Methoden zum Test Drosophila Verhalten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Methoden zur Untersuchung der motorischen, sensorischen und Koordinationsverhalten von Drosophila darzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst die motorische Funktion der Larven mithilfe des Kriechtests, die motorische Funktion von erwachsenen Tieren mithilfe des Ringtests und schließlich die Koordinations- und sensorischen Fähigkeiten erwachsener Tiere mit dem Balztest bewertet werden. Letztendlich kann diese Reihe von Verhaltensanalysen zeigen, wie genetische und äußere Faktoren wie Drogenbehandlungen die Aktivität und Koordination beeinflussen können.

Intra sophala. Der Hauptvorteil dieses Assays gegenüber bestehenden Methoden wie der negativen Geo-Achse besteht darin, dass der Ring-Assay eine höhere Durchsatzleistung und Empfindlichkeit aufweist. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der neurodegenerativen Erkrankungen zu beantworten, beispielsweise die Früherkennung von Bewegungsstörungen.

Die Durchführung dieses Assays wird Dr. Jamie Becknell, ein Postdoktorand in meinem Labor, demonstrieren. Der larvale Kriechtest wird verwendet, um die Wirkung genetischer und umweltbedingter Faktoren auf die Beweglichkeit zu messen. Zur Vorbereitung wird ein Kreuzungsansatz mit 10 bis 15 Männchen und 10 bis 15 Jungweibchen in einer Standardflasche angelegt. Nach 24 Stunden haben gesunde erwachsene Tiere ausreichend Eier abgelegt, um die Flasche zu besiedeln, wodurch die Population auf ein altersentsprechendes Intervall von 24 Stunden eingestellt bleibt.

Entfernen Sie die erwachsenen Tiere in eine frische Flasche und wiederholen Sie den Vorgang. Inkubieren Sie nun die Flasche, bis Drittinstar-Larven im Nährmedium der Flasche beobachtet werden. Geben Sie 50 bis 100 Milliliter 20%iger Saccharoselösung hinzu und lassen Sie die Mischung 20 Minuten lang stehen.

Die Larven steigen an die Oberfläche. Sammeln Sie die Larven mit einer 25-Milliliter-Serologischen Pipette, deren Spitze abgeschnitten wurde, und geben Sie sie in einen Netzbehälter. Waschen Sie die Larven im Netzbehälter zweimal mit entionisiertem Wasser. Nun können Experimente mit ihnen durchgeführt werden.

Um die Larven mit einem Wirkstoff zu behandeln, verwenden Sie einen Pinsel, um die gewünschte Anzahl Larven in einen Fünf-Milliliter-Becher zu überführen, der eine Lösung aus 5 % Saccharose und dem gewünschten Wirkstoff enthält. Lassen Sie die Larven 15 Minuten lang von der medikamentösen Zuckerlösung fressen, gießen Sie sie dann durch den Netzbehälter zurück, spülen Sie sie ab und fahren Sie mit der Messung der Wirkstoffwirkung auf die Beweglichkeit fort. Verwenden Sie einen Pinsel, um eine einzelne Larve in eine 15 Zentimeter große Petrischale zu überführen, die 2 % Agarose enthält.

Legen Sie es auf ein Blatt Graft-Papier. Sammeln Sie nun die Daten. Zählen Sie einfach die Anzahl der Gitterlinien, die die Lava in einer Minute kreuzt.

Als Nächstes die Lava mithilfe der Bürste innerhalb einer Minute auf eine Vertiefung einer Glas-Präparierschale übertragen, die eine verdünnte Hefepaste-Lösung enthält, und unter dem Präparationsmikroskop die Kontraktionen der Percys zählen. Als eine einzelne Kontraktion gilt eine vollständige Bewegung von posterior nach anterior. Wiederholen, bis die gewünschte Anzahl an Larven gezählt wurde.

Das Ring-Protokoll misst die Fortbewegungsgeschwindigkeit erwachsener Tiere. Sammeln Sie frisch geschlüpfte erwachsene männliche Fliegen unter leichter Narkose und überführen Sie sie in ein Standardfläschchen mit normaler oder medikamentöser Nahrung. Geben Sie etwa 25 Fliegen pro Fläschchen. Halten Sie die Fliegen bei Raumtemperatur für zwei bis drei Tage, um eine vollständige Erholung von der Narkose sowie die Anreicherung von stabilen Arzneimittelkonzentrationen zu gewährleisten.

Überführen Sie anschließend etwa 25 Fliegen ohne Betäubung in Polystyrolgefäße mit integrierten Stopfen und montieren Sie die Gefäße in einer oder mehreren Ringapparaturen. Lassen Sie die Fliegen 15 bis 20 Minuten ruhen, während Sie eine digitale Kamera so ausrichten, dass sie die Gefäße seitlich fotografiert; halten Sie eine Stoppuhr bereit und stellen Sie sie auf die gewünschte Dauer des Tests ein. Üblicherweise drei Sekunden, um den Test durchzuführen.

Halten Sie die Ringapparatur mit einer Hand, ohne die Fliegen zu stören, und halten Sie den Kameratimer mit der anderen Hand fest. Schlagen Sie die Apparatur dreimal auf die Arbeitsfläche, um die Fliegen herunterzuschütteln, und starten Sie gleichzeitig den Countdown-Timer der Kamera. Wiederholen Sie den Versuch einmal pro Minute, bis fünf oder sechs Durchgänge durchgeführt wurden.

Es ist entscheidend, die Polystyrol-Testgefäße nach der Erhebung der ersten Datensätze nicht erneut zu verwenden. Denn neue Fliegen, die in bereits benutzte Gefäße gegeben werden, klettern nicht so ausgiebig wie Fliegen, die in frische Gefäße gegeben werden. Um die Daten zu sammeln, bewerten Sie mithilfe eines Bildbetrachters die durchschnittliche Kletterhöhe der verschiedenen Gruppen.

Dieser Test setzt vorbereitete genetische Kreuzungen in Flaschen voraus, die zahlreiche Nachkommen hervorbringen, um Fliegen für den Test zu sammeln. Innerhalb weniger Stunden nach dem subjektiven Morgendämmerung des Tieres die Flaschen leeren, um alle erwachsenen Tiere in Abständen von drei bis vier Stunden zu sammeln. Neu geschlüpfte, sexuell naive Männchen und Weibchen sammeln; die Männchen einzeln in Vials oder Röhrchen mit Nahrung unterbringen, die Weibchen in Gruppen von fünf bis sechs Tieren.

In ähnlichen Behältnissen werden für den Assay gleiche Anzahlen von Männchen und Weibchen benötigt. Nachdem die gesammelten Fliegen fünf Tage lang isoliert wurden, bereiten Sie deren Einbringung in ein Paarungsrad vor und führen den Assay durch. Überführen Sie anschließend vorsichtig ein Weibchen und ein Männchen unter dem Stereomikroskop in eine Kammer eines Paarungsrads.

Beobachten Sie das Paar 10 Minuten lang oder bis zur erfolgreichen Paarung innerhalb dieses Zeitraums. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem jedes von mehreren Verhalten erstmals beobachtet wird. Notieren Sie, wann das Männchen sich erstmals der weiblichen Aufzeichnung zuwendet.

Wenn der Männchen zum ersten Mal die Weibchen mit seinem Bein berührt, notieren Sie den Zeitpunkt; wenn das Männchen zum ersten Mal ein Flügel ausbreitet und vibriert, notieren Sie den Zeitpunkt; wenn das Männchen zum ersten Mal die Genitalien des Weibchens ableckt, notieren Sie den Zeitpunkt; wenn das Männchen zum ersten Mal den Abdomen unter sich krümmt, notieren Sie den Zeitpunkt. Notieren Sie außerdem, wann das Männchen zum ersten Mal versucht, sich auf das Weibchen zu setzen. Geben Sie schließlich die gesamte Zeitspanne an, die mit Balzverhalten bis zum Auftreten der Kopulation verbracht wurde.

Bei Wildtyp-Tieren liegt dies nahezu immer innerhalb von fünf bis zehn Minuten; erfassen Sie die Daten anhand von drei verschiedenen Parametern. Erstens ist die Latenz eines Verhaltens die Zeit, die vergeht, bis es erstmals beobachtet wird. Zweitens ist die Häufigkeit eines Verhaltens, wie oft es beobachtet wird.

Und drittens ist der Balzindex die für die Balz aufgewendete Zeit, geteilt durch die Gesamtzeit bis zur Kopulation in einem Experiment mit Tieren. Träger von Mutationen im F-U-S-T-L-S-Gen, das mit der amyotrophen Lateralsklerose assoziiert ist. Genmutanten mit einer Insertionsstelle zeigten die halbe Kriechfähigkeit im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen links, und eine R 5 21 C-„missense“-Mutation verringerte die Kriechgeschwindigkeit auf nur etwa einen Zentimeter pro Minute.

Die Ringtestung junger erwachsener Wildtyp-Fliegen ergab eine durchschnittliche Kletterhöhe zwischen drei und fünf Zentimetern innerhalb eines Zeitraums von drei Sekunden. Bei diesem Assay wurde keine Desensibilisierung beobachtet, auch nicht während bis zu fünf aufeinanderfolgenden Versuchen mit jeweils einer Minute Abstand beim Durchführen des Ringassays. Es ist wichtig, stets möglichst genau auf die Zeiteinhaltung zu achten.

Wenn man den Larven-Konkurrenztest einmal beherrscht, kann er in 30 bis 40 Minuten durchgeführt werden, um 10 Versuche für ein Genotyp beobachten zu können, sofern er ordnungsgemäß durchgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie zudem ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Balzverhalten bei der Fliege beobachtet und bewertet.