Name: Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 40 s
Description: Erfahren Sie die standardisierte Methode zur Bestimmung der langfristigen letalen Toxizität über 14 Tage mit Artemia franciscana. Dieses Protokoll ermöglicht die Bewertung chemischer Substanzen und Umweltproben.

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Produziert von Loredana Manfra des Instituts für Umweltschutz und Forschung (ISPRA-Department of Environmental Quality Monitoring) und Federica Savorelli der Landesanstalt für Umweltschutz (Emilia-Romagna, Italien). Referenz Mitglieder für die Sub-Arbeitsgruppe für die Artemia Krustentier innerhalb der biologischen Methoden Group - Salzwasser / Brackwasser und Sediment des Unichim Kommission auf die Wasserqualität (das Institut für technische Standardisierung Betriebssystem in der chemischen Industrie). Videographie und Bearbeitung von Marco Pisapia von Ispra (Web-Unit). Die Produktion Koordination von Anna Maria Cicero und Erika Magaletti von Ispra (Department of Environmental Quality Monitoring). Wir möchten das regionale Amt für Umweltschutz der Emilia-Romagna, Ferrara Branch, die biologische Methode Gruppe danken - Salzwasser / BrackwasserWasser und Sediment des Unichim Kommission für Wassergüte-und Luciana Migliore, der Universität Tor Vergata (Rom) für die gute Zusammenarbeit; Rossella Boscolo und Massimo Gabellini von Ispra (Abteilung für Prävention und Abmilderung der Auswirkungen) für ihre finanzielle Unterstützung; Fabio Matassa und dem London School of Languages ​​in Rom für ihre sprachliche Unterstützung.

1. Method Standard Unsere Tests schließt ein, dass Artemia Larven auf ein Intervall von Stoffkonzentrationen oder einer Probe zum Zwecke der Bestimmung der Konzentration oder Verdünnung Ebenen, die den Tod von 50% der Organismen (LC 50) über 14 Tage ausgesetzt wäre und die die Bedingungen definiert nach diesem Verfahren. Wenn nötig und möglich, kann die folgende ermittelt werden: a) die Konzentration, die den Tod von 20% der Organismen ausgesetzt (LC 20) bewirkt, b) die höchste Konzentration analysiert Ebene, die nicht ermittelt, eine höhere Sterblichkeitsrate als die von Die negative Kontrolle (NOEC), die niedrigste getestete Konzentration, die bestimmt, nach 14 Tagen, eine höhere Sterblichkeit als die der Negativ-Kontrolle (LOEC). 2. Testing Materials 2,1 Artemiaeier Um Tests durchzuführen, Artemia franciscana </em&gt; Larven von weniger als 48 Stunden alt (Nauplien) sind erforderlich, bei Stadium II oder III, erhalten von frisch geschlüpften Eiern 5. Zertifizierte Eier oder Zysten eingesetzt, um Tests zu unterstützen sind im Handel erhältlich, zB von der Quality Assurance Research Division, US Environmental Protection Agency, Cincinnati OH 45268, USA oder aus dem Labor für biologische Forschung in Wasserverschmutzung, Universität Gent, Belgien. 2,2 Wasserverdünnung Synthetische Salzwasser kann als Verdünnungswasser verwendet werden, hergestellt durch Lösen von anerkannter analytischer Qualität Reagenzien oder eine kommerziell erhältliche Formulierung in destilliertem oder deionisiertem Wasser. Salz Mischungen für die Erstellung der ideale Salzwasser sind kommerziell erhältlich, zB die Instant Ocean Mischungen. Es wird eine Verdünnung Wasser mit einem Salzgehalt von 35 (± 2) empfohlen Netzteil sowie eine Konzentration an gelöstem Sauerstoff von mehr als 80% des Wertes der Sättigung und einer Temperatur von 25 (± 2) unddeg; C Nach Belüftung für 48 Stunden Filtration Filter mit einer Porosität von mindestens 0,45 um, kann die Verdünnung für maximal 30 Tage lang im Dunkeln bei einer Temperatur von 0-4 ° C gelagert werden 2,3 Algenkultur Es wird empfohlen, Testorganismen ernähren sich von Dunaliella tertiolecta Mikroalgen, die exponentiell wachsen und erreichen Dichten von 1.3x10 6 sind - 2.0x10 6 Zellen / ml. Testen auf Umweltproben erfordert Kulturen mit einer Dichte höher als 2.0x10 6 Zellen / ml 6. Es wird vorgeschlagen, Dunaliella tertiolecta in einem Kulturmedium, enthaltend Meerwasser wächst (30 (± 2) Netzteil und 20 (± 1) ° C) mit Zusatz von Nährstoffen, Mineralien und Vitamine. Einige Angaben über die Algen-Medien Zusammensetzung und Herstellung sind in der Anlage berichtet. Die ersten Zelldichte wird vorgeschlagen, etwa 10 5 Zellen / ml betragen. Die Algenkultur wird in einer gepflegtenRaumthermostat auf 20 (± 1) ° C, beleuchtet mit Leuchtstofflampen 3000 (± 300) lx, mit einer Photoperiode Verhältnis von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit. Andere Phytoplanktonarten könnte auch für die Fütterung verwendet werden, aber es wäre notwendig, um vergleichende Untersuchungen mit diesen Phytoplanktonarten machen, um die &quot;gleichwertig&quot; Spezies Dunaliella tertiolecta finden, weil die experimentellen Bedingungen (z. B. anfängliche Zelldichten, Beleuchtung, Temperatur, Zusammensetzung der Kulturmedien und Belichtungszeit) variiert zwischen Phytoplankton-Arten. Neben der Toleranz der Mikroalgen auf verschiedene Schadstoffe berücksichtigt werden muss, weil die Schadstoff-Auswirkungen auf das Wachstum und die Entwicklung des Phytoplanktons Auswirkungen auch auf die Artemia. 2,4 Referenzstoff Als Referenzsubstanz bei diesem Test ist Natriumdodecylsulfat. 2,5 Laborglas <ol><li> Testen Behältern einschließlich 100 ml Borosilikatglas Becher (18 bis 18 Tests und Lösungen für die Übertragung durchzuführen). </li><li> Ein Kolben (zB 500 ml-Kolben), um die Standard-Lösung herzustellen. </li><li> Sechs Flaschen (zB 200 ml-Kolben), die Lösungen für die Prüfung vorzubereiten. </li><li> Glas oder Polystyrol mit 5 cm Durchmesser Petrischalen mit abnehmbaren Bezügen, um für die Aktivierung der Zysten und Übertragen von Artemia aus dem Schlüpfen Gericht auf die Prüfung von Behältern verwendet werden. </li><li> Glas Pasteur Pipette (mit Tipps von Flamme gerundet) für die Übertragung der Nauplien. </li><li> Glas oder Kanülen Pasteur 3 ml Einweg-Kunststoff-Pipetten (zu schneidenden) zur Übertragung von Artemia. </li><li> Mikropipetten und Messpipetten zur Herstellung der Testlösungen. </li><li> Sechs Messzylinder (z. B. 50 ml Flaschen) zur Übertragung von Testlösungen aus den Flaschen zu ter testet Container. </li></ol> 3. Zyste Aktivierung 3.1. Petrischalen mit Zysten + Gießen von Wasser Um Testorganismen zu erzeugen, werden 20 mg von Zysten in eine Petrischale mit 12 ml Verdünnungswasser 48 Stunden vor dem Test gestellt. 3.2. Die Inkubation in dem Licht und der Dunkelheit Die Petrischale wird auf 25 (± 2) ° C und bei einer 4000 (± 1000) Lux (Lumen pro Quadratmeter) Lichtintensität für eine Stunde. 3.3. Ersetzen des Mediums mit dem Mikroskop Nach 24 Stunden werden die schlüpfenden Larven in eine neue Petrischale mit künstlichen Wasser gefüllt sind. Die Übertragung erfolgt mit Hilfe des Mikroskops, dh mit einer Lichtquelle, so dass die Schraffur, phototrope Larven in Richtung des Lichtstrahls zu migrieren. Ein Glas Pasteur Pipette wird verwendet, um den Transfer zu machen, dass nur die im Entstehen begriffene Larven are übertragen und nicht die Zysten oder die Larven noch in Membranen. 3.4. Inkubation im Dunkeln Die Schale mit den Larven in einem dunklen thermostatischen Kammer für 24 Stunden bei 25 (± 2) ° C 4. Erstellung von Lösungen für die Werkstoffprüfung 4.1. Wiegen der Substanz + in den Kolben übertragen Es wird empfohlen, dass die Standard-Lösung für die Testsubstanz durch Auflösen von 0,5 g des Materials in einen 500 ml-Kolben hergestellt wird. Der Kolben wird mit entionisiertem oder destilliertem Wasser gefüllt und die Lösung wird gerührt, bis die Testsubstanz vollständig gelöst ist. Lösungen müssen zum Zeitpunkt der Verwendung hergestellt werden, wenn es nicht bekannt, ob die Substanz in Lösung stabiles. In diesem Fall kann die Standard-Lösung bis zu zwei Tage vor dem Testen hergestellt werden. 4.2. Vorbereiten der Negativ-Kontrolle, indem Verdünnungswasser und Algen with der 10 ml Pipette Die negative Kontrolle wird in einen Kolben (z. B. 200 ml Volumen) mit indem ein Aliquot des Algensuspension dem Verdünnungswasser so daß eine Dichte von 10 5 Zellen / ml erhalten wird hergestellt. 4.3. Vorbereitung der Lösungen für die Prüfung: Zugabe von Verdünnung Wasser, Algen-und Standard-Lösung Es wird vermutet, dass Lösungen für die Prüfung in fünf 200-ml-Flaschen werden durch Hinzufügen der Standard-Lösung für das Verdünnungswasser in den Mengen, so dass die gewünschten Konzentrationen zum Testen erhalten angegeben wird vorbereitet. Um die Organismen ernähren, kann Aliquots einer Dunaliella tertiolecta Mikroalgen Suspension verwendet werden und hinzugefügt werden eine Dichte von 10 5 Zellen / ml zu erreichen, wenn Lösungen für die Prüfung vorbereitet werden. Die folgende Reihenfolge der Zugabe wird empfohlen: Verdünnungswasser, Algensuspension und Standard-Lösung. Nach der Vorbereitung der Lösungen für die Prüfung, sie müssen in dem Test verwendet so bald wie möglich werden. 4.4. Übertragen von Lösungen aus dem Kolben zu den Tests Container, dann zu den Petrischalen Gleiche Mengen (50 ml) der Test-Lösungen befinden sich im testing-Container unter Verwendung der Messzylinder eingeführt. Drei Repliken für jede Konzentration hergestellt werden. Für jede Reihe von Tests wird eine Steuerung Behälter mit einer Menge von Verdünnungswasser gleich dem Volumen der Testlösungen hergestellt. Gleiche Volumina (ca. 12 ml) der Testlösungen werden in die Petrischalen eingeführt. Für jede Testreihe wird eine Kontrolle Petrischale verwendet. 5. Vorbereitung für die Prüfungen 5.1. Nauplien auf der Bühne II-III Achtundvierzig Stunden nach der Aktivierung Zyste, erreichen die Nauplien die II-III Larvenstadium und sind dann einsetzbar für die Prüfung. 5.2. Nauplien Transfer in die Petrischalen mit dem Mikroskop Die Petrischale für Zyste verwendet<html> Aktivierung wird der thermostatischen Kammer entnommen. Eine kleine Menge der Larven werden in die Petrischalen mit der Steuerung und die Lösungen für die Prüfung übertragen. Diese Aufgabe ist mit dem Mikroskop unter Verwendung einer Pipette ausreichend großen Durchmesser, so dass die Organismen nicht beschädigt werden durchgeführt werden. In dieser Phase des Tests, kann die Übertragung mit einer Pasteurpipette aus Glas (mit Spitze von Flamme gerundet) und eine seitlich angeordnete Lichtquelle, die den Artemia ermutigt zu aggregieren durchgeführt werden. 5.3. Nauplien Transfer von den Petrischalen in die Test-Container mit dem Mikroskop Zehn Larven werden von den Testlösungen Petrischalen zu den Tests Container übertragen. Auch dieser Vorgang muss unter Verwendung des Pasteur-Pipette und Mikroskop durchgeführt werden. Es wird empfohlen, dass ein Volumen von 1 ml während der Passage der Larven übertragen wird nicht auf das Gesamtvolumen des Testsystems beeinflussen. e_step &quot;&gt; 5.4. Full Container mit Parafilm bedeckt Die Prüfung Bechergläser werden mit Parafilm (wobei ein Spalt für den Luftdurchgang) bedeckt, und bei einer Temperatur von 25 (± 2) ° C für die gesamte Dauer des Tests und bei einer Beleuchtungsstärke von 900 (± 100) lx einer Photoperiode Verhältnis von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit. 6. Ersetzen des Mediums und Nahrungsergänzung 6.1. Überlebensrate Kontrolle Zwei Tage nach dem Test begonnen hat, und dann nach 5, 7, 9, und 12 Tage, wird der Artemia unter dem Mikroskop, um die Überlebensrate zu überprüfen und die mittel-und die Nahrungsergänzungsmittel ersetzen beobachtet. Anzahl der lebenden Organismen wird in jedem Test-Container gezählt. Nach Beobachtung unter dem Mikroskop und leichte mechanische Reize (zB Berührung der Larven mit einem Glas Pasteurpipette) Organismen handelt, die mit etwas Bewegung für ca. 10 seconds sollte als tot betrachtet werden. 6.2. Herstellung einer Testlösung Es werden Algen Abtastung mit einer 10 ml-Pipette und die Entnahme von diesem Stoff mit einer Mikropipette getestet werden. Übertragen von Lösungen aus dem Kolben zu den Test-Container Während des Tests müssen die Testlösungen regelmäßig ausgetauscht werden, und bereitete in selben Tag wie sie verwendet werden sollen. Die Testlösungen werden von der Standard-Lösung vorher zubereitet wird. 6.3. Artemia Übertragung unter Verwendung eines Cut Pasteurpipette aus den alten Test-Container auf die drei neuen Container Die Übertragung von Artemia wird unter Verwendung einer Pipette mit einer ausreichend großen Durchmesser, um nicht die Organismen beschädigen durchgeführt. Während dieser Phase kann ein 3-ml-Kunststoff-Pasteurpipette (zu schneidenden) verwendet werden. 6.4. Larven in einem Becher, die entweder lebende oder tote Artemia Nach 1<html> 4 Tage der Exposition am Ende des Tests wird die Anzahl der überlebenden Larven gezählt und aufgezeichnet auf dem Arbeitsblatt. LC 50 und / oder LC-20, sind NOEC und LOEC bei 14 Tagen, berechnet und aufgezeichnet sowie Konfidenzintervall bei 95% gegebenenfalls und Berechnungsmethoden. 7. Repräsentative Ergebnisse Am Ende des Tests (14 Tage), wird der Prozentsatz an Mortalität bei jeder Konzentration, gemäß der folgenden Formel: (M s / N) * 100 Wo: M s ist gestorben durchschnittliche Anzahl der Individuen in der analysierten Probe N die Anzahl der exponierten Personen Tabelle 1 zeigt ein Beispiel von Daten eines Tests (14d) mit Artemia ausgesetzt Natriumdodecylsulfat. <table border="1"><tbody><tr><td> Konzentrationen (mg / l) </td>&quot;&gt; Anzahl der verstorbenen Personen in jedem Replikat </td><td> Mortalität (%) </td></tr><tr><td></td><td> Ich </td><td> II </td><td> III </td><td></td></tr><tr><td> Negative Kontrolle </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 1 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 1,56 </td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3,12 </td><td> 2 </td><td> 0 </td><td> 2 </td><td> 13 </td></tr><tr><td> 6,25 </td><td> 3 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 27 </td></tr><tr><td> 12,5 </td><td> 8 </td><td> 9 </td><td> 10 </td><td> 90 </td></tr><tr><td> 25,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 50,0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 100 </td></tr></tbody></table> Außerdem bestimmen dieLC 50-Wert durch eine graphische Gauss-logarithmischer Auftragung oder mit geeigneten statistischen Methoden (zB Spearman-Karber oder Probit-Methode). Die Berechnung der LC 50 für die Daten der Tabelle 1 ist 8,18 (7,15-9,37) mg / l beträgt. Falls die maximale Konzentration eine niedrigere Mortalitätsrate von 50% verursacht getestet, sollten Sie nicht auf die Berechnung der LC 50-Wert, der dann wäre unzuverlässig oder gar nicht berechenbar vorzugehen. In diesem Fall wäre jedoch sinnvoll sein, den Test durch die Verlängerung der Bereich der getesteten Konzentrationen zu wiederholen. Alternativ wird die LC 50-Wert richtiger als größer als die höchsten getesteten Konzentration exprimiert, was möglicherweise auf den Prozentsatz der Mortalität bei der höchsten getesteten Konzentration und die höchste Konzentration entsprechend einer nicht durch. Die Ergebnisse werden als gültig angesehen, wenn am Ende der Prüfung die folgenden Bedingungen erfüllt sind: <ol class="lalpha"><li> des Steuerelements durchschnittliche Sterblichkeitsrate≤ 20%; </li><li> wobei mit Natriumdodecylsulfat, die LC 50 nach 14 Tagen in der 8,0 (± 5) mg / l Intervall enthalten. </li></ol> Wenn die oben genannten Bedingungen nicht erfüllt wurden, sollten alle Daten mit der gleichen Charge von Organismen gewonnen als ungültig betrachtet und Tests wiederholt.

<ol><li>Togulga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Short-Term+Toxicity+of+Two+Toxicants+to+Artemia+Nauplii%5BTitle%5D)+AND+%22Tr.+J.+of+Zoology%22%5BJournal%5D)">The Short-Term Toxicity of Two Toxicants to Artemia Nauplii.</a> Tr. J. of Zoology. 22, 259-266 (1998).</li>
<li>Persoone, G., Wells, P. G. Artemia in aquatic toxicology: a review. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPersoone%2C+G+%22Artemia+Research+and+its+Applications.+Morphology%2C+Genetics%2C+Strain+characterization+Toxicology%22">Artemia Research and its Applications. Morphology, Genetics, Strain characterization Toxicology</a>. Sorgeloos, P. , Universita Press. Belgium. 259-275 (1987).</li>
<li>Nunes, B. S., Carvalho, F. D., Guilhermino, L. M., Stappen, G. V. an <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+genus+Artemia+in+ecotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Envir.+Poll%22%5BJournal%5D)">Use of the genus Artemia in ecotoxicity testing.</a> Envir. Poll. 144, 453-462 (2006).</li>
<li>APAT IRSA-CNR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Metodi+analitici+per+le+acque+Manuali+e+Linee+guida+29%2F2003%22">Metodi analitici per le acque Manuali e Linee guida 29/2003</a>. Terzo Metodo, 8060(2003).</li>
<li>Sorgellos, P., Wielen, C. R. emiche-V. anD. er, Persoone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Artemia+nauplii+for+toxicity+tests+%C3%A2%E2%82%AC%E2%80%9C+a+critical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotox.+Env.+Saf%22%5BJournal%5D)">The use of Artemia nauplii for toxicity tests â€“ a critical analysis.</a> Ecotox. Env. Saf. 2, 249-255 (1978).</li>
<li>Savorelli, F., Palazzi, D., Gorbi, G., Invidia, M., Sei, S., Magaletti, E., Manfra, L., Gelli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Set+up+of+a+standard+methodology+for+14-day+bioassay+on+Artemia+franciscana+and+A.+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Amb%22%5BJournal%5D)">Set up of a standard methodology for 14-day bioassay on Artemia franciscana and A. parthenogenetica.</a> Biol. Amb. 21, 27-36 (2007).</li>
<li>Brix, K. V., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+toxicity+of+arsenic+to+the+Great+Salt+Lake+brine+shrimp%2C+Artemia+franciscana%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotox.+Environ.+Saf%22%5BJournal%5D)">Chronic toxicity of arsenic to the Great Salt Lake brine shrimp, Artemia franciscana.</a> Ecotox. Environ. Saf. 54, 169-175 (2003).</li>
<li>Brix, K. V., Deforest, D. K., Cardwell, R. D., Adams, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+a+chronic+site-specific+water+quality+standard+for+selenium+in+the+Great+Salt+Lake%2C+Utah%2C+USA%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derivation of a chronic site-specific water quality standard for selenium in the Great Salt Lake, Utah, USA.</a> Environ. Toxicol. Chem. 23, 606-612 (2004).</li>
<li>Qualitá dell'acqua - Determinazione della tossicitá letale a 14 giorni con Artemia franciscana (Crustacea: Anostraca). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Commissione+UNICHIM+%22Qualit%C3%A1+dell%27acqua%22+Gruppo+di+Lavoro+%22Metodi+Biologici%22+Sottogruppo+%22Acque+salate%2Fsalmastre+e+sedimenti%22%22">Commissione UNICHIM "Qualitá dell'acqua" Gruppo di Lavoro "Metodi Biologici" Sottogruppo "Acque salate/salmastre e sedimenti"</a>. , UNICHIM. (2010).</li>
<li>Varo, I., Navarro, J. C., Amat, F., Guilhermino, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+cholinesterases+and+evaluation+of+the+inhibitory+potential+of+chlorpyrifos+and+dichlorvos+to+Artemia+salina+and+Artemia+parthenogenetica%5BTitle%5D)+AND+%22Chem%22%5BJournal%5D)">Characterisation of cholinesterases and evaluation of the inhibitory potential of chlorpyrifos and dichlorvos to Artemia salina and Artemia parthenogenetica.</a> Chem. 48, 563-569 (2002).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Artemia ist eine der wertvollsten Testorganismen für Ökotoxizitätsuntersuchungen und Forschung bisher getan erlaubt uns zu behaupten, dass es möglich ist, mehrere Optionen im Zusammenhang mit Artemia Einsatz in Toxikologie und Ökotoxikologie zu erhalten. Die Merkmale, die diesen Organismus verwandeln in eine geeignete Arten für Bioassays sind: eine breite geografische Streuung, hohe Anpassungsfähigkeit an widrige Umgebungsbedingungen und abwechslungsreiche Nährstoffe, relativ einfachen Labor-Kultur und...

Produziert von Loredana Manfra des Instituts für Umweltschutz und Forschung (ISPRA-Department of Environmental Quality Monitoring) und Federica Savorelli der Landesanstalt für Umweltschutz (Emilia-Romagna, Italien). Referenz Mitglieder für die Sub-Arbeitsgruppe für die Artemia Krustentier innerhalb der biologischen Methoden Group - Salzwasser / Brackwasser und Sediment des Unichim Kommission auf die Wasserqualität (das Institut für technische Standardisierung Betriebssystem in der chemischen Industrie). Videographie und Bearbeitung von Marco Pisapia von Ispra (Scientific Advisory and Documentation Services). Die Produktion Koordination von Anna Maria Cicero und Erika Magaletti von Ispra (Department of Environmental Quality Monitoring). Wir möchten das regionale Amt für Umweltschutz der Emilia-Romagna danken, Ferrara Branch und dem BIOLOGiCal Methods Group - Salzwasser / Brackwasser und Sediment des Unichim Kommission auf die Wasserqualität für die gute Zusammenarbeit; Rossella Boscolo und Massimo Gabellini von Ispra (Abteilung für Prävention und Abmilderung der Auswirkungen) für ihre finanzielle Unterstützung, und die London School of Languages ​​in Rom für ihre sprachliche Unterstützung. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Produktnummer </td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L4390 </td></tr></tbody></table> Anhang Die Algen-Medien muss unter Verwendung analytischer Qualität Reagenzien werden. Ein Liter der Nährlösung durch Auflösen von 300 g NaNO 3, 30 g KH 2 PO 4 und 20 g NH 4 Cl in destilliertem Wasser hergestellt. Vier erste Lösungen (A, B, C, D) Von Mineralien werden wie folgt hergestellt: <ul><li> Ein Liter der Lösung &quot;A&quot; mit 30 g ZnSO 4 H 2 O, 25 g CuSO 4 5 H 2 O, 30 g CoSO 4 7 H 2 O und 20 g MnSO 4 H 2 O in destilliertem Wasser; </li><li> Ein Liter der Lösung &quot;B&quot; mit 50 g FeCl 3 • 6 H 2 O in destilliertem Wasser; </li><li> Ein Liter der Lösung &quot;C&quot; mit 25 g Na 2 MoO 4 • 2 H 2 O in destilliertem Wasser; </li><li> Ein Liter der Lösung &quot;D&quot; mit 50 g Na 2 EDTA di • 2 H 2 O in destilliertem Wasser. </li></ul> Ein Liter einer endgültigen Lösung von Mineralien (Lösung &quot;E&quot;) erhalten Zugeben von Teilmengen der oben genannten Lösungen zu destilliertem Wasser. Die folgende Reihenfolge der Zugabe wird empfohlen: 100 ml Lösung &quot;D&quot;, 10 ml Lösung &quot;C&quot;, 10 ml der Lösung &quot;B&quot; und 10 ml Lösung &quot;A&quot;. Drei Initiativenl Lösungen (F, G, H) von Vitaminen werden wie folgt hergestellt: <ul><li> Ein Liter der Lösung &quot;F&quot;, die 100 mg Biotin in destilliertem Wasser; </li><li> Ein Liter der Lösung &quot;G&quot;, die 10 g Thiamin in destilliertem Wasser; </li><li> Ein Liter der Lösung &quot;H&quot; mit 100 mg Cobalamin in destilliertem Wasser. </li></ul> Ein Liter einer endgültigen Lösung der Vitamine (Lösung &quot;I&quot;) wird erhalten Zugabe von 10 ml der drei ersten Lösungen für destilliertes Wasser. Ein Liter der Algen Medien wird durch Auflösen von 1 ml der Nährlösung, 1 ml der mineralischen endgültige Lösung (Lösung &quot;E&quot;) und 1 ml der Vitamin endgültige Lösung (Lösung &quot;I&quot;) in Meerwasser hergestellt. Diese letztere kann durch Lösen analysenreine Qualität Reagenzien oder eine kommerziell erhältliche Formulierung in destilliertem oder entionisiertem Wasser erhalten werden. Salz Mischungen für die Erstellung der ideale Salzwasser sind kommerziell erhältlich, zB die Instant Ocean Mischungen. Jedoch ist zu empfehlenDed die Verwendung eines Meerwasser mit einem Salzgehalt von 30 (± 2) Netzteil und Temperatur von 20 (± 1) ° C

langfristige letale toxizität test mit dem krustentier artemia franciscana</em

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Unsere Forschungsaktivitäten gezielt den Einsatz von biologischen Methoden zur Beurteilung der Umweltqualität, insbesondere in Bezug auf Salzwasser / Brackwasser und Sediment. Die Wahl des biologischen Indikatoren müssen auf zuverlässigen wissenschaftlichen Erkenntnissen beruhen und möglicherweise auf die Verfügbarkeit von standardisierten Verfahren. In diesem Artikel präsentieren wir ein standardisiertes Protokoll, das die Marine Krustentier Artemia verwendet, um die Toxizität von Chemikalien und / oder der Meeresumwelt Matrizen zu bewerten. Die Wissenschaftler schlagen vor, den Artemia (Artemia) ein geeigneter Kandidat für die Entwicklung eines Standard-Bioassay für die weltweite Nutzung ist. Eine Reihe von Arbeiten über die toxischen Wirkungen von verschiedenen Chemikalien und Schadstoffen auf Artemia (Artemia) veröffentlicht worden. Der große Vorteil dieses Krustentier für Studien zur Toxizität ist die allgemeine Verfügbarkeit der trockenen Zysten, diese können sofort in Tests verwendet werden und schwierige Anbau wird nicht verlangt <sup&gt; 1,2. Cyst-basierte Toxizitätstests sind billig, sind ständig verfügbar, einfach und zuverlässig und damit eine wichtige Antwort auf die Bedürfnisse von Routine-Screening Toxizität, für industrielle Überwachungs-Anforderungen für regulatorische Zwecke oder 3. Das vorgeschlagene Verfahren umfasst die Mortalität als Endpunkt. Die Zahl der Überlebenden wurden gezählt und Prozentsatz der Todesfälle wurden berechnet. Die Larven wurden als tot, wenn sie nicht zeigen alle internen oder externen Bewegung während mehreren Sekunden der Beobachtung 4. Dieses Verfahren war standardisierten Tests eine Referenzsubstanz (Natriumdodecylsulfat); Einige Ergebnisse sind in dieser Arbeit berichtet. Dieser Artikel begleitet ein Video, das die Leistung des Verfahrensrechts Toxizitätstests beschreibt, in der alle Schritte im Zusammenhang mit dem Protokoll.

Diese Studie bezieht sich auf die Entwicklung und Standardisierung eines wertvollen methodischen Protokoll, um langfristig (14 Tage) letale Toxizität von chemischen Substanzen, industrielles Abwasser oder Abwasser und flüssigen Umweltproben auf dem Salzwasser Krustentier ausgeübt zu bestimmen,<em&gt; Artemia franciscana</em&gt;.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Unsere Forschungsaktivitäten zielen auf den Einsatz biologischer Methoden zur Bewertung der Umweltqualität ab, unter besonderer Berücksichtigung von Salz- und Brackwasser...

Wir sind Laura Manfra und Federica Selli, Forscherinnen des Höheren Instituts für Umweltschutz und Forschung, ISRA, Abteilung für Überwachung der Umweltqualität, Labor für Phytoplankton, Echo-Toxikologie und Ökologie. Unsere Forschungstätigkeiten konzentrieren sich auf den Einsatz biologischer Methoden zur Bewertung der Umweltqualität, insbesondere im Hinblick auf Salzwasser, Brackwasser und Sedimente. Unsere aktuelle Studie befasst sich mit der Entwicklung und Standardisierung eines wertvollen methodischen Protokolls zur Bestimmung der langfristigen, 14-tägigen letalen Toxizität, die von chemischen Substanzen, Industrieabfällen, Abwasser, Abwasserproben oder flüssigen Umweltproben auf den Salzwasser-Krebsartigen Artia franciscana ausgeübt wird.Dieses Video beschreibt die Durchführung von Verfahren zur Toxizitätsprüfung. Unsere Prüfung beinhaltet die Exposition von Artemia-Larven gegenüber einer Reihe von Substanzkonzentrationen oder einer Testprobe, um die Konzentration bzw. Verdünnungsstufen zu ermitteln, bei denen 50 % der exponierten Organismen innerhalb von 14 Tagen sterben, unter Einhaltung der durch diese Methode definierten Bedingungen. Gegebenenfalls und falls möglich können zusätzlich die folgenden Parameter bestimmt werden.Die Konzentrationsebene, die den Tod von 20 % der Organismen verursacht, die höchste analysierte Konzentrationsebene, die keine höhere Mortalitätsrate als die der negativen Kontrolle bewirkt, die niedrigste getestete Konzentrationsebene, die nach 14 Tagen eine höhere Mortalitätsrate als die der negativen Kontrolle bestimmt. Für die Durchführung der Tests benötigten wir unser Team mit Franciscan-Larven, die jünger als 48 Stunden und im Stadium zwei oder drei waren und aus frisch geschlüpften Eiern stammten. Sie können synthetisches Salzwasser als Verdünnungswasser verwenden, indem Sie es durch Auflösen von Reagenzien anerkannter analytischer Qualität oder einer kommerziell erhältlichen Formulierung in destilliertem oder entionisiertem Wasser herstellen.Nach einer Inkubation von 48 Stunden und Filtration durch Filter mit einer Porosität von mindestens 0,45 kann die Verdünnung bis zu 30 Tage im Dunkeln aufbewahrt werden. Bei einer Temperatur von null bis vier Grad müssen Testorganismen mit dem Mikroalgenstamm Ella Ter gefüttert werden, der exponentiell mit Dichten zwischen 1,3 × 10⁶ und 2,0 × 10⁶ Zellen/mL wächst. Die Referenzsubstanz in diesem Test ist Natriumlaurylsulfat.Zusätzlich zu den üblichen Laborgeräten benötigen Sie die folgenden Prüfgefäße, darunter 100-Millimeter-Borosilikatglasbechern, einen 500-Milliliter-Flasche zur Herstellung der Standardlösung, sechs 100-Milliliter-Flaschen zur Herstellung der Prüflösungen, Glas- oder Polyethylenglas-Petrischalen mit abnehmbaren Deckeln mit einem Durchmesser von fünf Zentimetern, die zum Aktivieren der Zysten und zum Übertragen der Artemia aus der Schlüpfwanne in die Prüfgefäße verwendet werden. Glas-Pasteurpipetten, deren Spitzen zur Übertragung der Artemia abgerundet wurden, oder gebrauchsfertige drei-Milliliter-Plastikpipetten, die zum Übertragen der Artemia gekürzt wurden, sowie Mikropipetten und Messpipetten zur Herstellung der Prüflösungen. Sechs 50-Milliliter-Messzylinder zum Übertragen der Prüflösungen aus den Flaschen in die Prüfgefäße zur Erzeugung der Testorganismen.Legen Sie 20 Milligramm Zysten 48 Stunden vor dem Test in eine Petrischale mit 12 Milliliter Verdünnungswasser. Halten Sie die Schale eine Stunde lang bei 25 Grad und einer Lichtintensität von 4.000 Lumen pro Quadratmeter. Nach 24 Stunden überführen Sie die geschlüpften Larven in eine neue Petrischale, die mit künstlichem Wasser gefüllt ist.Führen Sie die Übertragung mit dem Mikroskop unter Verwendung einer Lichtquelle durch, sodass die schalenbildenden, positiv phototropen Larven in Richtung des Lichtstrahls wandern. Verwenden Sie eine Glas-Pasteurpipette, um die Übertragung durchzuführen, und stellen Sie sicher, dass ausschließlich die neu entstandenen Larven übertragen werden – weder die Zysten selbst noch Larven, die sich noch in den Membranen befinden. Stellen Sie die Schale mit den Larven für weitere 24 Stunden bei 25 Grad in eine dunkle thermostatische Kammer.Die Standardlösung der Testsubstanz muss durch Auflösen einer halben Gramm der Substanz in einem 500-Milliliter-Kolben hergestellt werden. Mit entionisiertem oder destilliertem Wasser auffüllen und unter Rühren vollständig auflösen. Die Lösungen müssen zum Zeitpunkt der Verwendung hergestellt werden, es sei denn, Sie wissen nicht, ob die Substanz in Lösung stabil ist.In diesem Fall können Sie die Standardlösung bis zu zwei Tage vor der Prüfung herstellen. Die negative Kontrolle müssen Sie in einem 200-Milliliter-Kolben herstellen, indem Sie eine ausreichende Menge einer Algensuspension dem Verdünnungswasser hinzufügen, sodass Sie eine Dichte von 10 hoch 5 Zellen pro Milliliter erhalten. Die Prüflösungen müssen in 5- bis 100-Milliliter-Kolben hergestellt werden, indem die Standardlösung in der angegebenen Menge dem Verdünnungswasser zugesetzt wird, um die gewünschten Konzentrationen für die Prüfung zu erhalten.Zur Fütterung der Organismen muss eine Suspension der Mikroalge Dunaliella tertiolecta verwendet werden, die beim Ansetzen der Testlösungen so zugegeben wird, dass eine Dichte von 105 Zellen pro Milliliter erreicht wird. Vor Beginn empfehlen wir jedoch, die folgende Reihenfolge der Zugabe einzuhalten: Verdünnungswasser, Algensuspension und anschließend die Standardlösung. Geben Sie jeweils gleiche Mengen, 50 Milliliter der Testlösungen, mithilfe des Messzylinders in die Testgefäße.Stellen Sie für jede Konzentration und jede Testreihe drei Replikate her. Bereiten Sie einen Kontrollbehälter mit einer Menge Verdünnungswasser vor, die dem Volumen der Testlösungen entspricht. Geben Sie gleiche Volumina – etwa 12 Milliliter – der Testlösungen in die Petrischalen. Stellen Sie für jede Testreihe eine Kontroll-Petrischale her. 48 Stunden nach der Zystenaktivierung erreichen die Larven das zweite bzw. dritte Larvenstadium und sind ab sofort testgeeignet. Nehmen Sie die Petrischale, die Sie für die Zystenaktivierung verwendet haben, aus der thermostatischen Kammer heraus.Überführen Sie eine kleine Menge Larven in die Petrischalen mit den Kontroll- und Testlösungen. In dieser Testphase können Sie die Übertragung mit einer Glas-Pasteurpipette durchführen, deren Spitze durch Flamme abgerundet wurde, und einer seitlich positionierten Lichtquelle, die die Aggregation der Arten fördert. Überführen Sie 10 Larven aus den Testlösungen.Petri-Schalen zu den Testgefäßen. Führen Sie diesen Vorgang ebenfalls unter Verwendung der vorherigen Pipette durch und decken Sie die Testbecher mit Parafilm ab, wobei ein Spalt für den Luftaustausch freigelassen wird. Halten Sie die Proben während der gesamten Testdauer bei einer Temperatur von 25 Grad. Und bei einer Beleuchtung von 900 Lumen pro Quadratmeter mit einem Licht-Dunkel-Zyklus von 14 Stunden Licht und 10 Stunden Dunkelheit, beginnend zwei Tage nach Teststart.Und dann nach 5, 7, 9 und 12 Tagen die Artia unter dem Mikroskop beobachten und ihre Überlebensrate überprüfen. Das Medium und Nahrungszusätze ersetzen; Organismen, die etwa 10 Sekunden lang keine Bewegung zeigen, gelten während des Tests als tot. Während des Tests müssen die Testlösungen regelmäßig erneuert werden, wobei sie am selben Tag hergestellt werden sollten, an dem sie verwendet werden.Stellen Sie die Testlösungen aus der zuvor hergestellten Standardlösung her. Führen Sie die ARTIA-Übertragung mit EPI-PET durch, wobei ein ausreichend großer Durchmesser gewählt werden sollte, um die Organismen während dieser Phase nicht zu beschädigen. Sie können eine dreimillimeterige Kunststoff-Poster-Pipette verwenden, die nach 14 Tagen Exposition abgeschnitten wird.Am Ende der Prüfung die Anzahl der überlebenden Larven zählen und das Ergebnis auf dem Arbeitsblatt erfassen. Berechnen Sie die LC 50 und/oder LC 20 sowie NOEC und LOEC nach 14 Tagen und geben Sie deren Werte an. Die 95-%-Konfidenzintervalle waren angemessen und die Berechnungsmethoden.Wenn am Ende der Prüfung die folgenden Bedingungen erfüllt sind, beträgt die durchschnittliche Sterblichkeitsrate der Kontrollen weniger oder gleich 20 %. Es wurde Natriumlaurylsulfat verwendet. Die LC 50 nach 14 Tagen liegt im Intervall von 8,0 Milligramm pro Liter. Wenn die genannten Bedingungen nicht erfüllt sind, sollten alle mit derselben Charge von Organismen gewonnenen Daten als ungültig betrachtet und die Prüfung wiederholt werden.

long-term-lethal-toxicity-test-with-the-crustacean-artemia-franciscana

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Forschung

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Biologie

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