Einfache mikrofluidischen Systemen für In vivo Imaging der C. elegans, Drosophila Und Zebrafisch

Hallo, ich bin Shamal, wissenschaftlicher Mitarbeiter bei TUR Kika am Nationalen Zentrum für Biologische Wissenschaften Indien. In diesem Video zeige ich Ihnen, wie man ein biologisches Mikrogerät unter Verwendung von Soft-Lithographie-Techniken in einer regulären Laborumgebung herstellt. Ich werde diese Geräte für die hochauflösende zelluläre und subzelluläre Bildgebung genetischer Modellorganismen verwenden.

Das vorliegende Protokoll ermöglicht es Forschern, diese Zeitrafferaufnahmen an intakten Organismen ohne Anästhesie durchzuführen. Beginnen wir also. Wir haben eine einfache mikrophonische Vorrichtung entwickelt, um die in-vivo-Bildgebung genetischer Modellorganismen wie C. elegans, intakte Oph und Zebrafische ohne Anästhesie durchzuführen.

In dieser Studie demonstrieren wir ein membranbasiertes Chip-System zur Fixierung von Organismen, das durch Abformung von PDMS hergestellt wird. Um einen einzelnen Organismus zu fixieren, positionieren wir ein einzelnes Tier unter einem Stereomikroskop und entnehmen es mithilfe eines kleinen Tropfens Pufferlösung mit einer Mikropipette, führen das einzelne Tier in den Strömungskanal ein und fixieren es unter der PTMS-Membran. Dabei verwenden wir eine Druckluftverbindung mit Stickstoffgas über ein dreiwegiges Kugelventil.

Entwerfen Sie die mikro fredic-Strukturen mithilfe von Reinigungssoftware. Reinigen Sie zwei mal zwei Zentimeter große Siliziumwafer eine Minute lang in 20 % KH und spülen Sie sie mit destilliertem Wasser ab. Trocknen Sie die Stücke mit Stickstoffgas ab und trocknen Sie sie vier Stunden lang bei 122 °C aus.

Spinne Hexa-Metall auf Siliziumplättchen bei 500 U/min für fünf Sekunden und bei 3000 U/min für 30 Sekunden. Spinne SU 8 2 0 2 5 auf Siliziumwafern bei 500 U/min für fünf Sekunden und bei 2000 U/min für 30 Sekunden. Weichbacke die beschichteten Siliziumplättchen bei 65 Grad Celsius für eine Minute und bei 95 Grad Celsius für 10 Minuten.

Belichten Sie die gebackenen SU-8-beschichteten Wafer mit einer 200-Watt-UV-Lampe durch die Fotomaske für Design eins und Design zwei jeweils für die Fluss- und die Steuerschicht. Danach werden die Wafer bei 65 Grad Celsius eine Minute und bei 95 Grad Celsius zehn Minuten nachgebacken. Entwickeln Sie die Strukturen mit der SUA-Entwicklerlösung innerhalb von 20 Minuten.

Kodieren Sie die Stücke mit Trichlorperfluorcetselindampf in einem Exsikkator für zwei Stunden. Mischen Sie die Polydylxox-Basis und den Härter im Gewichtsverhältnis 10 zu 1. Entgasen Sie die Mischung, um alle Luftblasen, die während des Mischvorgangs entstanden sind, zu entfernen.

Geben Sie eine fünf Millimeter dicke PDMS-Mischung auf Siliziumwafer mit SC-Gewichtsmuster des Designs. Zwei vorsichtig, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Spin-Coaten Sie eine gleichmäßige PDMS-Schicht auf den Siliziumwafern mit Design eins für die Strömungsschicht bei 500 U/min für fünf Sekunden und tausend 500 U/min für 30 Sekunden.

Beide Teile des Designs eins und des Designs zwei, die PDMS enthalten, bei 50 Grad Celsius sechs Stunden lang aushärten. Den PDMS-Teil mithilfe einer Präzisionsklinge mit dem SCH-Muster zwei aus dem Silizium-Substrat ausschneiden. In der PDMS-Form ein kleines Loch oberhalb des Reservoirs stanzen, das mit der Hauptfalle verbunden ist.

Unter Verwendung einer Punktionsnadel mit der größten Stärke oder einer 18-Gauge-Nadel. Den unteren Bereich der Steuerschicht und den oberen Bereich der Flussschicht zwei Minuten lang 18-Watt-Luftplasma aussetzen. Die beiden plasmabehandelten Oberflächen vorsichtig unter leichtem Druck zusammenfügen und zwei Stunden lang bei 50 Grad Celsius backen.

Schneiden Sie die verbundenen Vorrichtungen mit dem SUH-Design eins aus dem Silizium-Substrat aus und stanzen Sie Zugangsöffnungen an den Einlass- und Auslassreservoiren des Strömungskanals. Legen Sie die untere PD-Oberfläche der Vorrichtung und eine saubere Glasabdeckung frei. Exponieren Sie sie für zwei Minuten einer 18-Volt-Luft-Plasma-Behandlung.

Platzieren Sie die beiden plasmabehandelten Oberflächen mit leichtem Druck aufeinander und backen Sie sie zwei Stunden lang bei 50 Grad Oberflächentemperatur. Bewahren Sie das Gerät zur späteren Verwendung in einer sauberen Umgebung auf. Nach der Herstellung der Geräte zeige ich Ihnen, wie man eine PDMS-Membran verwendet, um C. elegans im Gerät zu immobilisieren. Verbinden Sie ein Ende eines Microflex-Schlauchs mit einem Druckregler für komprimiertes Stickstoffgas und das andere Ende über eine 18-Gauge-Nadel mit dem Hauptfallenreservoir.

Ein dreifacher Hahn, der in der Mitte der Schlauchverbindung verwendet wird, ermöglicht das Anlegen oder Ablassen des Drucks auf die Membran. Füllen Sie den Schlauch und die Verbindung zum PDMS-Gerät mit einer 10 cm hohen Säule destillierten Wassers, bevor Sie ihn mit dem Reservoir der Hauptfalle verbinden. Drehen Sie das Ventil der Stickstoffzufuhr auf Protein-PSI und beobachten Sie die Auslenkung der Membran der Hauptfalle in Richtung des Strömungskanals bei geringer Vergrößerung eines invertierten Mikroskops.

Öffnen Sie also das Dreiwegeventil und bringen Sie die Membran in die Ruheposition. Füllen Sie den Flusskanal 10 Minuten lang mit Puffer. Suchen Sie vor einem Experiment mithilfe eines Mikroskops mit geringer Vergrößerung ein einzelnes Seeigelovum.

Wählen Sie ein einzelnes Tier mit einem kleinen Pufferlösungsvolumen in eine Mikrospitze auf. Führen Sie das einzelne Tier durch den Einlass des Flusskanals. Stellen Sie den Pipettierdruck so ein, dass sich das einzelne Tier unter der Hauptfalle befindet.

Erhöhen Sie den Druck der PDMS-Membran langsam, um das Tier an der Kanalgrenze zu positionieren und es mit einem Druck von sieben bis 14 PSI zu fixieren. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop mit der gewünschten Einstellung für hochauflösende Auflicht- oder Fluoreszenzabbildung. Nehmen Sie einzelne oder zeitgesteuerte Fluoreszenzbilder mit einer vordefinierten Bildfrequenz auf.

Lösen Sie den Fallen-Druck und beobachten Sie das Bewegungsverhalten des Tieres. Spülen Sie das Tier fünf Minuten lang bei geringer Vergrößerung und bringen Sie ein frisches Tier ein. Um die DevOp-Schritte zu wiederholen, verwenden Sie die abgeschnittene Mikropipettenspitze, um eine einzelne Oph-Larve aufzunehmen und sie in die größere mikroferrische Vorrichtung einzuführen.

Schieben Sie die einzelne Larve durch den Einlass des Durchflusskanals. Erhöhen Sie langsam den Druck auf die PDMS-Membran und fixieren Sie sie mit sieben ESI-Druckstufen. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop für die Fluoreszenzbildgebung bei niedriger Vergrößerung und nehmen Sie Zeitraffer-Fluoreszenzbilder für die Transportbildgebung auf.

Lösen Sie den Fangdruck und beobachten Sie das Bewegungsverhalten der Larve bei geringer Vergrößerung. Nutzen Sie das gleiche Geräteprinzip, um 30 Stunden nach der Befruchtung beispiellose Fische zu immobilisieren und Zeitrafferaufnahmen aufzunehmen. Val-Herz.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie in der Lage sein, ähnliche Mikrogeräte in Ihrem eigenen Labor herzustellen und sie erfolgreich zur Immobilisierung von Organismen für hochauflösende, beeindruckende Experimente zu nutzen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.