Name: Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung löslicher und unlöslicher Prion-Proteine aus normalem menschlichem Hirngewebe. Diese Methode nutzt Ultrazentrifugation und Chromatographie für die Neurodegenerationsforschung.

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Die Autoren danken dem menschlichen Gehirn und Rückenmarksflüssigkeit Resource Center (Los Angeles, CA) für die Bereitstellung von normalen Gehirn Muster. Diese Studie wurde von den National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, der CJD-Stiftung, Alliance biologisch sicher, sowie die University Center on Aging und Gesundheit mit Unterstützung der McGregor-Stiftung und des Präsidenten Discretionary Fund (Case Western Reserve University) unterstützt .

Ein. Vorbereitung der Hirnhomogenat und Waschmittel-Soluble (S2) und-unlöslich (P2) Fraktionen <ol><li> Nehmen 100 mg gefrorenes menschliches Gehirngewebe und 100 ul Lysepuffer (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4). </li><li> Homogenisieren auf Eis mit Pistill durch ein schnurloses angetrieben, frieren sie in Trockeneis für 5 min und homogenisieren Sie es erneut mit Pistill durch die Hände und dann durch einen Motor angetrieben, und 300 ul oder 800 ul Lysepuffer (dies ist entweder die 20 % oder 10% insgesamt Hirnhomogenat, jeweils). </li><li> Zentrifugieren 20% oder 10% Gesamt-Hirnhomogenisat bei 1.000 xg für 10 min bei 4 ° C bis Überstand (S1) unter Verwendung einer Tischzentrifuge sammeln. </li><li> Ultrazentrifuge 10% S1 bei 35.000 rpm (100.000 × g) in einem SW55 Rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) für 1 Stunde bei 4 ° C. Die Überstände (S2), die das Detergens-löslichen Fraktion in ein sauberes Röhrchen enthalten. Resuspendieren der Pellets, die Detergens-unlöslichen enthaltenFraktion (P2) in 100 ul oder 200 ul Lysepuffer bis 10 machen - oder 5-fach konzentrierte Zubereitung. </li><li> Für PK-Verdauung, inkubieren der Probe mit den gleichen Mengen an PK bei 50 pg / ml bei 37 ° C für 1 Stunde für beide S2 und P2 Fraktionen. Hinzufügen Phenylmethylsulfonylfluorid bei einer Endkonzentration von 5 mM und gleiche Volumina von SDS-Probenpuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 50 mM Tris, pH 6,8), um die PK Verdau beenden. Man kocht die Proben für 10 Minuten und kühlen diese bei Raumtemperatur für 5 min. Sie sind bereit, für Western-Blot. </li></ol> 2. Velocity Sedimentation in Sucrose Stufengradienten <ol><li> Inkubieren 450 ul 20% S1 mit einem gleichen Volumen von 2% Sarkosyl in H 2 O für 30 min auf Eis. </li><li> 0,5 ml jeder von 60%, 30%, 25%, 20%, 15% und 10% Saccharose in ein Rohr mit einem Beckman maximal 5 ml Inhalt. </li><li> Geladen 0,4 ml S1 auf die Oberseite der 10-60% Saccharose Stufengradienten. </li><li> Zentrifuge bei 48000 Upm (200.000 × g, SW55 Rotor) für 1 h bei 4 ° C. </li><li> Collect 283 ul Fraktion jeweils von oben auf das Rohr und 12 Fraktionen erhalten insgesamt. </li><li> Nehmen Sie 20 ul jeder Fraktion zu einem neuen Eppendorf-Röhrchen, fügen Sie 20 ul Probenpuffer, und kochen für 10 min. </li><li> Coole Proben für 4 min in der Kapuze, bei 1.000 xg für 1 min und Vortex sie zentrifugieren. Legen Sie die Proben auf einer pre-cast-Gel. </li></ol> 3. Size Exclusion Chromatography <ol><li> Verwenden Superdex 200 HR-Perlen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) in einem 1 x 30 cm Säule, um die oligomeren Zustand von PrP Molekülen zu bestimmen. </li><li> Sieben Molekularmasse Marker (Sigma, St. Louis, MI) einschließlich Dextran blau (2000 kDa), Thyroglobulin (669 kDa), Apoferritin (443 kDa), β-Amylase (200 kDa), Alkoholdehydrogenase (150 kDa), Albumin ( 66 kDa) und Carboanhydrase (29 kDa) sind unabhängig voneinander in den Konzentrationen von Sigma in 200 ul Probenvolumina empfohlen geladen. </li><li> Das Elutionsvolumen von blauen dextran wird verwendet, um das Hohlraumvolumen (V 0 = 8,45 ml) und das Gesamtvolumen (V t = 24 ml) wird durch das Produkt der Anweisung für bestimmen. Die Peak-Elutions-Volumina (V e) von dem Chromatogramm und fraktionierte Retentionen berechnet. K av, der Verteilungskoeffizient (Definition Probe Verhalten), berechnet unter Verwendung der Gleichung: K av = (V E - V 0) / (V t - V 0). Die Kalibrationskurve durch Auftragen der K av der Proteinstandards gegen den log MG des Standards 8 bestimmt. </li><li> Das Molekulargewicht (MW) der einzelnen Spezies in verschiedenen PrP FPLC Fraktionen gewonnen wird gemäß einer Eichkurve mit dem Gelfiltration verschiedener Standards erzeugt ausgewertet. </li><li> Inject 200 ul S1 in Lysepuffer mit 1% Sarkosyl in die Spalte für jeden Lauf. </li><li> Chromatographie in einem FPLC-System (GE Healthcare) bei einer Flussrate von 0,25 ml / min und Fraktion durchgeführts von 0,25 ml werden gesammelt, indem ein Fraktionssammler (Amersham Biosciences, RediFrac). </li><li> Inkubieren 0,125 ml jeder Fraktion mit 0,5 ml vorgekühltes Methanol bei -20 ° C für 2 Stunden. </li><li> Zentrifuge Proben bei 13.000 × g für 30 min bei 4 ° C in einer Tisch-Mikrozentrifuge. Überstand verwerfen und das Pellet in 20 ul SDS-Probenpuffer wie oben erwähnt, Kochen für 10 min, auf Raumtemperatur abkühlen lassen, laden Sie sie auf einen pre-cast-Gel. </li></ol> 4. Erfassung von PrP durch g5p <ol><li> Die g5p Moleküls (100 ug) (freundlicherweise von Drs. Geoff Kneale und John McGeehan von der University of Portsmouth, UK zur Verfügung gestellt) konjugiert ist 7 x 10 8 Tosyl aktiviert magnetische Kügelchen durch Inkubation 100 ug g5p und 350 ul g5p Perlen in 1 ml Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS) bei 37 ° C für 20 Stunden. Attract g5p-Perlen an der Seitenwand des Eppendorf-Röhrchen durch externe magnetische Kraft und entfernen Sie dann alle Lösung. Waschen der Kügelchen mit 1 ml PBS, enthaltend0,1% Rinderserumalbumin (BSA) für dreimal. </li><li> Inkubieren g5p-konjugierte Kügelchen in 1 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 mit 0,1% BSA bei 37 ° C für 5 Stunden um nicht-spezifische Bindung zu blockieren und dann Waschen der Kügelchen mit 1 ml PBS, enthaltend 0,1% BSA für dreimal wie oben erwähnt. Entfernen Sie die Lösung und 1 ml PBS in die Perlen. Die vorbereiteten g5p Perlen sind für mindestens 3 Monate stabil bei 4 ° C. </li><li> Die Einnahme von PrP durch g5p wird durch Inkubieren 100 ul S1 Fraktionen oder P2 mit 60 ul g5p konjugierte Kügelchen (10 ug Protein / 6 x 10 7 Kügelchen) in 1 ml Bindungspuffer (3% Tween-20, 3% NP-durchgeführt 40 in PBS, pH 7,5). </li><li> Nach Inkubation mit ständiger Rotation für 3 Stunden bei Raumtemperatur werden die PrP-haltigen g5p Kügelchen an der Seitenwand des Eppendorfröhrchen durch externe Magnetkraft angezogen, so dass für die einfache Entfernung aller ungebundenen Moleküle in der Lösung. </li><li> Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (2% Tween-20 und 2% NP-40 in PBS, pH 70,5) werden g5p Kügelchen gesammelt und bei 95 ° C für 5 min in der SDS-Probenpuffer (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% Glycerin, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8). </li><li> Nach Abkühlen Proben für 5 Minuten bei Raumtemperatur werden die Proben bei 1000 × g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Überstände sind bereit für Western-Blot. </li></ol> 5. Western Blot <ol><li> Last Proben in der SDS-Probenpuffer auf 15% Tris-HCl-Criterion vorgegossenen Gelen (Bio-Rad) bei 150 V gekocht für ~ 80 min. </li><li> Die Proteine ​​auf dem Gel auf eine PVDF werden für 2 h bei 70 V überführt. </li><li> Nach Blockieren Membranen in 5% Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung, die 0,01% Tween-20 (TBS-T) werden die Membranen für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit primären monoklonalen oder polyklonalen Antikörper 3F4 (1:40.000) inkubiert, 1E4 (1 : 1000), Anti-N 8 (1:6000) oder anti-C 8 (1:6.000) zum Sondieren der PrP Molekül. </li><li> Nach Inkubation mit HRP-konjugiertem Schaf-anti-Maus-IgG an1:3000 oder Esel-Anti-Kaninchen-IgG bei 1:3000 die PrP Bänder sind auf Kodak-Film mit ECL Plus visualisiert, in Übereinstimmung mit dem Protokoll des Herstellers. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Verglichen mit sporadischer CJD Proben wurde eine kleine Menge an C IPRP im P2-Fraktion in normalen Gehirnen erkannt, obwohl die meisten von PrP C in der S2-Fraktion (Abbildung 1) wurde gewonnen. Wie zuvor angedeutet 8, IPRP macht etwa 5-25% des gesamten PrP einschließlich voller Länge und N-terminal verkürzten Spezies. Analysen unter Verwendung von Saccharose Stufengradienten Sedimentation zeigte, dass die meisten von PrP C von nicht CJD Gehirne in den Kopffraktionen 1-3 zurückgewonnen wurde, geringe Mengen an PrP wurden auch in den unteren Fraktionen 9-11 enthalten, die normalerweise große Aggregate 8 (Abbildung detektiert 2). Eine Vielzahl von PrP Sc Arten läuteteten aus Monomeren wurden kleine Oligomere zu größeren Aggregaten durch Gelfiltration im Gehirn mit Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (3A) isoliert. Jedoch wurde eine kleine Menge von größeren Aggregaten mit einem Molekulargewicht von mehr als 2.000 kDa auch in unlöslichen Fraktionen von normalen Gehirnen (3C) detektiert. Außerdem wurden Dimere und Tetramere von PrP C nicht nur in unlöslichen Fraktionen, aber auch in löslicher Fraktionen (3B und 3C) detektiert. Nach PK und PNGase Behandlung wurde das PrP durch g5p eingefangen mit dem 1E4 Antikörper, der gegen PrP97-105 8 detektiert. Drei PK-resistentem Kern Fragmenten gefasst PrP * 20, * 19 PrP und PrP * 7 erkannt wurden, wandern bei ~ 20 kDa, 19 kDa und ~ ~ 7 kDa (Abb. 4, linke Tafel). Es wurde jedoch kein PrP erkannt, wenn der 1E4 Antikörper wurde mit einem synthetischen Peptid, das eine Sequenz hat ident vorinkubiertschen dem 1E4-Epitop (Abbildung 4, Mitte), was darauf hinweist, dass Bands von 1E4 erkannt PrP-Fragmente sind. Zudem ergab die anti-C Antikörper zwei verschiedenen PrP-Fragmente Migration bei ~ 18 kDa (PrP * 18) und ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), zusätzlich zu PrP * 20 (Abbildung 4, rechts). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" /> Abbildung 1. Erkennung von IPRP C und IPRP Sc. Nach der Behandlung mit PNGase F auf 1/10 des gesamten Reaktionsvolumens bei 37 ° C für 1 Stunde an Glykane vom Protein in voller Länge oder N-terminal verkürzte PrP Spezies in den löslichen und unlöslichen Fraktionen (S2 und P2) getrennt zu entfernen durch Ultrazentrifugation im Gehirn Proben von normalen Kontrolle (CTL) und sporadische CJD (sCJD) wurden mit 3F4 gegen PrP106-112 (links), Anti-N gegen PrP23-40 (Mitte) erkannt wird, und Anti-C gegen PrP220-231 (rechts). In CTL-Proben wird eine kleine Menge von PrP in P2 detektiert, während eine große Menge vorhanden ist in S2. Im Gegensatz dazu wird in mehr PrP P2 als in S2 in sCJD Proben nachgewiesen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" /> Abbildung 2. Sedimentation von PrP in Saccharose Stufengradienten. PrP in einzelnen Fraktionen aus 1 bis 11 der nicht-CJD Hirnprobe S1 wurde durch Western-Blotting mit 3F4 detektiert. Obwohl die meisten von PrP C in Kopffraktionen 1-3 detektiert wurde, wurden kleine Mengen an PrP auch im unteren Fraktionen 9-11 beobachtet. Darüber hinaus ist das Bandenmuster von PrP von oben und unten unterschiedliche: PrP in den Kopffraktionen zurückgewonnen hat eine dominante oberen Bandes, während PrP in den unteren Fraktionen zurückgewonnen hat eine dominante unteren Band. Ein PK-behandelten PrP Sc wurde als Kontrolle auf der rechten Seite der Blot geladen. <img alt = &quot;Abbildung 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg&quot; /&gt; Abbildung 3. Nachweis von löslichen und unlöslichen PrPC Oligomere. Lösliche und unlösliche PrP C von normalen menschlichen Gehirne wurden durch Ultrazentrifugation getrennt und anschließend einer Gelfiltration unterworfen sind. Die molekularen Größen von einzelnen Fraktionen wurden durch Ausführen einer Gruppe von Molekularmasse Marker gemessen. (A) PrP Sc Arten aus sCJD Hirnproben. Zwei Populationen von PrP Arten wurden entdeckt: Gelfiltrationsfraktionen 49 bis 65 enthalten Monomere und kleine Oligomere, während Fraktionen 27-33 große Aggregate enthalten. Die PrP C Spezies aus löslichen Fraktion (S2) (B) und unlösliche Fraktion (P2) (C) von normalen Kontrollen gefunden wurden. PrP wurde mit dem 3F4-Antikörper sondiert. Dimere (Fraktion 55) und Tetramere (Fraktion 51) von PrP wurden nicht nur in P2 aber auch in S2 von normalen Gehirn detektiert sampln (B und C). Große Aggregate wurden nur in P2 des normalen Proben (C) detektiert wird. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" /> Abbildung 4. Erkennung von verschiedenen PK-resistente IPRP Fragmente in g5p angereicherte Präparate aus normalen menschlichen Gehirnen. Proben durch g5p angereichert wurden mit PK und PNGase F vor Westernblotting Sondieren mit 1E4 (linke Tafel), 1E4 mit einem synthetischen Peptid, das eine Sequenz identisch mit dem Epitop 1E4 (Mitte) hatte vorinkubiert behandelt und Anti-C ( rechts). 1E4 erkannt drei PK-resistente PrP-Fragmente genannt PrP * 20, PrP * 19 und PrP * 7 (links). Nach der Blockierung der 1E4 mit dem Peptid wurden keine PrP res erkannt (Mitte), was darauf hinweist, dass die Bänder mit 1E4 erkannt PrP-Fragmente sind. Anti-C ergab zwei zusätzlich PK-resistente PrP-Fragmente genannt PrP * 18 und PrP-CTF12 /13, zusätzlich zu PrP * 20.

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions.+Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li>
<li>Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li>
<li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li>
<li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li>
<li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+%28SAF%29+has+the+same+size%2C+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+%28PrP%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li>
<li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li>
<li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+prions+lying+in+wait%3A+a+two-hit+model+of+prion%2Famyloid+formation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li>
<li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li>
<li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variably+protease-sensitive+prionopathy%3A+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li>
<li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li>
<li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZou%2C+WQ+%22Methods+in+Molecular+Biology-Neurogenetics%3A+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols</a>. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).</li>
<li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Kombination von Ansätzen über die hier berichtet isoliert konsequent unlöslichen PrP C Aggregate und löslichen PrP C Oligomere aus dem normalen menschlichen Gehirns. Ultrazentrifugation bei 100.000 × g für eine Stunde ist eine klassische Methode, die in großem Maße für die Trennung der unlöslichen PrP Sc von der löslichen PrP C 14 verwendet. Während es effizient ist, eine der Verwarnung ist, um eine Verunreinigung während des Ziehens den Überstand (S2) nach dem Zentrifugie...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Phenylmethylsulfonylfluorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P7626 </td><td> 72 mM in 2-Propanol </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2308 </td><td> 2 mg / ml in H 2 O </td></tr><tr><td> PNGase F </td><td> New England Biolabs </td><td> MWGF200 </td><td></td></tr><tr><td> Ultrazentrifuge LE-80K, SW55 Rotor </td><td> Beckman Coulter </td><td> Art.-Nr. 365668, 356860 </td><td></td></tr><tr><td> Superdex 200 HR Kügelchen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-1088-01 </td><td></td></tr><tr><td> AKTA FPLC-System </td><td> GE Healthcare </td><td> 18-1900-26 </td><td></td></tr><tr><td> Molekulargewichtsmarker </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MWGF200 </td><td> Variiert </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Magnetkügelchen </td><td> Invitrogen </td><td> 143-01 </td><td></td></tr><tr><td> 3F4 Antikörper </td><td> Covance </td><td> SIG-39600 </td><td></td></tr><tr><td> 1E4-Antikörper </td><td> Cell Sciences </td><td> M1840 </td><td></td></tr><tr><td> Gel bereit 15% Tris-HCl vorgegossenen Gelen </td><td> Bio-Rad </td><td> 345-0020 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von löslicher und unlöslicher prp oligomere in das normale menschliche gehirn

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Das zentrale Ereignis in der Pathogenese von Prion-Erkrankungen umfasst eine Umwandlung des Host-kodierten zellulären Prionen-Proteins PrP C in seine pathogene Isoform PrP Sc ein. PrP C ist Detergenz-löslichen und empfindlich gegenüber Proteinase K (PK)-Verdau, während PrP Sc bildet Detergens-unlöslichen Aggregaten und ist teilweise resistent gegen PK 2-6. Die Umwandlung von PrP C zu PrP Sc ist bekannt, einen Konformationswechsel α-Helix zu β-Faltblatt-Strukturen des Proteins beinhalten. Jedoch ist die in vivo-Weg noch wenig verstanden. Eine vorläufige endogenen PrP Sc-, Zwischen-PrP * oder &quot;silent Prion&quot;, muss noch in der nicht infizierten Gehirn 7 identifiziert werden. Mit einer Kombination von biophysikalischen und biochemischen Ansätzen haben wir festgestellt, unlösliche PrP C Aggregate (benannt IPRP C) von nicht infizierten Säugetieren Gehirn und kultivierten neuronalenZellen 8, 9. Hier beschreiben wir detaillierter Verfahren dieser Methoden, einschließlich Ultrazentrifugation in Detergenspuffer, Saccharose Stufengradienten Sedimentation, Größenausschlusschromatographie, IPRP Anreicherung durch Gen-5-Protein (g5p), die spezifisch an PrP strukturell veränderten Formen 10 und PK-Behandlung. Die Kombination dieser Ansätze isoliert nicht nur unlösliche PrP Sc und PrP C Aggregate aber auch lösliche Oligomere PrP C von der normalen menschlichen Gehirns. Da die Protokolle hier beschrieben wurden verwendet, um sowohl PrP Sc aus infizierten Gehirnen und IPRP C von nicht infizierten Gehirn zu isolieren, geben sie uns die Möglichkeit, Unterschiede in der physikalisch-chemischen Eigenschaften, Neurotoxizität und Infektiosität zwischen den beiden Isoformen zu vergleichen. Eine solche Studie wird deutlich verbessern unser Verständnis der infektiösen proteinhaltigen Krankheitserreger. Die Physiologie und Pathophysiologie der IPRP C sind derzeit unklar. Insbesondere in einem neu-identified menschlichen Prion-Erkrankung bezeichnet variabel Protease-sensitive prionopathy, fanden wir ein neues PrP Sc, die immunreaktiven Verhalten und Fragmentierung mit IPRP C 11, 12 Aktien. Darüber hinaus haben wir kürzlich gezeigt, dass IPRP C die wichtigsten Arten, die mit Amyloid-β-Protein in Alzheimer-Krankheit 13 zusammenwirkt. In derselben Studie wurden diese Methoden zur Abeta Aggregate und Oligomere in Alzheimer 13 isolieren, was nahelegt, deren Anwendung auf nicht-Prionprotein Aggregate in anderen neurodegenerativen Erkrankungen involviert.

Eine neue Art der zellulären Prion-Protein (PrP<sup&gt; C</sup&gt;) Wurde kürzlich in infizierten menschlichen Gehirnen mit den hier beschriebenen Methoden identifiziert worden. Diese Methoden können verwendet werden, um verschiedene PrP-Spezies zu isolieren, während einige von ihnen sind auch nützlich, um anderen fehlgefalteten Proteinaggregate aus menschlichen Gehirnen.

Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

Das zentrale Ereignis in der Pathogenese von Prionenerkrankungen ist die Umwandlung des vom Wirt kodierten zellulären Prionproteins PrPC in seine pathogene Isoform ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, das lösliche und unlösliche Pion-Protein oder PRP aus allen Bändern im normalen menschlichen Gehirn zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zuerst das menschliche Hirngewebe homogenisiert und die Fraktionen isoliert werden. Anschließend erfolgt die Geschwindigkeits-Sedimentation in sukzessiven Saccharose-Gradienten.Dann wird eine Gelpermeationschromatographie durchgeführt. Schließlich wird PRP mit dem Gen-fünf-Protein oder G fünf P erfasst. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die Isolierung löslicher und unlöslicher PRP oder Ligamente aus dem normalen menschlichen Gehirn durch Ultrazentrifugation in Saccharose-Stufengradienten, Größenausschlusschromatographie und Erfassung von PRP mittels G fünf P zeigen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Forschung zu Prionerkrankungen zu beantworten, einschließlich der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, der BO-Ponton-Enzephalopathie und klinischer Abbauekrankungen. Zudem können sie Einblicke in die Isolierung löslicher und unlöslicher Proteinaggregate liefern, nicht nur bei Prionerkrankungen, sondern auch bei anderen Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit und Parkinson-Krankheit.Im Allgemeinen werden Personen, die neu in diesen Methoden sind, Schwierigkeiten haben, da alle experimentellen Schritte wichtig sind und besondere Sorgfalt erfordern. Eine Video-Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die SEC-Fi-Tiefe groß ist und die PRP-Gewinnung mit G-five-P schwierig zu benennen ist; diese Schritte können ohne präzisere Durchführung problematisch sein. Um ein Gehirnhomogenat herzustellen, geben Sie zunächst 100 µL Puffer zur Zelllyse zu 100 mg gefrorenem Hirngewebe unter Verwendung eines motorisierten Stößels, homogenisieren das Gewebe auf Eis, gefrieren es fünf Minuten lang auf Trockeneis ein und homogenisieren es erneut.Stellen Sie ein 20 % oder 10 %iges Gesamthirnhomogenat her, indem Sie jeweils 300 oder 800 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen. Zentrifugieren Sie das Homogenat in einer Tischzentrifuge bei 1000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie die SNA und zentrifugieren Sie die S1-Fraktion in einem SW 55-Rotor bei 35.000 U/min für eine Stunde bei vier Grad Celsius.Überführen Sie das Überstand in ein sauberes Röhrchen (Resus). Suspendieren Sie das detergentenunlösliche Pellet in Puffer zur Lyse, um Proben für die Westernblot-Analyse vorzubereiten. Inkubieren Sie die Fraktionen S zwei und P zwei mit 50 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K für eine Stunde bei 37 Grad Celsius.Beenden Sie die Verdauung durch Zugabe von fünf Millimolar PMSF und SDS-Probenpuffer. Kochen Sie die Proben 10 Minuten lang und lassen Sie sie anschließend fünf Minuten bei Raumtemperatur abkühlen. Um die Geschwindigkeitszentrifugation durchzuführen, inkubieren Sie zunächst 450 Mikroliter der 20 % S1-Fraktion mit einem gleichen Volumen 2 % Sarco X in Wasser 30 Minuten lang auf Eis in 5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Geben Sie jeweils 0,5 Milliliter der 60, 30, 25, 20, 15 und 10 %igen Saccharose-Lösungen hinzu und überlagern Sie 0,4 Milliliter der inkubierten S1-Probe auf die 10–60 %ige Saccharose. Zentrifugieren Sie mit einer Stufengradientenzentrifugation im SW 55-Rotor bei 48.000 U/min eine Stunde lang bei vier Grad Celsius ausgehend von der Oberseite des Röhrchens. Sammeln Sie 12 gleiche Fraktionen zu je 283 Mikrolitern. Verwenden Sie 20 Mikroliter aus jeder Fraktion und ein gleiches Volumen an SDS-Probelösungspuffer.Um SDS-Page-Gelproben vorzubereiten, die Proben 10 Minuten lang kochen, dann vier Minuten ruhen lassen. Die Proben eine Minute bei 1000 G zentrifugieren.Vortexen Sie sie anschließend, bevor Sie sie auf ein vorgefertigtes Gel für die Größenausschlusschromatographie auftragen. Mithilfe der Chromatographie wird der oligomere Zustand von PRP-Molekülen bestimmt. Tragen Sie zunächst 200 Mikroliter Proben von sieben einzelnen Molekülmasse-Markern auf eine 1 × 30-Säule mit SUEx-200-HR-Kügelchen auf.Verwenden Sie das Elutionsvolumen von Blau-Dextran als Porenvolumen. Berechnen Sie die Elutionsvolumina der Peaks von VE aus dem Chromatogramm und den Fraktionsretentionen. Berechnen Sie den Partitionskoeffizienten KAV mit der Gleichung KAV gleich V minus V null geteilt durch VT minus V null.Um eine Kalibrierungskurve zu erstellen, tragen Sie den KAV der Proteinstandards gegen den Logarithmus des Molekulargewichts der Standards auf. Anschließend geben Sie 200 Mikroliter von S eins auf die Säule bei einer Flussrate von 0,25 Millilitern pro Minute.Waschen Sie die Säule mit Lysepuffer 1 % cile und eluieren Sie mithilfe eines Fraktionssammlers 0,25-Milliliter-Fraktionen. Inkubieren Sie jeweils 125 Mikroliter aus jeder Fraktion mit 500 Mikrolitern vorgekühltem Methanol bei minus 20 Grad Celsius für zwei Stunden. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 × g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.Resuspendieren Sie das Pellet in 20 µL SDS-Pufffer und erhitzen Sie es 10 Minuten lang zum Sieden. Bringen Sie es auf Raumtemperatur und trennen Sie es auf 15 %igen Polyacrylamidgelen auf. Verwenden Sie die Standardkurve, um die Molekulargewichte der verschiedenen gewonnenen PRP-Spezies abzuleiten, um das G5P-Molekül an die magnetischen Perlen zu konjugieren.Incubieren Sie 100 Mikrogramm G fünf P mit 350 Mikrolitern Toci-aktivierten magnetischen Perlen in einem Milliliter PBS bei 37 Grad Celsius für 20 Stunden. Verwenden Sie einen externen Magneten, um die G-fünf-P-Perlen an die Seitenwand der Eppendorf-Röhrchen anzulagern, und entfernen Sie die Lösung. Waschen Sie die Perlen dreimal mit je einem Milliliter PBS mit 0,1 % BSA, um unspezifische Bindungen zu blockieren.Inkubieren Sie die mit G fünf P konjugierten Kügelchen in einem Milliliter 0,2 mol Tris, HCl, pH 7,4, das 0,1 % BSA enthält, für fünf Stunden bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Kügelchen anschließend dreimal. Entfernen Sie die letzte Waschung und geben Sie ein Milliliter PBS zu, um PRP zu isolieren. Inkubieren Sie 100 Mikroliter von S eins oder P zwei mit 60 Mikrolitern G-fünf-B-konjugierten Kügelchen in einem Milliliter Bindungspuffer unter konstanter Rotation für drei Stunden bei Raumtemperatur.Stellen Sie das Röhrchen auf den Magneten. Entfernen Sie die Lösung und waschen Sie die Kügelchen dreimal mit Waschpuffer. Entfernen Sie den letzten Waschschritt und geben Sie SDS-Probelösungspuffer hinzu.Erhitzen Sie die Kügelchen auf 95 Grad Celsius für fünf Minuten. Laden Sie die Proben auf vorgefertigte 15%-Gele auf und laufen Sie bei 150 Volt für etwa 80, 80 Minuten. Übertragen Sie die Proteine nach dem Blockieren der Membranen in 5% Milch in TBST zwei Stunden lang bei 70 Volt auf PVDF. Incubieren Sie sie zwei Stunden bei Raumtemperatur mit den PRP-Antikörpern. Drei F vier eins E vier anti N oder anti C, anschließend Inkubation mit HRP-konjugierten sekundären Antikörpern; inkubieren Sie die Membran und die Chemilumineszenzlösung gemäß den Herstelleranweisungen und belichten Sie den Film wie hier gezeigt im Vergleich zu sporadischen CRUT-Ventil-Jaakko-Krankheit- oder CJD-Proben. Eine geringe Menge unlöslichen zellulären PRP wurde in der P zwei-Fraktion aus normalen Gehirnen nachgewiesen.Doch der größte Teil wurde im S2-Fraktion erholt. Insolubles PRP macht ungefähr fünf bis 25 % des gesamten PRP aus, einschließlich vollständiger und an den Enden abgekürzter Spezies. Analysen mittels sukzessiver Saccharose-Gradientenzentrifugation zeigten, dass zwar der größte Teil des PRPC aus nicht-CJD-Gehirnen in den oberen Fraktionen nachgewiesen wurde, jedoch wurden auch kleine Mengen von PRP in den unteren Fraktionen (9–11) detektiert, die normalerweise große Aggregate enthalten. Eine Vielzahl pathogener PRP- oder PRP-SC-Spezies, reichend von Monomeren,Kleinere Ligamente und größere Aggregate wurden mittels Gelfiltration im Gehirn mit CRUT-Ventil-Yakup-Krankheit isoliert. Überraschenderweise wurde ebenfalls eine geringe Menge größerer Aggregate mit einem molekularen Gewicht von mehr als 2000 Kilodalton in unlöslichen Fraktionen normaler Gehirne nachgewiesen. Darüber hinaus wurden Dimere und Tetramere von PRPC nicht nur in unlöslichen Fraktionen, sondern auch in unlöslichen Fraktionen detektiert.Nach der Behandlung mit PK und P-NGAs. Das durch G-five-P erfasste PRP wurde mit dem one-E-four-Antikörper gegen PRP 97 1 0 5 3 nachgewiesen. PK-resistente Kernfragmente, bezeichnet als PRP*-20, PRP*-19 und PRP*-7, wurden bei 20 Kilodalton, 19 Kilodalton bzw. 7 Kilodalton wanderverhalten.Doch wurde kein PRP nachgewiesen, wenn der one-E-four-Antikörper zuvor mit einem synthetischen Peptid inkubiert wurde, das eine identische Sequenz wie das one-E-four-Epitop aufweist, was darauf hinweist, dass die von one E four detektierten Banden PRP-Fragmente sind. Der Anti-C-Antikörper detektierte zwei verschiedene PRP-Fragmente, die bei etwa 18 Kilodalton und bei etwa 12 bis 13 Kilodalton wandern. Zusätzlich zur PRP-ETE-20-Einmal-Methode.Diese Technik kann innerhalb von vier Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das lösliche und unlösliche PRP-Polygam in der unteren menschlichen Gehirnregion nach der Entwicklung isoliert. Diese Technik ebnete den Weg für die Erforschung des Schicksals vor der Untersuchung von PIP-Bestätigungsdaten im Gehirn.

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Dieses Video zeigt das Protokoll zur Isolierung von Amyloidfibrillen aus Maushirngewebeextrakt mittels Dichtegradientenzentrifugation und Verdauung von Nicht-Amyloid-Proteinen.

Isolierung von Amyloid-Fibrillen aus Hirngewebeextrakt

Dieses Video erklärt den Prozess der Isolierung und Anreicherung von waschmittelunlöslichen Proteinaggregaten aus gefrorenem postmortalem menschlichem Hirngewebe. Es demonstriert die wichtigsten Schritte, einschließlich Homogenisierung, Waschmittelbehandlung, Beschallung und Ultrazentrifugation zur Trennung und Reinigung der unlöslichen Aggregate. Der letzte Schritt besteht darin, die Aggregate in Harnstoffpuffer für die weitere Analyse zu lösen.

Isolierung von detergenzien-unlöslichen Proteinaggregaten aus menschlichem postmortalem Hirngewebe

Eine gemeinsame Proteinextraktionsprotokoll unter Verwendung von Harnstoff / Thioharnstoff / SDS Puffer für Mensch und Maus Hirngewebe ermöglicht indentification von Proteinen mittels 2D-DIGE und ihre anschließende Charakterisierung von Mini 2DE Immunoblotting. Diese Methode ermöglicht es, mehr reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse aus menschlichen Biopsien und experimentellen Modellen zu erhalten.

Konsens Brain-derived Protein, Extraktionsprotokoll für das Studium der Human-und Maus-Gehirn-Proteome Mit Sowohl 2D-DIGE-und Mini-2DE Immunoblotting

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von zunehmend unlöslichem/aggregiertem alpha-Synuclein (α-syn) aus postmortalem menschlichem Hirngewebe. Durch die Verwendung von Puffern mit zunehmender Detergensfestigkeit und Hochgeschwindigkeits-Ultrazentrifugationstechniken können die variablen Eigenschaften der α-syn-Aggregation in erkranktem und nicht erkranktem Gewebe untersucht werden.

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Hier stellen wir ein Hirnmembran-Fraktionierungsprotokoll vor, das ein robustes Verfahren zur Isolierung von Proteinen, die zu verschiedenen synaptischen Kompartimenten gehören, darstellt.

Gehirn Membran Fraktionierung: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Bewertung der Subsynaptischen Protein-Lokalisierung

Eine abgekürzte Fraktionierung-Protokoll für die Bereicherung der Waschmittel-unlösliche Aggregate von Post-mortem Gehirn wird beschrieben.

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Hier wird eine Methode zur Isolierung der Ratte Gehirn mikrogefäßen und für die Vorbereitung der Membran Proben beschrieben. Dieses Protokoll hat den klaren Vorteil zur Herstellung von angereichertem kapilläre Proben mit akzeptablen Protein von einzelnen Tieren ergeben. Proben können dann für robuste Protein Analysen auf das Gehirn mikrovaskulären Endothel verwendet werden.

Eine einfache und reproduzierbare Methode, Membran-Proben von frisch isolierte Ratte Gehirn Mikrogefäßen vorzubereiten

Diese biochemische Reinigungsmethode mit massenspektrometriebasierter Proteomanalyse erleichtert die robuste Charakterisierung von Amyloidfibrillenkernen, was die Identifizierung von Zielen zur Vorbeugung der Alzheimer-Krankheit beschleunigen kann.

Biochemische Reinigung und proteomische Charakterisierung von Amyloid-Fibrillenkernen aus dem Gehirn

Erfahren Sie die Isolierung löslicher und unlöslicher Prion-Proteine aus normalem menschlichem Hirngewebe. Diese Methode nutzt Ultrazentrifugation und Chromatographie für die Neurodegenerationsforschung.

Isolierung von löslicher und unlöslicher PrP Oligomere in das normale menschliche Gehirn

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