Name: Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Mikroinjektion fluoreszierender Bakterien in Zebrafisch-Embryos zur Live-Bildgebung von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung intrazellulärer Bakterien in Phagozyten mittels Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie.

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Die Autoren möchten Chao Cui danken, Etage de Kort, Esther Stoop und Ralph Carvalho für Bilder in Abbildung 4, Ulrike Nehrdich und Davy de Witt für Fische Pflege, Labor und andere Mitglieder für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wird durch die Smart-Mix des niederländischen Wirtschaftsministeriums und des Ministeriums für Bildung, Kultur und Wissenschaft, der Europäischen Kommission 7. Rahmenprogramm Projekt ZF-Health (HEALTH-F4-2010-242048), das Europäische Marie-Curie unterstützt Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), und von der australischen NHMRC (637.394). Das australische Institut für Regenerative Medizin wird durch Zuschüsse der Regierung des Bundesstaats Victoria und der australischen Regierung unterstützt.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Infektion Methoden in diesem Artikel beschrieben werden häufig verwendet, um die Funktion des Host angeborenen Immunität Gene oder bakteriellen Virulenz-Gene 1 studierst. Die intravenöse Injektion Mikro-Methoden (Protokolle 5 und 6.1) werden am häufigsten für solche Untersuchungen eingesetzt. Die Schwanzvene Blut an der hinteren Insel ist die bequemste Lage für die intravenöse Injektion von 1-Tage alten Embryonen. Da die Schwanzvene wird es schwieriger, in späteren Phasen durchdringen, bevorzugen wir den Kanal von Cuvier als intravenöse Injektion Standort für Embryonen bei 2-3 dpf. In allen Fällen ist es entscheidend, um die Embryonen mit gleichbleibender Anzahl von Bakterien, die durch Plattieren Injektion Inokula für cfu Zählung überprüft werden sollte zu injizieren. Die folgenden Aspekte zu berücksichtigen, um reproduzierbare Injektionen zu erreichen. Erstens ist es wichtig, hochwertige Glas-Mikrokapillare Injektionsnadeln haben. Wenn die Nadelspitze zu groß ist, wird die Injektion einen Reifenschaden Loch groß genug für Blutungen auftreten, erstellen unddie injizierten Bakterien austreten wird der Blutkreislauf. Zweitens muss Bakterien direkt in den Blutkreislauf injiziert werden. Wenn die Nadelspitze ist nicht im Inneren der Vene oder wenn Injektionsflüssigkeit Spreads in den Dottersack Verlängerung, muss der Embryo aus dem Experiment verworfen werden. Drittens, mit PVP40 als Träger zum Einspritzen M. marinum wird verhindert, dass die Bakterien vor dem Versinken in der Glas-Nadel zu unterstützen. PVP40 verbessert die Homogenität der Suspension, was zu mehr reproduzierbare Inokula während der gesamten Dauer der Injektionen. PVP40 kann auch verwendet werden für S. typhimurium Injektionen, aber hier ist es weniger wichtig, weil die größere Größe und helle Fluoreszenz der Bakterien ermöglicht eine visuelle Kontrolle über die Injektion Inokulum während der Experimente. Zum Üben der Injektionen empfehlen wir die Verwendung von Phenol roten Farbstoff (1% v / v) oder 1 um fluoreszierende Kugeln in verschiedenen Farben erhältlich (Invitrogen). Sobald die Technik beherrscht wird, dauert es etwa 30 minutES zu injizieren 50-100 Embryonen, einschließlich der Zeit zum Ausrichten der Embryonen auf Agarose-Platten und das Einstellen der bakteriellen Injektionsvolumen erforderlich. Während die intravenöse Injektionen in das Blut Insel (Protokoll 5) oder in den Kanal von Cuvier (Protokoll 6.1) am häufigsten verwendet werden, haben die alternativen Routen von Infektionen in diesem Video Artikel beschrieben bewährt, Makrophagen und Neutrophilen-Chemotaxis zu studieren (Protokolle 6.2, 6.3 und 6.4), um das Wachstum von abgeschwächten Bakterienstämmen (Protokoll 6.5) zu studieren, und um das Zebrafisch-Infektion Modell für Anwendungen mit hohem Durchsatz (Protokoll 6.6) 8.4 anzupassen. Die Mikroinjektion beschriebenen Verfahren können auch zur Injektion von Viren 18, 19, Pilzsporen 14, 20 oder Protozoen-Parasiten (Maria Forlenza, persönliche Mitteilung) aufgebracht werden. Eine sinnvolle Ergänzung zu den Injektions-Verfahren in diesem Artikel beschriebenen Video ist ein erst kürzlich beschriebenen Verfahren für die subkutane Injektion von Bakterien in zebrafish Embryonen 21. Dieses Verfahren angewendet wurde, um die Phagozytose von Bakterien durch Neutrophile, die effizient verschlingen Bakterien auf Gewebeoberflächen wurden gefunden, aber zu studieren, im Gegensatz zu Makrophagen, waren praktisch nicht Bakterien nach der Injektion phagozytieren in das Blut oder in mit Flüssigkeit gefüllten Körperhöhlen. Für subkutane Injektionen Embryonen positioniert sind ähnlich wie bei den Schwanz Muskel Injektionen in diesem Video-Artikel beschrieben, aber die Nadel direkt unter die Haut eingesetzt, um die Bakterien über einen Somiten zu injizieren. Es ist wichtig zu beachten, dass der Mikroinjektion im wesentlichen eine künstliche Infektionsweg. Allerdings sind frühe Embryonen sehr robust gegen äußere Exposition gegenüber bakteriellen Erregern. In der Tat sind Eintauchen Assays, in denen die Embryonen in einer Bakteriensuspension getaucht werden, nicht reproduzierbar in der Hand 22. Während einige Embryonen können sich infizieren beim Eintauchen, haben wir eine große Variation in der Mortalitätsraten und in der ausdrücklichen beobachtetion von entzündlichen Marker-Gene zwischen einzelnen Embryonen in solchen Assays. Die Mikro-Injektion Methoden in diesem Artikel beschriebenen erreichen reproduzierbare Infektionen und sind besonders nützlich, um bakterielle Interaktionen mit Host-Zellen des angeborenen Immunsystems zu untersuchen. Ein effizienter Ansatz für die bakterielle Infektion in einzelnen Embryonen zu quantifizieren ist, die Fluoreszenz-Bilder von infizierten Embryonen mit maßgeschneiderten, dedizierten Pixel Quantifizierung Software 17, 23 zu analysieren. Dieser Ansatz hat sich gezeigt, eine gute Korrelation mit den Ergebnissen der Keimzahlen nach dem Ausplattieren der infizierten Embryonen. In ähnlicher Weise haben relative Veränderungen in Leukozyten-Zahlen pro Embryo durch digitale Bildanalyse in transgenen Leukozyten-Fluorophor Reporter Linien quantifiziert worden; dieser Ansatz anwendbar wäre, um die Quantifizierung der Host leukopoietische Reaktion auf eine Infektion 24. Die Funktion des angeborenen Immunsystems Host-Gene lassen sich effizient in vivo untersucht werden, durch die Kombination der beschriebenen Modelle Infektionmit Morpholino Knockdown. Morpholinos sind synthetische Antisense-Oligonukleotide, die spezifische RNAs ausgerichtet und zur Verringerung der Expression der Genprodukte, wenn sie in 1-Zellen-Stadium Zebrafisch-Embryonen injiziert wie in anderen Video Artikel in dieser Zeitschrift 10, 25 gezeigt. In Morpholino Knockdown Studien ist es von großer Bedeutung, dass alle Embryos zu vergleichenden Gruppen richtig inszeniert vor der bakteriellen Injektionen. Dies ist besonders wichtig, da Embryonen eine sich entwickelnde Immunsystem, die zunehmend im Laufe der Zeit wird zuständigen haben. Es gibt verschiedene transgene Reporter Linien derzeit zur Verfügung stehen die wichtigsten angeborenen Immunsystems Teilmengen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, in Zebrafisch-Embryos zu unterscheiden. Der MPX und Lyz Promotoren wurden verwendet, um neutrophile Reporter Linien 16, 26, 27 erzeugen, und die CSF1R (FMS) und MPEG1-Promotoren wurden verwendet, um zu produzieren Makrophagen-Reporter 14, 28. Während CSF1r (fms) zusätzlich in Xanthophoren ausgedrückt, MPEG1 Expression ausschließlich in Makrophagen. Wie in diesem Video-Beitrag gezeigt, sind die neu entwickelten MPEG1 Reporter Linien sehr nützlich für bildgebende bakterielle Phagozytose durch Makrophagen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Lieferant </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Phenolrot </td><td> Sigma </td><td> P0290 </td></tr><tr><td> Glycerin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 228210 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H10 Agar </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 262710 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook OADC Enrichment </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211886 </td></tr><tr><td> Difco Middlebrook 7H9 Bouillon </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 271310 </td></tr><tr><td> BBL Middlebrook ADC Enrichment </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 211887 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1754 </td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidon (PVP40) </td><td> Calbiochem, Merck KGaA </td><td> 529504 </td></tr><tr><td> N &lt;/ Em&gt;-Phenylthioharnstoff (PTU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7629 </td></tr><tr><td> Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonatsalz (Tricaine) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A5040 </td></tr><tr><td> Methylcellulose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M0387 </td></tr><tr><td> SeaPlaque Agarose (Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt) </td><td> Lonza Inc. </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 mu m, rot fluoreszierende (580/605)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8821 </td></tr><tr><td> FluoSpheres (1,0 mu m, gelb-grün fluoreszierend (505/515)) </td><td> Invitrogen </td><td> F8823 </td></tr></tbody></table>

die infektion von zebrafisch-embryos mit intrazelluläre bakterielle krankheitserreger

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Zebrafisch (Danio rerio) Embryonen werden zunehmend als ein Modell zur Untersuchung der Funktion des Wirbeltier angeborenen Immunsystems im Wirt-Pathogen-Interaktionen 1 verwendet. Die wichtigsten Zelltypen des angeborenen Immunsystems, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, in den ersten Tagen der Embryogenese vor der Reifung von Lymphozyten, die für adaptive Immunantworten benötigt werden, zu entwickeln. Die Leichtigkeit, an eine große Zahl von Embryonen, deren Zugänglichkeit durch äußere Entwicklung, die optische Transparenz der Embryonal-und Larvenstadien, ein breites Spektrum an genetischen Werkzeugen, umfangreiche Ressourcen und Mutanten-Sammlungen von transgenen Reporter Linien, die alle auf die Vielseitigkeit des Zebrafisch hinzufügen Modell. Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. typhimurium) und Mycobacterium marinum kann intrazellulär wohnen in Makrophagen und werden häufig verwendet, um Wirt-Pathogen-Interaktionen in Zebrafisch-Embryos zu studieren. Die Infektion dieser beiden Prozessebakterielle Erreger sind interessant zu vergleichen, weil S. typhimurium Infektion akut und tödlich innerhalb eines Tages, während M. marinum Infektion chronisch und kann bis zum Larvenstadium 2, 3 abgebildet werden. Der Standort der Mikro-Injektion von Bakterien in den Embryo (Abbildung 1) legt fest, ob die Infektion rasch zu systemischen oder wird zunächst lokalisiert bleiben. Eine schnelle systemische Infektion kann gegründet werden durch Mikro-Injektion von Bakterien direkt in den Blutkreislauf über die Schwanzvene Blut an der hinteren Insel oder über den Kanal von Cuvier, eine weite Verbreitung Kanal auf dem Dottersack verbindet das Herz mit dem Stamm Gefäßsystem. Bei 1 dpf, wird, wenn Embryonen in diesem Stadium phagocytically aktiven Makrophagen haben aber Neutrophile sind noch nicht ausgereift, Einspritzen ins Blut Insel bevorzugt. Für Injektionen bei 2-3 dpf, wenn Embryonen auch funktionelle (Myeloperoxidase-produzierenden) Neutrophile, entwickelte der Kanal von Cuvier als t bevorzugter an der Injektionsstelle. Um gerichtete Wanderung von myeloischen Zellen gegenüber lokalen Infektionen zu studieren, können Bakterien in den Schwanz Muskel-, Ohr-Vesikel, oder Hinterhirn Ventrikel 4-6 injiziert werden. Darüber hinaus ist die Chorda, eine Struktur, die normalerweise nicht zugänglich myeloischen Zellen erscheint, ist sehr anfällig für lokale Infektion 7. Eine sinnvolle Alternative für Anwendungen mit hohem Durchsatz ist die Injektion von Bakterien in den Dotter von Embryonen innerhalb der ersten 8 Stunden nach der Befruchtung. Die Kombination fluoreszierende Bakterien und transgenen Linien mit fluoreszierender Zebrafisch Makrophagen oder Neutrophilen schafft ideale Voraussetzungen für Multi-Color-Imaging von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Dieses Video Artikel wird detaillierte Protokolle für die intravenöse und lokale Infektion von Zebrafisch-Embryos mit S. beschreiben typhimurium oder M. marinum Bakterien und für die anschließende Fluoreszenz-Imaging von der Interaktion mit Zellen des angeborenen Immunsystems.

Transparente Zebrafischembryonen haben nützliches Modell Gastgeber zu visualisieren und funktionell Studie Wechselwirkungen zwischen Zellen des angeborenen Immunsystems und intrazelluläre bakterielle Erreger wie bewiesen<em&gt; Salmonella typhimurium</em&gt; Und<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt;. Mikro-Injektion von Bakterien und Multi-Color-Fluoreszenz-Imaging sind wesentliche Techniken bei der Anwendung von Modellen Zebrafischembryo Infektion beteiligt sind.

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Zebrafischembryonen (Danio rerio) werden zunehmend als Modell zur Untersuchung der Funktion des angeborenen Immunsystems von Wirbeltieren bei der Interaktion zwischen Wirt und Pathogen eingesetzt ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Zebrafischembryonen mittels Mikroinjektion fluoreszierende Bakterien zuzuführen, um die Interaktion mit Wirtsimmunzellen in lebenden Organismen bildlich darzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst die Injektionsnadel mit Bakteriensuspensionen vorbereitet und beladen wird. Anschließend werden die Embryonen nach Entwicklungsstadium klassifiziert und auf einer Injektionsplatte ausgerichtet.Anschließend wird der bakterielle Inokulum über einen geeigneten Weg appliziert, um entweder eine lokale oder systemische bakterielle Infektion zu erzeugen. Schließlich werden die Embryonen präpariert und abgebildet. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die intrazelluläre Lokalisation bakterieller Pathogene innerhalb fluoreszierender Phagozyten des transparenten zebrabärblingembryos mittels Fluoreszenz- und konfokaler Mikroskopie zeigen.Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Immunologie zu beantworten, da das Zebrafischembryomodell sehr leistungsfähig für die Live-Bildgebung von Wirt-Pathogen-Interaktionen ist. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da viel Übung erforderlich ist, um Bakterien reproduzierbar in den Blutkreislauf von Zebrafischembryonen zur systemischen Infektion oder in spezifische Kompartimente zur Erzeugung lokaler Infektionen mikroinjizieren zu können. Nachdem Glas-Mikrokapi­llarnadeln gezogen und deren Spitzen auf einen Winkel von 45 Grad abgeschliffen wurden, werden die Zebrafischembryonen 28 Stunden nach der Befruchtung durch Überprüfung einer gleichmäßigen Durchblutung gestuft. Beginnende Pigmentierung im Auge, ein gerader Schwanz und die Lage des Herzens direkt ventral zum Auge.Nachdem die Embryonen anästhesiert wurden, verwenden Sie eine Mikroladepipettenspitze, um die Nadel mit einem zuvor hergestellten bakteriellen Inokulum zu beladen. Bringen Sie die beladene Nadel an einem Mikromanipulator, der mit einem Stativ verbunden ist, an und positionieren Sie sie unter einem Stereomikroskop. Stellen Sie die Injektionszeit auf 0,2 Sekunden und den Kompensationsdruck auf 15 Hektopascal ein.Stellen Sie den Injektionsdruck zwischen 700 und 900 Hektopascal ein, um das korrekte Injektionsvolumen für die verwendete Nadel zu erhalten. Bringen Sie den Mikromanipulator mit der beladenen Nadel vor der Injektion in die richtige Position. Legen Sie die anästhesierten Embryonen auf eine flache 1 %igen Agarose-Injektionsplatte und entfernen Sie überschüssiges Ei-Wasser.Verwenden Sie anschließend ein Haarschleifen-Werkzeug, um die Embryonen für jede Injektion auszurichten. Bewegen Sie die Platte während der Injektionen von Hand, um die Embryonen so zu positionieren, dass ihre Schwänze in Richtung der Nadelspitze zeigen. Platzieren Sie die Nadelspitze direkt über der Coddle-Vene in der Nähe der urogenitalen Öffnung.Stechen Sie mit der Nadelspitze in das Periderm und injizieren Sie die gewünschte Dosis fluoreszenzmarkierter Bakterien. Wir verwenden etwa 250 koloniebildende Einheiten oder CFUs von Salmonella typhimurium und etwa 120 CFUs von Mycobacterium marum. Die injizierte Bakteriensuspension folgt dem Blutfluss durch die Coddle-Vene in Richtung Herzmonitor, sofern die Injektion korrekt durchgeführt wurde, was durch die Beobachtung einer unmittelbar nach dem Puls erkennbaren Ausdehnung des vaskulären Systems überprüft werden kann.Überprüfen Sie regelmäßig, ob das Injektionsvolumen während des Experiments konstant bleibt. Um eine Kontrolle für die Konsistenz der Injektionen über das gesamte Experiment hinweg zu gewährleisten, injizieren Sie einen Tropfen Bakterien direkt auf einen Tropfen steriler PBS auf einem bakteriellen Nährmedium. Platieren Sie nach etwa jeder 30. Embryoinjektion diesen Tropfen und zählen Sie die bakteriellen Kolonien nach der Inkubation.Um die KBE in dem Injektionsvolumen zu bestimmen, verwenden Sie ein fluoreszenzstereomikroskop, um einzelne fluoreszierende Styria-Zellen zu beobachten, die unmittelbar nach der Injektion im Blutkreislauf zirkulieren, und verwerfen Sie Embryonen, die nicht ordnungsgemäß injiziert wurden. Fluoreszierende Aggregate von M. marum-Bakterien sollten zwei Tage nach der Infektion sichtbar sein und im Laufe der Zeit größer werden. Um in den Ductus Cuvieri zu injizieren, betäuben Sie zwei bis drei Tage nach der Befruchtung stehende Embryonen.Beim Injizieren in die Coddle-Vene in einem Winkel von 45 Grad von der dorsalen Seite des Embryos aus wird die Nadel in den Anfangspunkt des Ductus Cuvieri eingeführt. Gleich dorsal zu der Stelle, an der sich der Ductus über dem Dottersack erweitert, für die Injektionsposition des Hinterhirnventrikels. Betäuben Sie Embryonen 32 Stunden nach der Befruchtung mit ihrer dorsalen Seite in Richtung der Nadelspitze.Führen Sie die Nadel von einer vorderen Position aus in das Hinterhirnventrikel ein, ohne das Neurohelium zu berühren, um in die Schwanzmuskulatur zu injizieren. Positionieren Sie anästhesierte Embryonen, die einen bis zwei Tage post fertilization sind, mit dem Schwanz in Richtung der Nadelspitze, und bringen Sie die Nadel in einem Winkel von etwa 65 Grad an, um in den Muskel oberhalb der urogenitalen Öffnung für die Injektion der otischen Vesikel einzuführen. Orientieren und anästhesieren Sie Embryonen, die zwei bis drei Tage post fertilization sind, mit dem Schwanz in Richtung der Nadel.Spritzen Sie in einem Winkel von 65 Grad und bei niedrigem Druck ein, um in das Knotenband bei ein bis zwei Tage alten Embryonen nach der Befruchtung zu injizieren, wobei der Schwanz vom Nadelende wegzeigt. Führen Sie die Nadel durch das Schwanzmuskulaturgewebe in das Band hinein.Für eine Dotterinjektion bei Embryonen vom 16- bis 1000-Zell-Stadium die Nadel durch die Chorion in die Mitte des Dotters stechen, um die Infektion abzubilden. Die infizierten Embryonen in einer mit Ei-Wasser, das Trica enthält, bedeckten Petrischale mit 1 % Augurin anästhesieren. Mithilfe eines Haarschleifenwerkzeugs die Embryonen in die korrekte Position für die Bildgebung unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop ausrichten.Einzelne fluoreszierende s tym-Zellen können direkt nach der Injektion im Blutkreislauf zirkulierend beobachtet werden. Falls eine andere Position als die seitliche Ansicht erforderlich ist, montieren Sie die Embryonen in 1,5 % Methylcellulose und verwenden Sie ein Haarschleifen-Werkzeug, um den Embryo in die gewünschte Position zu bringen, um die Infektion mit einem invertierten konfokalen Mikroskop abzubilden.Platzieren Sie einen Tropfen Aeros mit niedrigem Schmelzpunkt auf einer Glasboden-Schale. Geben Sie das anästhesierte Embryo in den Aeros-Tropfen mit einer geringen Menge Ei-Wasser und verwenden Sie ein Haarschleifen-Werkzeug, um das Embryo in die gewünschte Position zu bringen. Lassen Sie den Aeros erstarren und tauchen Sie den Aeros-Tropfen in Ei-Wasser, das Trica enthält.Die Probe ist nun bereit für die konfokale Bildgebung. Die Injektion von Salmonella typhimurium- oder Mycobacterium marum-Bakterien in die Blutinsel von Embryonen erfolgt einen Tag nach der Befruchtung und führt zu einer schnellen Phagozytose durch Makrophagen. Die Ausbreitung der vergleichsweise großen und stark fluoreszierenden, mit DS.Red markierten Styrian-Bakterien kann direkt mittels Stereofluoreszenz- und konfokaler Bildgebung zwei Stunden nach der Infektion beobachtet werden. Die Aufnahmen zeigen, dass viele Bakterien von fluoreszierenden Makrophagen phagozytiert wurden.Eine Injektionsdosis von 250 KBE des Wildtyps styria löst eine starke proinflammatorische Reaktion aus und ist innerhalb eines Tages tödlich. Im Gegensatz dazu führt die intravenöse Injektion von erum zu einer persistierenden Infektion, bei der infizierte Makrophagen dichte Aggregate bilden, die als frühe Stadien von Granulomen angesehen werden, dem charakteristischen Merkmal der Tuberkulose. Die konfokale Abbildung eines granulomähnlichen Aggregats in der transgenen EG one EGFP-Linie fünf Tage nach der Infektion zeigt das intrazelluläre Wachstum von m cherry-markierten M num-Bakterien.Innerhalb der grün fluoreszierenden Makrophagen können Bakterien in die Hinterhirnventrikel injiziert werden, ein Kompartiment, das 32 Stunden nach der Befruchtung keine Makrophagen enthält. Die Injektion von 20 bis 100 M cherry-markierten M marum-Bakterien in diesen Bereich führt zu einer raschen Infiltration durch Makrophagen, die die Bakterien phagozytieren, wie hier gezeigt. Durch die Verwendung des transgenen M-P-X-E-G-F-P führt die Injektion von etwa 20 KBE Styria in die otische Vesikel innerhalb von drei Stunden nach der Infektion zur Anwerbung von Neutrophilen. Während diese Reaktion bei PBS-Kontrollinjektionen nicht beobachtet wird, stellt die Chorda dorsalis, die resistent gegenüber der Infiltration durch Leukozyten zu sein scheint, einen permissiven Kompartiment für das Wachstum von erum-Mutanten dar, die stark attenuiert sind, wenn sie in andere Gewebe injiziert werden.Nach der Yolk-Injektion einer Dosis von 2240 KBE breiten sich die Erregerbakterien über mehrere Tage hinweg in den embryonalen Geweben aus und bilden granulomartige Aggregate, ähnlich wie bei der konventionellen intravenösen Injektionsmethode beobachtet. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die korrekte Stadieneinteilung der Zebrafischembryonen entscheidend ist, da das embryonale Immunsystem im Verlauf der Entwicklung zunehmend leistungsfähiger wird.Nach diesem Verfahren können weitere Methoden wie die Transkriptom-Profilierung und Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise wie das embryonale angeborene Immunsystem auf pathogene Infektionen reagiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die rasante Entwicklung, geringe Größe und Transparenz der Zebrafisch sind enorme Vorteile für das Studium der angeborenen Immunabwehr Kontrolle der...

Nicht-invasive Bildgebung von disseminierter Candidiasis in Zebrafischlarven

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 Fluoreszenzbildgebung von Biomaterial-assoziierten bakteriellen Infektionen in Zebrafischembryonen

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Modellierung von Darminfektionen bei Zebrafischlarven unter Verwendung lebensmittelbedingter Bakterien

Optisch transparente Zebrafischembryonen werden häufig verwendet, um die Wechselwirkungen zwischen pathogenen Mikroorganismen und den angeborenen Immunzellen in Echtzeit zu untersuchen und zu visualisieren. Die Mikroinjektion von Mycobacterium abscessus, kombiniert mit Fluoreszenzbildgebung, wird verwendet, um wesentliche pathogene Merkmale wie die Nabelschnurbildung in Zebrafischembryonen zu untersuchen.

Entschlüsselung und Imaging Pathogenese und Cording von<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafischembryonen

Die vorliegende Studie beschreibt ein Zebrafish Embryos Modell zur in-vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierten Infektionen im Laufe der Zeit anhand der Fluoreszenz-Mikroskopie. Dieses Modell ist ein viel versprechende Ergänzung Säugetier-Tiermodellen wie Maus-Modellen für das Studium Biomaterial-Infektionen in-vivo.

Zebrafish Embryos Modell für bei Vivo Visualisierung und intravitalen Analyse von Biomaterial-assoziierte Staphylococcus Aureus Infektion

Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Visualisierung des Makrophagenverhaltens und des Todes bei embryonalen Zebrafischen während einer Mycobacterium marinum-Infektion. Schritte zur Herstellung von Bakterien, Infektionder tenatierter Embryonen und intravitale Mikroskopie sind enthalten. Diese Technik kann auf die Beobachtung von Zellverhalten und Tod in ähnlichen Szenarien mit Infektion oder sterile Entzündung angewendet werden.

Visualisierung des Makrophagen-Lytic Zelltodes während der mykobakteriellen Infektion bei Zebrafischembryonen mittels Intravital-Mikroskopie

Derzeit fehlt es an in vivo-Modellen , die sich für ein Wirkstoffscreening gegen chronische bakterielle Infektionen eignen. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Wundinfektion mit einem klinischen Isolat von Pseudomonas aeruginosa , um eine persistierende Infektion bei Zebrafischlarven zu erzeugen.

Modellierung einer persistierenden Pseudomonas aeruginosa-Infektion bei verwundeten Zebrafischlarven

Erfahren Sie die Mikroinjektion fluoreszierender Bakterien in Zebrafisch-Embryos zur Live-Bildgebung von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung intrazellulärer Bakterien in Phagozyten mittels Fluoreszenz- und Konfokalmikroskopie.

Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

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