung bei -70 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Schneiden Sie Haut und Gewebe aus der Kehle, bis die Luftröhre wird enthüllt. Räumen Sie ausreichend Gewebe zu leicht arbeiten innerhalb des Feldes (wieder, vermeiden Schneiden keine größeren Blutgefäße). </li><li> Mit einer gebogenen Schere, unter der Luftröhre geschnitten, um einen Pfad zu löschen. </li><li> Führen Sie die Spitze einer gebogenen Pinzette unter der Luftröhre und fassen Sie das Ende von einem Stück Faden. Zeichnen Sie den Faden unter der Luftröhre. </li><li> Binden Sie einen lockeren halben Knoten über der Luftröhre, geringer in der Kehle. </li><li> CarefUlly schnitt eine Kerbe, in ausreichender Größe für die Kanüle, über dem Faden. </li><li> Setzen Sie vorsichtig die Kanüle in das Loch hinunter und die Luftröhre über den Punkt der Faden. Leicht nach vorne drücken, bis die Kanüle entsteht gerade am Eingang zu den Lungen (zu weit: Punktion Lungen; zu kurz: Zusammenbruch Luftröhre beim Versuch sich zu erholen BAL). </li><li> Ziehen Faden und Knoten, um komplette Luftröhre herum Kanüle zu versiegeln. </li><li> Lock-Spritze (1 ml PBS) an der Kanüle und vorsichtig auf die Flüssigkeit in der Lunge. Lungenlappen sollte individuell langsam aufzublasen. Nicht über-Füllung. Für einen ausgewachsenen Maus 0,9-1,0 ml ist das absolute Maximum. 0,8 ml sicherer sein kann. Lock Spritze lose an der Kanüle, sonst ist die Wahrscheinlichkeit eines Schadens bei dem Versuch, zu lösen. </li><li> Ziehen Flüssigkeit aus den Lungen. Wird ein Widerstand angetroffen (Gewebe in Kanüle gesaugt), drücken Kanüle langsam weiter in die Lunge und wieder entfernen. Ebenfalls um die Kanüle an Ort und Stelle. Wenn alle ELSe ausfällt, ziehen Sie die Kanüle einen Teil des Weges, der Luftröhre ist viel wahrscheinlicher, in diesem Fall zusammenbrechen. </li><li> Trennen Sie Spritze von der Kanüle, Kaution BAL-Flüssigkeit in Behälter, und wiederholen Sie 2 mal mit frischem PBS-Lösung. </li><li> Halten Sie die BAL-Lösung auf Eis, bis abzentrifugiert. </li><li> Verwenden Sie die BAL-Flüssigkeit und Serum, die OVA-spezifischen IgE mit kommerziell erhältlichen ELISA-Kits Maus-IgE (MD Bioproducts, St. Paul, MN) zu messen. </li></ol> B. Zählen von Zellen und Bestimmen Differenziale <ol><li> Zentrifugieren Sie die BAL-Flüssigkeit 5 min bei ~ 600 × g, 4 ° C </li><li> Das Zellpellet sanft in PBS und halten Sie auf dem Eis. </li><li> Legen Sie eine Standard-Neubauer Hämazytometer mit der verdünnten Zellsuspension und zählen die Zellen. </li><li> Entfernen Sie Aliquots von 2 × 10 4 Zellen in 10 bis 40 ul Volumen für Zytospins. Verdünnen Sie Zellen, wenn nötig. </li><li> Für Zytospins, mischen Sie 2 x 10 4 Zellen, 130 ul PBS und 10 ul FBS. Fügen gesamte Zelle Mischung zu double Zytospin Trichter und Zentrifuge 10 min bei 700 rpm, mit doppelseitigem cytoslides für Doppelproben. </li><li> Die Objektträger bei Raumtemperatur für 1 h vor dem Färben trocknen. </li><li> Stain Den Objektträger mit Hilfe Diff-Quick-Färbung (Siemens, Newark, DE). </li></ol> IV. Repräsentative Ergebnisse Übermäßige Verengung der Atemwege nach provokativen Reizen ist ein hervorstechendes Merkmal der klinischen Asthma. Wir beschreiben zwei Methoden zur Messung solcher Atemwegshyperreaktivität zu Methacholin in OVA-sensibilisierten und provozierten Mäusen: Ganzkörper-Plethysmographie (Abbildung 2) und erzwungenen Schwingung mit der flexiVent System (Abbildung 3). Beide Methoden zeigen, dass OVA Sensibilisierung und Herausforderung Atemwegshyperreaktivität in Mäusen erzeugt. Eosinophilen-reiche Entzündung der Atemwege ist ein weiteres hervorstechendes Merkmal der sowohl klinisch als Asthma und allergische Atemwegserkrankungen bei Mäusen. Wie in 4 gezeigt </strong&gt;, OVA Sensibilisierung und Herausforderung erhöht die Gesamtzahl der Zellen, die aus den Atemwegen von BAL wiederhergestellt werden können. Die Zahl der Eosinophilen und, in geringerem Umfang, sind insbesondere Neutrophilen erhöht. Es gibt Anzeichen dafür, dass allergische Atemwegserkrankung Ergebnisse aus Überproduktion von IgE-Antikörpern gegen sensibilisierende Antigene. Sensibilisierung und Herausforderung mit OVA unter Verwendung der Protokolle beschreiben wir IgE-Spiegel erhöht im Serum und BAL-Flüssigkeit der behandelten Mäuse (5). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig1.jpg" /> Abbildung 1. Experimentelle Schema für OVA-induzierten allergischem Asthma. Die Mäuse wurden zweimal sensibilisiert ip mit 20 ug OVA in 2 mg Aluminiumhydroxid in 0,2 ml steriler PBS oder 2 mg Aluminiumhydroxid in 0,2 ml steriler PBS allein emulgiert, an der gefolgt angegebenen Zeitpunkten durch ihn herauszufordern mit 0,1% OVA oder sterile PBS-Lösung oder durch den täglichen Ex<html> Posure für 30 Minuten bis 1% zerstäubt OVA in PBS oder PBS alleine geliefert mittels eines Ultraschall-Vernebler (Buxco). Vierundzwanzig Stunden nach der letzten OVA Belichtung wurde Atemwegsempfindlichkeit bestimmt. Anschließend wurden BAL-Flüssigkeit, Blut-Proben, Lungenzellen, und Geweben zur weiteren Analyse gesammelt. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig2.jpg" /> Abbildung 2. Bewertung der Allergen-induzierte Atemwegshyperreaktivität durch eine nicht-invasives Verfahren. Mäuse (n = 4/group) sensibilisiert wurden und herausgefordert mit OVA. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Herausforderung, wurde Atemwegshyperreaktivität zu inhalativen Methacholin bestimmt mittels Ganzkörper-Plethysmographie wie im Protokoll beschrieben. Penh wurde bestimmt und als Penh Verhältnis (durchschnittliche Penh über den 8-min Zeitintervall mit Methacholin durch die durchschnittliche Penh über den 8-Minuten-Intervall mit PBS unterteilt). *, P &lt;0,05 vs PBS. iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3. Beurteilung der Allergen-induzierte Atemwegshyperreaktivität durch ein invasives Verfahren (erzwungene Schwingung). Mäuse (n = 4/group) waren sensibilisierten und provozierten mit OVA. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Belastung wurde Atemwegshyperreaktivität steigenden Konzentrationen von inhaliertem Methacholin durch die erzwungene Schwingung (flexiVent) Verfahren wie im Protokoll beschrieben ist. A, B) Atemwegswiderstand, C) Lung Elastanz. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig4.jpg" /> Abbildung 4. BAL-Flüssigkeit-Zellzahl. Mäuse (n = 4/group) waren sensibilisierten und provozierten mit OVA. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Herausforderung, (nach oben) BAL Zellen wurden gesammelt und insgesamt Zellen wurden gezählt, wie in der beschriebenen Protokoll. (Unten) Cytospin Folien waren prepariert und gefärbt mit Diff-Quick. TOT = Arbeitskosten insgesamt Zellen; Eos = Eosinophile; Neu = Neutrophile; Mac = Makrophagen, Lym = Lymphozyten. *, P &lt;0,05 vs PBS. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3771/3771fig5.jpg" /> Abbildung 5. OVA-spezifische IgE. Mäuse (n = 4/group) waren sensibilisierten und provozierten mit OVA. Vierundzwanzig Stunden nach der letzten Belastung wurde IgE in der BAL und in Serum aus dem Blut durch Herzpunktion gesammelt, wie im Protokoll beschrieben, gemessen. *, P &lt;0,05 vs PBS.

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</ol>

Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch den Atlanta VAMC IACUC Ausschuss gemäß Protokoll # V010-10 gesetzt durchgeführt.

Tiermodelle der allergischen Atemwegserkrankungen stellen wichtige Werkzeuge für die klinische Studien relevant Asthma. Eine Reihe von verschiedenen Modellen, leicht variierenden Arten und Antigenen, entwickelt worden. Die Maus, eine attraktive und häufig genutzte Labor Arten, bietet auch eine Reihe von Vorteilen für die Modelle der allergischen Erkrankung der Atemwege. 9,10 Obwohl solche Modelle nicht nachahmen Asthma in jeder Hinsicht, 11 mit Aspekten der chronischen Erkrankung besonders schwer z...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Ovalbumin </td><td> Sigma-Aldrich St. Louis, MO </td><td> A5503 </td><td></td></tr><tr><td> Aluminiumhydroxid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 239186 </td><td></td></tr><tr><td> Acetyl-β-Methylcholin Chlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A2251 </td><td></td></tr><tr><td> Pentobarbital-Natrium-Salz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P3761 </td><td></td></tr><tr><td> Die Ganzkörper-Plethysmographie (WBP) System </td><td> Buxco Research Systems Wilmington, NC </td><td></td><td> <a href="http://www.buxco.com" target="_blank">http://www.buxco.com</a> </td></tr><tr><td> FlexiVent </td><td>SCIREQ, Inc. Montreal, Kanada </td><td></td><td> <a href="http://www.scireq.com" target="_blank">http://www.scireq.com</a> </td></tr><tr><td> Lichtmikroskop </td><td> Leica Microsystems, Inc. Buffalo Grove, Illinois </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cytospin 4 </td><td> Thermo Scientific Asheville, NC </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Diff-Quick Fleck </td><td> Siemens Newark, DE </td><td> B4132-1A </td><td></td></tr><tr><td> Mehrfachdispenser </td><td> Tridak Torrington, CT </td><td> STP4001-0025 </td><td></td></tr></tbody></table>

mausmodell von allergen-induzierte asthma

Murine Model of Allergen Induced Asthma

Asthma ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität und betrifft rund 300 Millionen Menschen auf der ganzen Welt. 1 Mehr als 8% der US-Bevölkerung an Asthma erkrankt ist, mit der Prävalenz nimmt zu. 2 Wie bei anderen Erkrankungen, Tiermodellen der allergischen Atemwegserkrankung erheblich erleichtern Verständnis der zugrunde liegenden Pathophysiologie, zu identifizieren potentielle therapeutische Targets und lassen präklinische Testung von neuen Therapien möglich. Modelle der allergischen Atemwegserkrankung haben in mehreren Tierarten entwickelt worden, aber Mausmodellen sind besonders attraktiv aufgrund der geringen Kosten, die sofortige Verfügbarkeit, und gut charakterisierte Immunsystem dieser Tiere. 3 Verfügbarkeit einer Vielzahl von transgenen Linien weiter steigert die Attraktivität dieser Modelle. 4 Hier beschreiben wir zwei Mausmodellen der allergischen Atemwegserkrankungen, beide beschäftigen Ovalbumin als Antigen. Nach anfänglichen Sensibilisierung durch intraperitoneale Injektion, ein Modell Lief.ERS, die das Antigen Herausforderung durch Vernebelung, die andere durch intratracheale Lieferung. Diese beiden Modelle bieten komplementäre Vorteile, mit jeder imitiert die wichtigsten Funktionen des menschlichen Asthma. 5 Die wichtigsten Features von akuten Asthma zählen eine übertriebene Reaktion der Atemwege auf Reize wie Methacholin (Atemwegshyperreaktivität; AHR) und Eosinophilen-reiche Entzündung der Atemwege. Diese sind auch prominente Auswirkungen der Allergen-Provokation in unserem Mausmodell, 5,6, und wir beschreiben Techniken zur Messung und ihnen somit die Bewertung der Auswirkungen der experimentellen Manipulation. Insbesondere beschreiben wir sowohl invasive 7 und 8 nicht-invasive Techniken zur Messung Atemwegshyperreaktivität sowie Verfahren für die Beurteilung Infiltration von Entzündungszellen in die Atemwege und der Lunge. Airway Entzündungszellen werden von BAL gesammelt, während Lunge Histopathologie wird verwendet, um Marker für Entzündungen im ganzen Organ zu beurteilen. DieseTechniken bieten leistungsstarke Tools für die Untersuchung von Asthma bei einer Weise, die nicht beim Menschen möglich wäre.

Experimentelle Mausmodellen von allergischem Asthma bieten neue Möglichkeiten zur Untersuchung von Krankheitsentstehung und die Entwicklung neuer Therapeutika. Diese Modelle sind gut, um Mess-Faktoren, die die allergische Immunantwort, Entzündung der Atemwege, Lungen-und Pathophysiologie geeignet.

Mausmodell von Allergen-induzierte Asthma

Asthma ist eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität und betrifft weltweit etwa 300 Millionen Menschen.1 Mehr als 8 % der US-Bevölkerung leiden an Asthma, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, ein Mausmodell des Asthmas zu erzeugen. Zunächst werden die Mäuse durch intraperitoneale Injektion gegen Volin sensibilisiert. Im zweiten Schritt werden die Mäuse entweder intratracheal oder mittels Vernebelung mit Volin herausgefordert.Dies induziert eine allergische Atemwegsreaktion, die einer asthmatischen Exazerbation beim Menschen ähnelt, und kann mittels Methacholingabe gemessen werden. Zusätzlich können die zelluläre Infiltration der Atemwege und die Serumspiegel von IgE E quantifiziert werden, um die Schwere dieser typischen Asthmamerkmale zu bewerten. Letztendlich entwickeln die Mäuse asthmatische Manifestationen, deren Schwere durch weitere experimentelle Eingriffe beeinflusst werden kann.Dieses Tiermodell kann helfen, wichtige Fragen im Bereich Asthma zu beantworten, beispielsweise die Wirkungen einer Behandlung mit bestimmten experimentellen Wirkstoffen oder die Modulation spezifischer Signalwege. Den Ablauf dieses Verfahrens demonstrieren heute Irvin und Somia, Doktorandinnen in meinem Labor. Bereiten Sie die Sensibilisierungslösung vor, indem Sie ein Milligramm pro Milliliter Volin in steriler PBS emulgieren, die 10 Milligramm pro Milliliter Aluminiumhydroxid enthält. Sensibilisieren Sie die Mäuse, indem Sie 200 Mikroliter der Sensibilisierungsinokulation oder eine Kontrolllösung ohne Volin intraperitoneal verabreichen, wie in diesem Protokoll beschrieben.Sensibilisieren Sie die Mäuse wie am Tag null und sieben beschrieben. Führen Sie dann die Provokation an abwechselnden Tagen durch, beginnend am Tag 14 bis 22 für die intratracheale Provokation. Legen Sie die anästhetisierte Maus auf eine schräge Fläche. Haken Sie einen Faden unter die Schneidezähne der Maus ein und halten Sie den Kopf zurück. Dann richten Sie die Pfote aus, um die Luftröhre zu begradigen, und befestigen Sie die Hinterbeine mit Klebeband an der Arbeitsfläche. Um die Position zu sichern, benetzen Sie den Nacken- und Brustbereich der Maus mit 70 %igem Ethanol und desinfizieren die Operationsstelle mit Chlorhexidin unter Verwendung einer Pinzette. Schneiden Sie die Haut am Hals an und ziehen Sie sie vorsichtig mit sterilen chirurgischen Scheren nach vorne.Führen Sie einen kleinen vertikalen Einschnitt durch. Befüllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 50 Mikrolitern 0,1 % Volin in PBS. Setzen Sie eine 27-Gauge-Nadel auf und führen Sie sie mit einer Hand in eine Mehrkanalpipette ein.Verwenden Sie sterile Pinzette, um mit der anderen Hand die Trachea freizulegen. Halten Sie die Pipette parallel zur Trachea. Führen Sie die Nadel vorsichtig ein und injizieren Sie die Lösung. Schließen Sie die Wunde vorsichtig und verschließen Sie sie mit einer Naht. Achten Sie darauf, die Sterilität aufrechtzuerhalten. Legen Sie die Maus auf eine Heizplatte und lassen Sie sie sich zur Vorbereitung auf die Herausforderung durch Nebulisation erholen.Verwenden Sie das zuvor beschriebene Verfahren, um die Mäuse am Tag null und Tag 14 zu sensibilisieren. Danach provozieren Sie die Mäuse täglich zwischen Tag 21 und Tag 25. Um die Provokation durchzuführen, stellen Sie die Mäuse in die Hauptkammer eines Ganzkörperplethysmographiesystems und lassen Sie sie sich mindestens 10 Minuten akklimatisieren.Danach ein Milliliter 0,1 % Albumin in steriler PBS in die Zerstäuberkammer geben und 30 Minuten lang vernebeln. Um nichtinvasive Messungen der Atemwegshyperreagibilität durchzuführen, die Mäuse wie zuvor gezeigt an die Kammer gewöhnen. Anschließend dreiminütige Basiswerte aufzeichnen.Als Nächstes ein Milliliter PBS in die Zerstäuberkammer geben, zwei Minuten lang zerstäuben und die Atemvariablen während der anschließenden sechsminütigen Trockenphase nach der Zerstäubung überwachen. Dieses Beispiel veranschaulicht die erhöhte Atemwegsreaktivität, die Mäuse entwickeln, die mit Ovalbumin behandelt wurden, um invasive Messungen der Atemwegshyperreagibilität durchzuführen. Die anästhesierte Maus auf den Rücken legen, den Hals mit Ethanol und Chlorhexidin desinfizieren und die Trachea freilegen, wie zuvor in diesem Video beschrieben.Sobald die Luftröhre sichtbar ist, verwenden Sie feine sterile Scheren, um einen kleinen Einschnitt vorzunehmen. Achten Sie darauf, die Luftröhre nicht zu durchtrennen, und führen Sie vorsichtig den Trachealtubus ein. Binden Sie eine Naht um die Luftröhre, um ein Luftleck zu verhindern.Legen Sie die Maus auf den Rücken und verbinden Sie die Trachealkanüle mit dem Beatmungsgerät. Beginnen Sie die maschinelle Beatmung für eine 20-Gramm-Maus. Stellen Sie die Atemfrequenz auf 150 Züge pro Minute und das Atemzugvolumen auf 200 µL ein, um die Ausgangswerte der Atmungsmessungen zu erfassen.Anschließend den Test nach Gabe von PBS oder steigenden Dosen von Methacholin über einen Ultraschallvernebler wiederholen. Mithilfe der invasiven Messung können sowohl der Atemwegswiderstand als auch die Lungenelastizität wie erwartet bestimmt werden. Bei Volin-behandelten Mäusen stieg der Widerstand und die Elastizität nach der Provokation an.Nach der Euthanasie öffnen Sie die Bauchhöhle der Maus und perforieren Sie vorsichtig mit einer Schere das Zwerchfell. Achten Sie darauf, die Lunge oder das Herz nicht zu verletzen. Entfernen Sie den Rippenkorb.Dann punktieren Sie das Herz mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 27-Gauge-Nadel ausgestattet ist, und sammeln Sie langsam das Blut; bewahren Sie das Blut zur Serumentrennung und Analyse ova-spezifischer IgE-Antikörper auf. Danach exponieren Sie die Luftröhre und verwenden gebogene Schere, um darunter einen Weg freizulegen. Führen Sie die Spitze einer gebogenen Pinzette unter die Luftröhre und binden Sie dann ein Stück Nahtfaden in einer lockeren Halbschlinge um die Luftröhre in einer tiefen Position im Halsbereich.Sobald der Faden an Ort und Stelle ist, führen Sie einen kleinen Schnitt in die Luftröhre oberhalb des Knotens durch und setzen vorsichtig eine Kanüle in die Öffnung ein. Drücken Sie sie dann sanft nach vorne, bis sie den Eingang zu den Lungen erreicht. Ziehen Sie den Knoten fest und vervollständigen Sie ihn.Dann verbinden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze, die PBS enthält, mit der Kanüle und injizieren Sie die Flüssigkeit vorsichtig in die Lungen. Beobachten Sie die Aufblähung der Lungen. Achten Sie darauf, die Lungen nicht überzufüllen und sie zu rupturieren.Ziehen Sie die Spülflüssigkeit ab, wobei Sie die Kanüle vorsichtig drehen oder leicht tiefer andrücken, falls ein Widerstand spürbar ist. Sobald die Flüssigkeit gesammelt ist, nehmen Sie die Spritze ab und überführen die Flüssigkeit in ein Röhrchen auf Eis. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal mit frischem PBS.Nach diesem Verfahren können die Atemwegszellen durch Zentrifugation wie hier gezeigt isoliert werden. Die Atemwege von Mäusen, die mit Volin sensibilisiert und herausgefordert wurden, enthalten deutlich mehr Gesamtzellen als die von Kontrollmäusen. Mithilfe von Diff-Quick-Färbungen können Eosinophile, Neutrophile, alveoläre Makrophagen und Lymphozyten unterschieden und gezählt werden.Außerdem kann man beobachten, dass behandelte Mäuse nach der Entwicklung höhere Spiegel an volin-spezifischen IgE-Antikörpern im Serum und in der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit bilden. Dieses Tiermodell hat den Forschern auf dem Gebiet des Asthmas den Weg geebnet, die Mechanismen dieser wichtigen Erkrankung in einem geeigneten Mausmodell zu erforschen.

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wiederholte Messungen von Nagetier Atemfunktion und Probenahme von Atemwegs Entzündungszellen sind wünschenswert, aber in der Regel nicht möglich. Hier beschreiben wir eine wiederholbare Methode für oral Intubation Mäuse, wiederholte Messungen der Atemwege Hyperreaktivität und die Entnahme von Atemwegs-inflammatorischen Zellen ermöglicht.

Eine reversible, nicht-invasive Methode für Airway Resistance-Messungen und bronchoalveolären Lavage Sampling in Mäuse

Das vorliegende Protokoll bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Verfahren erforderlich, um Messungen der Atmungsorgane Mechanik sowie die Beurteilung der Atemwege Reaktionsfähigkeit auf inhalierte Methacholin bei Mäusen mit der erzwungenen Schwingung Technik (flexiVent auszuführen; SCIREQ Inc, Montreal, QC , Kanada).

Auswertung der Atemwege Mechanik in Mäuse mit den Forced Oscillation Technique

Während in vitro Studien von Wirt-Erreger-Interaktionen die Charakterisierung spezifischer Immunantworten ermöglichen, sind in vivo Modelle erforderlich, um die Auswirkungen komplexer Reaktionen zu beobachten. Unter Verwendung der Exposition von Candida albicans, gefolgt von einer Pseudomonas aeruginosa-vermittelten Lungeninfektion, etablierten wir ein Mausmodell für mikrobielle Interaktionen, die an der Pathogenität der beatmungsassoziierten Pneumonie beteiligt sind.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Das hier beschriebene Verfahren ermöglicht die Visualisierung der IL-8-Promotor-abhängigen Entzündungsaktivierung in den Lungen von Mäusen durch nicht-invasive Biolumineszenz-Bildgebung (BLI). Das gleiche Tier kann BLI mehrmals für bis zu zwei Monate ab dem Zeitpunkt der Auslieferung des Luciferase-Reporter-Konstrukts unterworfen werden.

Ein IL-8 transientes transgenisiertes Mausmodell für die<em&gt; In vivo</em&gt; Langzeitüberwachung von entzündlichen Reaktionen

Das Ziel dieses Artikels ist es, eine detaillierte Beschreibung der empfohlenen Verfahren, die Atemfunktion im bewussten Mäuse durch Doppel-Kammer-Plethysmographie bewerten.

Beurteilung der Atemfunktion in bewusste Mäuse durch Doppel-Kammer-Plethysmographie

Die hier vorgestellte Protokoll ermöglicht Charakterisierung von homing Lungenkapazität von primären menschlichen Lymphozyten unter in-vivo entzündlichen Erkrankungen. Pulmonale Infiltration der adoptively übertragenen menschlichen Immunzellen in einem Mausmodell der allergische Entzündung kann abgebildet und durch Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie von chemisch ausgeglichenen Lungengewebe quantifiziert werden.

Erweiterte Bildgebung der Lunge Homing menschlichen Lymphozyten in einem experimentellen In Vivo Modell der allergische Entzündung basierend auf Licht-Blatt Mikroskopie

Umweltallergene wie Hausstaubmilben (HDM) enthalten oft mikrobielle Substanzen, die angeborene Immunreaktionen aktivieren, um allergische Entzündungen zu regulieren. Das hier vorgestellte Protokoll zeigt die Identifizierung von dsRNA-Arten in HDM-Allergenen und die Charakterisierung ihrer immunogenen Aktivitäten bei der Modulation eosinophiler Lungenentzündungen.

Identifizierung und Charakterisierung immunogener RNA-Arten in HDM-Allergenen, die eosinophile Lungenentzündungen modulieren

Eine hohe Plattform kann Ratten ohne Einschränkung fixieren und die Akupunkte auf dem Rücken während der Akupunkturmanipulation vollständig freilegen. Dieser Artikel beschreibt Methoden zur Herstellung der hohen Plattform, legt ein Rattenmodell von Asthma fest und misst Veränderungen der Atemfunktion mit einem nichtinvasiven und Echtzeit-Ganzkörper-Plethysmographie(WBP)-System.

Akupunktur in einem Rattenmodell von Asthma

Dieses Protokoll beschreibt eine mehrfarbige Immunfluoreszenztechnik zur Evaluierung des Rattenmodells der allergischen Rhinitis.

Immunfluoreszenz-Markierung in Nasenschleimhaut-Gewebeschnitten von Ratten mit allergischer Rhinitis mittels Multicolor-Immunoassay

Hier beschreiben wir die Messung von Husten mit einem nicht-invasiven und Echtzeit-Ganzkörperplethysmographie-System (WBP) und die normativen Verfahren zur Entnahme von Gewebeproben von Mäusen und stellen einige Methoden zur Beurteilung von Atemwegsentzündungen vor.

Methoden zum Nachweis von Husten und Atemwegsentzündungen bei Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines Mausmodells mit Hustenüberempfindlichkeit, das als ideales Modell für die Untersuchung der Mechanismen des chronischen Hustens dienen kann.

Etablierung eines Mausmodells mit Hustenüberempfindlichkeit durch Inhalation von Zitronensäure

Erfahren Sie, wie ein Mausmodell von allergen-induziertem Asthma entwickelt wird, um Immunantworten und Atemwegsentzündungen zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Quantifizierung von Zellinfiltration und IgE-Spiegeln.

Mausmodell von Allergen-induzierte Asthma

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