Name: Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 28 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie spezialisierte Zellsubpopulationen in Bacillus subtilis-Biofilmen visualisieren und quantifizieren. Diese Methode nutzt Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie für Einzelzellanalysen.

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Diese Arbeit wird von den Young Investigator Research Program gefördert, vom Zentrum für Infektionsforschung (zinf) von der Universität Würzburg. Juan Garcia-C Betancur ist ein Doktorand von der Graduate School of Life Sciences (GSLS) der Universität Würzburg.

1. Labeling B. subtilis und Biofilm-Assay <ol><li> Amplify von PCR, das die Promotorregion des Gens von Interesse. Wir zeigen, wie beispielsweise das Klonen von P Tapa, der Promotor der Gene, die für die Herstellung von Tasa Matrixprotein 26. Klon P Tapa in pkm008 Vektor (erstellt von der Rudner Labor, Harvard Medical School. Boston, USA) (Abb. 2). </li><li> Linearisieren die Plasmide durch enzymatische Verdauung (Enzyme empfohlen, XhoI). </li><li> Induzieren natürliche Kompetenz in B. subtilis Stamm 168, indem Sie die Ein-Schritt-Protokoll zuvor von Harwood beschrieben und Schneiden 27. </li><li> Fügen Sie die linearisierten Plasmide in die Kultur der kompetenten Zellen und wählen Sie für Spectinomycin-Resistenz nach zwei Stunden Inkubation. </li><li> Stämme erhalten wurden, die das Konstrukt in die neutrale amyE Locus von B. eingesetzt subtilis durch doppelte Rekombination (Abb. 4). So erstellen SieDoppel-markierten Stamm, die Integration von zweiten Reporter in die neutrale Locus Laca mit dem Plasmid pDR183 stellen wir in der Abbildung 3. Fügen Sie diesen Reporter mit der gleichen Technik, die wir oben beschrieben für die Insertion von Reportern in pKM008 geklont. </li><li> Übertragen Sie die Reporter aus dem Stamm 168 bis NCIB3610, die in der Lage, Biofilme zu bilden. Verwenden Sie die SPP1 Phagen Transduktion Protokoll 28,29. Grow Donorstamm in TY-Medium (LB 10 mM MgSO 4 10 uM MnSO 4). Mischen Sie 200 ul der Kultur mit 100 ul Phagen Lager Verdünnung. 3 ml Soft-Agar nach 30 min Inkubation und erlauben Phagen Halos entstehen bei 37 ° C </li><li> Sammeln Sie die Soft-Agar. Zentrifugieren es und die überstehende dachte eine Spritze 0,22 um-Filter. Mit dieser Überstand, um eine Kultur des Rezipienten-Stamm in TY-Medium zu infizieren. In 30 ul bis 10 ml Kultur 1:10 verdünnt. Inkubieren für 30 min und wählen Sie für Antibiotika-Resistenz nach 24 h Inkubation. </li><li> Sewählt einen geeigneten Kolonie wachsen und es über Nacht auf LB bei 37 ° C </li><li> Spot 3 ul der Übernachtkultur auf festen Biofilm-induzierenden Medium MSgg 1,5% Agar 30. Willkommen Zellen während 72 Stunden bei 30 ° C (3) wachsen. Nach drei Tagen Wachstum entwickelt Biofilme auf der Oberfläche des MSgg Agar bilden einen Komplex morphologischen Architektur in der Oberfläche des Agar. </li></ol> 2. Biofilmdispersion und Zellfixierung <ol><li> Entfernen Sie den Biofilm bilden die Oberfläche des MSgg Agar mit einem Zahnstocher oder einer Pinzette. Die Konsistenz des Biofilms sollte es Ihnen ermöglichen, um diese abziehen von der Oberfläche des Agars in einem Stück. </li><li> Setzen Sie den Biofilm in 3 ml PBS-Puffer und verteilen den Biofilm durch wiederholte Passage durch eine Pipette oder einer Nadel. Alternativ können Biofilm Dispersion erfolgt mit milden Beschallung werden. Milde Beschallung benötigt 12 Impulsen mit einer Leistung von 3 und Amplitude von 0,7 Sekunden. </li><li> Fix Proben vor Zell-Single-Analyse. Resuspend 300 ul der Zellsuspension in 1 ml 4% Paraformaldehyd Lösung, Inkubation bei Raumtemperatur für genau sieben Minuten. Zusammensetzung von 4% Paraformaldehyd-Lösung: 2 g Paraformaldehyd 50 ml PBS-Puffer 4 ul 10 N NaOH Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 um Filter und aliquoten </li><li> Waschen der Zellen nach der Fixierung in PBS-Puffer dreimal und resuspendieren ihnen in 300 ul PBS-Puffer. </li></ol> 3. Fluoreszenz-Mikroskopie <ol><li> Gießen Sie 200 ul 0,8% Agarose über einen Objektträger und sorgfältig bedecken Sie es mit einer anderen Folie. Entfernen der oberen Folie sanft nach 2 Minuten, um eine Schicht von Agarose an der Folie des Bodens zu erhalten. </li><li> Spot 2 ul der fixierten Zellen auf der Oberfläche der Agarose-Schicht und bedecken Sie es mit einem Mikroskop Deckglas. </li><li> Legen Sie die Probe im Fluoreszenzmikroskop. Wir verwenden ein Fluoreszenzmikroskop Leica DMI6000B ausgestattet mit einem Leica CRT6000 iIluminatIonen-System. Die Filter sind für YFP Ex: BP500/20, Em: BP535/30 und für CFP sind Ex: BP426/20, Em: 480/40 </li><li> Setzen Sie Ihre Probe einer Anregung Fluoreszenz zwischen 50-200 ms. Stellen Sie die Erregungsperiode gemäß einer negativen Kontrolle, die keine Fluoreszenz in den Bedingungen für das Experiment ausgewählt zeigt. </li><li> Siehe die Fluoreszenz Bild auf dem gleichen Bild mit hellen Feld erhalten. Zusammenführen der beiden Bilder in einem Bild. Die Ergebnisse fließen Fluoreszenz-Mikroskopie mit einem einfach markierten Stamm, der den Reporter P Tapa-YFP in 6 dargestellt werden erhalten. </li></ol> 4. Die Quantifizierung einzelner Zellen mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Disperse die Stichprobe der fixierten Zellen mit milden Beschallung. Die Probe mit Ultraschall Durchführen 2-Serie von 12 Pulsen mit einer Leistung von 5 und Amplitude von 0,7 Sekunden, um Klumpen in einzelne Zellen zu dispergieren, ohne zur Zell-Lyse. Bestätigen Sie die Effizienz der Zelle Dispersion mittels Lichtmikroskopie. </li&gt; <li> Verdünnen der Probe 1:100 in PBS-Puffer, bevor Durchflusszytometrie-Analyse. Wir verwenden ein Durchflusszytometer BD FACS Canto II. Für YFP-Fluoreszenz, verwenden Sie einen Laser-Anregung bei 488 nm mit 530/30 Filter gekoppelt. Für GFP-Fluoreszenz, verwenden Sie den Laser-Anregung bei 405 nm mit einem 408/40 Filter gekoppelt. </li><li> Kalibrieren Sie das Durchflusszytometer Maschine mit zwei negativen Kontrollen. Eine Probe von PBS-Puffer ohne Zellen in Suspension sollte als Negativkontrolle für die Größe der Teilchen, erfasst durch das Durchflusszytometer zu dienen. Eine Probe ohne Fluoreszenz-Reporter markiert ist als negative Kontrolle für die Fluoreszenz-Empfindlichkeit des Durchflusszytometer dienen. </li><li> Legen Sie die Probe mit dem fluoreszierenden Reporter im Durchflusszytometer beschriftet. Für jede Probe zu analysieren mindestens 50.000 Ereignisse mit einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen 300 und 3000 pro Sekunde. </li><li> Erfassen von Daten mittels FACS Diva Software (BD Biosciences) und analysieren sie mit Hilfe FlowJo 8.5.2 Software. Siehe Fluoreszenz-Signale an die Steuerung, die zeigen,s keine Fluoreszenz. </li><li> Präsentieren der Daten Überwachung der Fluoreszenz-Signal von einem einfach markierten Stammes in einem Zwei-Achsen-Grafik. Zur Erstellung der Fluoreszenzsignal in der X-Achse und der Anzahl von Zellen, die die verschiedenen Ebenen der Fluoreszenz in der Y-Achse erfaßt. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung einer einzigen markierten Stamm, der den Reporter P Tapa-YFP in Abbildung 8 dargestellt werden erhalten. </li><li> Präsentieren der Daten Überwachung der Fluoreszenz-Signal von einer doppelt markierten Stamm in einem Drei-Achsen-Grafik. Zur Erstellung der Fluoreszenz-Signal von jedem der Kanäle in X und Y-Achse (beispielsweise GFP würde in der X-Achse und GFP in der Y-Achse gemessen werden) überwacht. Plot in der Z-Achse die Anzahl der Zellen, die jedes Reporterkügelchen und sie als Kontur Isolinien, die senkrecht wäre der Ebene des Papiers (Abb. 9 und 10). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Wenn B. subtilis wächst auf einem Teller des biofilm-induzierenden Medium MSgg, Biofilmbildung wird nach drei Tagen Inkubation bei 30 ° C 30 beobachtet. Der Biofilm zeigt starke Kohärenz und es könnte von der Oberfläche des Mediums werden in einem Stück abgezogen werden. Darüber hinaus zeigt sich der Biofilm eine komplexe morphologische Architektur, die ein Indikator für die verschiedenen beteiligten Zell-Subpopulationen (Abb. 5) ist. Zum Beispiel wird die Produktion der extrazellulären Matrix in Biofilmen in der Bildung von Falten auf der Oberfläche der Kolonie. Diese Funktion kann mit der Differenzierung der Subpopulation von 19 Herstellern Matrix korreliert werden. In ähnlicher Weise ist die Ansammlung von Luft Strukturen auf der Oberfläche des Biofilms auf die Anwesenheit einer Subpopulation von sporenbildenden Zellen, da die Sporen in der apikalen Bereich dieser Strukturen 30 lokalisiert. Beispiele der Visualisierung von Zelldifferenzierung in einem einfach markierten und eine doppelt markierte Stamm unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie sind represented in 6 bzw. 7. Die einfach markierten Stamm birgt die fluoreszierenden Reporter P Tapa-GFP, die in der Subpopulation von Matrix-produzierenden Zellen exprimiert wird. Diese Subpopulation ist verantwortlich zur Produktion und Sekretion der extrazellulären Matrix, die den Biofilm (6) bildet. Die Doppel-markierten Stamm birgt die Reporter P Tapa-GFP-26 und die zusätzliche Reporter P srfAA-YFP 31. Diese zweite Reporter ermöglicht es, die Subpopulation von Zellen verantwortlich, die Signalmolekül Surfactin, was die Signalkaskade ausgelöst, um die Differenzierung der Matrix Produzenten (Abb. 7) absondern zu überwachen. Subpopulation der Matrix Produzenten sind falsch in blau gefärbten während die Subpopulation von Surfactin Produzenten falsch ist gelb gefärbt. Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung einer einzigen markierten Stamm, der Reporter P Tapa-YFP in Abbildung 8 dargestellt. Unbehandelte Kontrollstamm nicht beherbergenkeine fluoreszierende Protein Gene zeigte eine einzelne Population niedrigen relativen Fluoreszenz. Zellen, die P Tapa-YFP in nicht Biofilm-induzierenden Bedingungen nicht unterscheiden die Subpopulation von Matrix-Produzenten und die ganze Bevölkerung zeigten eine geringe relative Fluoreszenz. In Biofilm-induzierenden Bedingungen, kam es zu einer Subpopulation von Zellen mit einer hohen relativen Fluoreszenz beobachtet als eine Schulter auf der rechten Seite der niedrigen relativen Fluoreszenz Peak 23. Die Ergebnisse der Durchflusszytometrie-Analyse unter Verwendung eines Doppel-markierten Stammes sind in Abbildung 9 und 10 vertreten. Abbildung 9 überwacht die Subpopulationen der Matrix Produzenten und Produzenten Surfactin mit der Doppel-markierten Stamm P Tapa-GFP, P srfAA-YFP. Als Kontrolle der Hintergrundfluoreszenz verwendeten wir eine Stamm nicht beherbergen keine fluoreszierende Protein Gene. Als nächstes entdeckt man jede Subpopulation von Matrix-Produzenten und Surfactin Hersteller auf jedem Kanal Fluoreszenz unter Verwendung von Ein-markierten Stamm<html> s als Kontrollen. Die Doppel-markierten Stamm P Tapa-GFP, P srfAA-YFP zeigte zwei Subpopulationen von Zellen, die hohe Konzentrationen der fluoreszierenden Reporter. Jede Population wird gerahmt, die zeigen, dass es keine Überschneidungen bei der Expression der Reporter zwischen den beiden Subpopulationen von spezialisierten Zellen 15. Ebenso Durchflusszytometrie-Analyse mit Doppel-markierten Stamm P SKF-YFP, P Tapa-YFP ist in Abbildung 10 dargestellt. Der Reporter-Gen für die SKF überwacht die Differenzierung der Subpopulation von Kannibalen 32, die beschrieben worden ist, um koordinativ differenzieren mit der Subpopulation von Matrix 24 Herstellern. In diesem Fall hatte die doppelt markierte Stamm eine einzelne Subpopulation von fluoreszierenden Zellen, die sowohl YFP und GFP. Dies zeigte, dass beide Wege Zelldifferenzierung koordinativ sind in der gleichen Subpopulation aktiviert. 1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Das Protokoll ist in drei Hauptbereiche unterteilt. Der erste Schritt erfordert die Kennzeichnung der Stamm von B. subtilis mit dem Reporter, der die Fusion Subpopulation von Interesse überwacht. Zweitens wachsen beschriftet Stämme in Biofilm-induzierenden Bedingungen. Drittens, verteilen den Biofilm und durchzuführen Single-Cell-Analyse der Population mit der Fluoreszenz-Mikroskop und Durchflusszytometrie. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig2.jpg" /> Abbildung 2. Schematische Darstellung der Integration Vektor pKM008. Dieser Vektor integriert die Reporter Fusion von Interesse in der neutralen Ort amyE durch doppelte Rekombination. Der Promoter von Interesse (P Tapa) in Vektor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und HindIII. Dann wird die Expression des GFP-Gen unter der Kontrolle des Promotors P Tapa. Die orientatIonen der Gene in das Plasmid wird durch einen Pfeil dargestellt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig3.jpg" /> Abbildung 3. Schematische Darstellung der Integration Vektor pDR183. Dieser Vektor integriert die Reporter Fusion von Interesse in der neutralen Ort Laca durch doppelte Rekombination. Die Fusion von Interesse (P Tapa - GFP) ist in den Vektor mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI. Die Orientierung der Gene im Plasmid wird durch einen Pfeil dargestellt. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig4.jpg" /> Abbildung 4. Schema der Integration der Reporter in das Chromosom von B. subtilis durch doppelte Rekombination. (A) B. subtilis-Chromosom besitzt zwei neutrale Loci, amyE und Laca, zu Fusionen Reporter ohne Auswirkungen auf die Entwicklung des Biofilms zu integrieren. (B) </sTrong&gt; Prozess der doppelten Rekombination von pKM008. Linearisierte Plasmid integriert in das Genom von B. subtilis durch doppelte Rekombination. Der Reporter Fusion integriert in die neutrale Locus in einer stabilen Weise. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig5.jpg" /> Abbildung 5. Biofilmbildung von B. subtilis NCIB3610. Prozess der bioflm Bildung des Stammes B. subtilis NCIB 3610 beim Anbau auf dem Biofilm-induzierenden Medium MSgg während der drei Tage bei 30 ° C Sequential Bilder von der Entwicklung des Biofilms wurden alle 12h genommen. <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig6.jpg" /> Abbildung 6. Visualisierung der Subpopulation der Matrix Produzenten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Eine Probe aus einem Biofilm von B. subtilis P Tapa - GFP wurde fixiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht. 200 ms der FluoreszenzAnregung zeigte eine Subpopulation von Zellen emittieren höhere Fluoreszenz als der Rest der Zellen. Wir haben über diese Subpopulation als Subpopulation von Matrix-produzierenden Zellen. Maßstabsbalken ist 3 um. <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig7.jpg" /> Abbildung 7. Visualisierung der Subpopulation der Matrix Produzenten und Surfactin Produzenten unter dem Fluoreszenzmikroskop. Stichprobe aus einem Biofilm der B. subtilis P Tapa-GFP, YFP-P srfAA Doppel-markierten Stamm wurde fixiert und unter dem Fluoreszenzmikroskop. Belichtungszeit von 250 ms belegt zwei Subpopulationen von Zellen emittieren höhere Fluoreszenz als der Rest der Zellen. Eine Subpopulation exprimiert YFP und es wurde festgestellt ausschließlich unter Verwendung des YFP-Kanal (false gelb gefärbt). Dies ist die Subpopulation von Surfactin Hersteller. Eine weitere Subpopulation exprimiert GFP und es wurde ausschließlich unter Verwendung der GFP chann<html> el. Dies ist die Subpopulation der Matrix Hersteller. Maßstabsbalken ist 3 um. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig8.jpg" /> 8. Die Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Produzenten mit 2-D-Durchflusszytometrie. Verstreute Zellen aus einem Biofilm von B. subtilis P Tapa-YFP wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Das Durchflusszytometer gezählt 50,000 Ereignisse und das Fluoreszenzsignal für jedes Ereignis überwacht wurde. Anzahl der Zellen gezählt wird in Y-Achse aufgetragen, während die Intensität von YFP-Signal in der X-Achse aufgetragen ist. Die Zellen wurden in LB-Medium nicht-induzierenden Bedingungen Biofilm zu erhalten. Die Zellen wurden in MSgg mittel-bis Biofilm-induzierenden Bedingungen zu erhalten gewachsen. Die Subpopulation von Matrix-Produzenten unterscheidet nur in Biofilm-induzierenden Bedingungen. Diese Zahl wurde von López et al angepasst., PNAS (2009) 106 :280-285. s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg &quot;/&gt; Abbildung 9. Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Hersteller und Produzenten Surfactin unter Verwendung von 3-D Durchflusszytometrie. Fluoreszenzsignal der Kanäle überwacht werden in der X-Achse (YFP) und Y-Achse (GFP) dargestellt. Die Z-Achse misst die Anzahl von Zellen, die sich Reporter und wird quantifiziert als Kontur Isolinien der Ebene des Papiers senkrecht. Die Anzahl der Ereignisse in diesem Experiment beobachtet wurde 50,000 Ereignisse. Linke obere Fenster enthält eine Steuerung der Hintergrund-Fluoreszenz beherbergen keine fluoreszierende Protein Gene. Rechte obere Panel erkennt die Subpopulation von Surfactin Produzenten in der YFP-Fluoreszenz-Kanal (gerahmt in gelb) mit einem einzigen Stamm P-markierten srfAA-YFP. Linke untere Platte erkennt die Subpopulation von Matrix-Produzenten in den GFP-Fluoreszenz-Kanal (blau umrandete Bilder) mit einem einzigen Stamm P-markierten Tapa-GFP. Die Doppel-markierten Stamm P Tapa &lt;/ Em&gt;-GFP, P srfAA-YFP ist in der rechten unteren Panel überwacht. Es zeigte zwei Subpopulationen, die in gelb und blau eingerahmt werden. Diese Zahl wurde von López et al angepasst., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638. <img alt="Abbildung 10" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig10.jpg" /> Abbildung 10. Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Hersteller und Kannibalen unter Verwendung von 3-D Durchflusszytometrie. Fluoreszenzsignal der Kanäle überwacht werden in der X-Achse (YFP) und Y-Achse (GFP) dargestellt. Die Anzahl der Ereignisse in diesem Experiment überwacht war 50,000. Rechte obere Panel erkennt die Subpopulation von Kannibalen in der YFP-Fluoreszenz-Kanal (gerahmt in gelb) in einem einzigen Stamm P-markierten SKF-YFP. Linke untere Platte erkennt die Subpopulation von Matrix-Produzenten in den GFP-Fluoreszenz-Kanal (blau umrandete Bilder) in einem einzigen Stamm P-markierten Tapa-GFP. Das d-markierte das Gerät auch Stamm P Tapa-GFP, P SKF-YFP zeigte nur eine Subpopulation von Zellen in der Diagonale auf die X-und Y-Achse (grün umrahmt). Diese Subpopulation ist in der YFP-und CFP-Kanal erkannt, weil es die zwei Reporter gleichzeitig drückt. López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Die Tatsache, dass bakterielle Gemeinschaften Subpopulationen von Zellen, die bestimmte Gruppe von Genen, beweist die Komplexität mikrobieller Gemeinschaften 33,34 zeigen. Dieses Protokoll soll helfen, festzustellen, ob die Expression eines beliebigen Gens von Interesse für eine bestimmte Subpopulation von spezialisierten Zellen innerhalb der mikrobiellen Gemeinschaft beschränkt. Die Visualisierung dieser Subpopulationen erfordert die Entwicklung neuer Techniken, da herkömmliche Methoden Genexpression oder Mi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Technik </td><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg Zusammensetzung </td><td> 5 mM Kaliumphosphat </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> 100 mM MOPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> 2 mM Magnesiumchlorid </td><td> Roth </td><td> 2189,1 </td></tr><tr><td> Calciumchlorid 700μM </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> Eisenchlorid 50 uM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> Zinkchlorid 1 &amp;mgr; M </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Thiamin 2 &amp;mgr; m </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> Glycerin 0,5% </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> GlutaMate 0,5% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Tryptophan 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Phenylalanin 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> Zellfixierung </td><td> Paraformaldehyd </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Bezeichnung des Geräts </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Ultraschallbehandlung </td><td> Zelle Sonicator </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Mikroskopie </td><td> Fluoreszenz-Mikroskop </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Name der Software </td><td> Firma </td><td> Katalog-Zahl </td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Mikroskopie </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Die Durchflusszytometrie </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Die Durchflusszytometrie </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

einzel-zell-analyse bacillus subtilis biofilme mittels fluoreszenzmikroskopie und durchflusszytometrie

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm-Bildung ist ein allgemeines Attribut auf fast allen Bakterien 6.1. Wenn Bakterien Biofilme zu bilden, sind Zellen, in der extrazellulären Matrix, die hauptsächlich gebildet wird von Proteinen und Exopolysacchariden, neben anderen Faktoren 7-10 umhüllt. Die mikrobielle eingeschlossen innerhalb der Biofilme häufig zeigt die Differenzierung von unterschiedlichen Subpopulation von spezialisierten Zellen 11-17. Diese Subpopulationen koexistieren und zeigen oft räumliche und zeitliche Organisation innerhalb des Biofilms 18-21. Biofilm-Bildung in den Modellorganismus Bacillus subtilis erfordert die Differenzierung von Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Unter ihnen ist die Subpopulation der Matrix Hersteller verantwortlich zu produzieren und sezernieren die extrazelluläre Matrix des Biofilms wesentlichen für die Biofilmbildung 11,19. Daher ist die Differenzierung von Matrix-Produzenten ein Markenzeichen der Biofilmbildung bei B. subtilis. Wir haben fluoreszierenden Reporter zur Visualisierung und Quantifizierung der Subpopulation der Matrix Produzenten in Biofilmen von B. subtilis 15,19,22-24. Konkret haben wir beobachtet, dass die Subpopulation der Matrix Hersteller in Reaktion auf das Vorhandensein von selbst produzierten extrazelluläres Signal Surfactin 25 unterscheidet. Interessanterweise wird Surfactin von einer Subpopulation von spezialisierten Zellen unterscheidet sich von der Subpopulation von Matrix 15 Herstellern produziert. Wir haben in diesem Bericht die technischen Ansatz notwendig, visualisieren und quantifizieren die Subpopulation von Matrix-Produzenten und Surfactin Produzenten innerhalb der Biofilme von B. subtilis beschrieben. Um dies zu tun, sind fluoreszierende Reporter von Genen für Matrix-Produktion und die Produktion benötigten Surfactin in das Chromosom von B. eingefügt subtilis. Reporter werden nur in einer Subpopulation von spezialisierten Zellen exprimiert. Dann können die Subpopulationenüberwacht mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie (siehe Abb. 1). Die Tatsache, dass unterschiedliche Subpopulationen von spezialisierten Zellen in vielzelligen Gemeinschaften von Bakterien koexistieren gibt uns eine andere Perspektive über die Regulation der Genexpression in Prokaryoten. Dieses Protokoll befasst sich mit diesem Phänomen experimentell und es kann leicht zu einer anderen Arbeits-Modell angepasst werden, um die molekularen Mechanismen der phänotypischen Heterogenität innerhalb einer mikrobiellen Gemeinschaft aufzuklären.

Mikrobielle Biofilme sind in der Regel bestehend aus Subpopulationen von spezialisierten Zellen. Einzelzell-Analyse dieser Subpopulationen setzen die Verwendung von fluoreszierenden Reporter. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu visualisieren und überwachen mehrere subpopulationswithin<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilmen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie.

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Die Biofilmbildung ist ein allgemeines Merkmal fast aller Bakterien 1-6. Wenn Bakterien Biofilme bilden, sind die Zellen in eine extrazelluläre Matrix eingebettet, die hauptsächlich aus ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die unterschiedlichen Subpopulationen spezialisierter Zellen in Biofilmen des Modellorganismus Bacillus subtilis sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst transkriptionelle Reporter in das Chromosom von B. subtilis eingefügt werden. Diese Reporter werden ausschließlich in der zu untersuchenden Zellsubpopulation exprimiert.Der nächste Schritt besteht darin, die Entwicklung eines Biofilms zu fördern, indem B. subtiles in dem biofilmbildenden Medium Ms GG gg kultiviert wird. Nach der Biofilmbildung werden die Zellen aus dem Biofilm dispergiert und mit Parafomaldehyd fixiert. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Detektion des Fluoreszenzsignals, das von einzelnen Zellen der mikrobiellen Gemeinschaft mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie emittiert wird.Letztendlich zeigen die Ergebnisse, wie Zellen, die spezialisiert sind auf die Produktion und Sekretion, sowie die extrazelluläre Matrix, aus der der Biofilm besteht, eine unterschiedliche Teilpopulation darstellen im Vergleich zu den Zellen, die das Signal­molekül Surfactant sezernieren, das für die Differenzierung der Teilpopulation von Matrix-produzierenden Zellen verantwortlich ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Quantifizierung der Transkriptionsexpression mithilfe von Vita-Ities-Assays oder der Mikroarray-Analyse liegt darin, dass wir die Genexpression auf Einzelzell-Ebene verfolgen und insbesondere kleine Zellpopulationen sichtbar machen können, die spezialisiert sind, ein bestimmtes Gen zu exprimieren.Diese Genexpressionen werden nicht erfasst, wenn die Gesamtpopulation analysiert wird. Integrative Plasmide werden zur Markierung von B. subtiles verwendet, und hier ist ein Beispiel gezeigt. PTAA, der Promotor der Gene, die für die Produktion von Tass verantwortlich sind.Ein Matrixprotein wird mithilfe der Restriktionsstellen ECO R one und Hindi three in den Vektor kloniert. Die Expression des CFP-Reportergens steht nun unter der Kontrolle von ptap A. Um das Verfahren zur Markierung von B zu beginnen, linearisieren Sie das integrierende Plasmid durch enzymatische Verdauung. Die empfohlene Restriktionsenzyme ist XH oh one. Wenn das integrierende Plasmid bereit ist, induzieren Sie natürliche Kompetenz im B-subtlest-Stamm 1 68, indem Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius in kompetenzinduzierendem Medium kultivieren.Fügen Sie das linearisierte Plasmid der Kultur aus kompetenten B. subtilis-Zellen hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Danach plattieren Sie die Zellen auf Agar mit Spektinomycin und inkubieren sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Das Chromosom von B. subtilis weist zwei neutrale Loci auf, AmyE und lacA, die zur Integration von Reportergenfusionen verwendet werden können, ohne die Entwicklung des Biofilms zu beeinträchtigen. Das linearisierte PKM008-Plasmid integriert durch doppelte Rekombination in das Genom von B. subtilis.Der nächste Schritt besteht darin, den Reporter mittels des SPP1-Phagentransduktionsprotokolls von dem markierten Stamm auf einen Stamm zu übertragen, der in der Lage ist, Biofilme zu bilden. Für dieses Video werden nur die wichtigsten Schritte des Protokolls gezeigt. Kultivieren Sie den Donorstamm 1 68, der die Reporterfusion trägt, in TY-Medium bei 37 Grad Celsius, bis die Kultur die frühe stationäre Phase erreicht hat, und geben Sie 200 Mikroliter Zellen zu 100 Mikrolitern verdünnter Phagelösung in ein Glasröhrchen. Und lassen Sie uns 15 Minuten bei 37 Grad Celsius stehen. Als Nächstes pipettieren Sie heißes TY-Weichagar in das Röhrchen und mischen gründlich durch Wirbeln. Vorsichtig auf eine frische TY-Platte auftragen und 8 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit Phagenhalos entstehen können.Um die Phagenhalos zu sammeln, fügen Sie drei Milliliter TY-Medium zur Platte hinzu und verwenden Sie die Glaspipette, um das Obergar zu zerkleinern. Überführen Sie die Agarsuspension in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Vortexen Sie vorsichtig, um das Agar zu zerkleinern, und zentrifugieren Sie anschließend 15 Minuten bei 1000 ×g.Überführen Sie das Überstand in ein neues Gefäß. Lassen Sie das Überstand durch einen 22-Mikron-Spritzenfilter laufen. Verwenden Sie dieses Überstand, um eine Kultur des Empfängerstamms, die in TY-Medium gezüchtet wurde, zu infizieren.Geben Sie 30 Mikroliter Überstand zu 10 Milliliter Kultur, die im Verhältnis 1:10 verdünnt wurde, und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Danach zentrifugieren Sie bei 5.000 U/min sieben Minuten lang, resuspendieren das Pellet in 200 Mikrolitern TY-Medium und streichen es auf eine Platte, die Spektinomycin plus 10 Millimolar Natriumcitrat enthält.Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 12 bis 36 Stunden. Wählen Sie eine Kolonie aus und kultivieren Sie sie über Nacht in flüssigem LB bei 37 Grad Celsius. Geben Sie abschließend drei Mikroliter der Übernachtkultur auf festes Biofilmbildungs-induzierendes Medium. Lassen Sie die Zellen 72 Stunden bei 30 Grad Celsius wachsen. Nach drei Tagen Wachstum entwickeln die auf der Oberfläche des Ms.GG-Agars gebildeten Biofilme eine komplexe morphologische Architektur an der Oberfläche des Agars. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen Zahnstocher oder eine Pinzette, um den Biofilm von der Oberfläche des MSGG-Agars zu entfernen.Die Konsistenz des Biofilms sollte es ermöglichen, ihn vollständig von der Oberfläche des Agars abzulösen. Legen Sie den Biofilm in einem Stück in drei Milliliter PBS-Puffer und dispergieren Sie den Biofilm vorsichtig. Führen Sie 12 Impulse mit einer Leistung von drei und einer Amplitude von 0,7 Sekunden durch, um die Proben vor der Einzelzellanalyse zu fixieren.Suspendieren Sie 300 Mikroliter der Zellsuspension in einem Milliliter einer 4 %igen Paraformaldehydlösung und inkubieren Sie genau sieben Minuten bei Raumtemperatur. Nach der siebenminütigen Fixierung waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS-Puffer. Schließlich resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikrolitern PBS-Puffer vor der Fluoreszenzmikroskopie.Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie 200 Mikroliter einer 0,8 %igen Agarose-Lösung über den Objektträger pipettieren und diese vorsichtig mit einem weiteren Objektträger bedecken. Nach zwei Minuten entfernen Sie den oberen Objektträger vorsichtig, um eine Schicht Agarose zu erhalten, die am unteren Objektträger haftet. Geben Sie 2 Mikroliter fixierter Zellen auf die Oberfläche der Agarose-Schicht und bedecken Sie diese mit einem Deckglas.Platzieren Sie die Probe auf dem Objekttisch des Fluoreszenzmikroskops. Stellen Sie die Anregungsdauer entsprechend einer negativen Kontrolle ein, die unter den für das Experiment gewählten Bedingungen keine Fluoreszenz zeigt. Die Belichtungszeit sollte zwischen 50 und 200 Millisekunden liegen.Erfassen Sie ein Fluoreszenzbild sowie ein Hellfeldbild für jedes Blickfeld. Um die Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse vorzubereiten, dispergieren Sie die Probe fixierter Zellen durch schonende Beschallung. Führen Sie zwei Serien mit jeweils 12 Impulsen bei einer Ausgabeleistung von fünf und einer Amplitude von 0,7 Sekunden durch, um Zellklumpen in Einzelzellen zu zerlegen, ohne eine Zelllyse zu verursachen.Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Zellzerstreuung mittels Lichtmikroskopie. Verdünnen Sie die Probe anschließend im Verhältnis 1 zu 100 in PBS-Puffer. Für diese Analyse der YFP-Fluoreszenz wird ein BD FACS Canto II-Durchflusszytometer verwendet.Eine Laseranregung bei 488 Nanometern in Kombination mit einem 530/30-Filter wird für die CFP-Fluoreszenz verwendet. Eine Laseranregung bei 405 Nanometern in Kombination mit einem 408/40-Filter wird verwendet, um den Durchflusszytometer mit zwei negativen Kontrollen zu kalibrieren. Eine Probe mit PBS-Puffer ohne in Suspension befindliche Zellen sollte als negative Kontrolle für die Größe der vom Durchflusszytometer erfassten Partikel dienen.Eine Probe ohne fluoreszierenden Reporter sollte als negativer Kontrollwert für die fluoreszenztechnische Empfindlichkeit des Durchflusses dienen. Nach der Kalibrierung die mit einem fluoreszierenden Reporter markierte Probe in den Durchflusszytometer geben; für jede Probe mindestens 50.000 Ereignisse bei einer Durchflussrate zwischen 303.000 Ereignissen pro Sekunde analysieren. Wenn B. subtilis auf einer Platte mit dem biofilmbildungsinduzierenden Medium MSGG wächst, ist nach drei Tagen Inkubation bei 30 Grad Celsius die Bildung von Biofilmen zu beobachten.Der Biofilm zeigt eine komplexe morphologische Architektur, die auf die unterschiedlichen beteiligten Zellsubpopulationen hinweist. Beispielsweise führt die Produktion der extrazellulären Matrix und von Biofilmen zur Bildung von Falten auf der Oberfläche der Kolonie. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die Visualisierung der Zelldifferenzierung in einem einzigen markierten Stamm mittels Fluoreszenzmikroskopie.Dieser Stamm trägt den fluoreszierenden Reporter Ptap, ein CFP, das in der Unterpopulation der Matrix produzierenden Zellen exprimiert wird, die blau gefärbt sind. Diese Unterpopulation produziert und sekretiert die extrazelluläre Matrix, aus der der Biofilm besteht. Dieses nächste Bild zeigt das Ergebnis der Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie eines doppelt markierten Stammes, der den Reporter Ptap, ein CFP, sowie den zusätzlichen Reporter P Surfactin YFP trägt.Dieser zweite Reporter ermöglicht die Überwachung der Zellsubpopulation, die für die Sekretion des Signalstoffes Surfactin verantwortlich ist, welches die Signaltransduktion zur Differenzierung der Matrix-produzierenden Zellen auslöst. Hier sind die Matrix-produzierenden Zellen fälschlicherweise blau eingefärbt, während die Tensid-produzierenden Zellen fälschlicherweise gelb eingefärbt sind, Ergebnisse der 2D-Durchflusszytometrie unter Verwendung eines einzelnen markierten Stammes, der den Reporter ptap trägt. Ein YFB wird hier dargestellt.Der unbehandelte Kontrollstamm ohne Gene für fluoreszierende Proteine zeigte eine einzelne Population mit geringer relativer Fluoreszenz in Zellen, die ptap enthielten. Ein YFP unter nicht biofilmbildenden Bedingungen differenzierte die Teilpopulation der Matrixproduzenten nicht, und die gesamte Population zeigte ebenfalls eine geringe relative Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu wurde unter biofilmbildenden Bedingungen eine Teilpopulation von Zellen mit hoher relativer Fluoreszenz als Schulter rechts der geringen relativen Fluoreszenz detektiert.Hier werden die Spitzenwerte aus der 3D-Durchflusszytometrie gezeigt. Die Fluoreszenzsignale der überwachten Kanäle sind auf der X-Achse für YFP und der Y-Achse für CFP dargestellt. Im oberen linken Feld ist ein Stamm ohne fluoreszierende Proteingene als Kontrolle für die Hintergrundfluoreszenz abgebildet. Im oberen rechten Feld wurde ein einfach markierter Stamm verwendet, um die Teilpopulation der Surfactin-Produzenten im gelb markierten YFP-Fluoreszenzkanal nachzuweisen.Im unteren linken Bereich wurde ein anderer einzelner markierter Stamm verwendet, um die Teilpopulation der Matrixbildner nachzuweisen. Im blau umrandeten CFP-Fluoreszenzkanal werden die Teilpopulationen der Matrixbildner und der Tensidbildner mithilfe des doppelt markierten Stammes verfolgt, und die Ergebnisse dargestellt. In diesem unteren rechten Bereich.Es werden zwei Subpopulationen von Zellen detektiert, die hohe Mengen der fluoreszierenden Reporter exprimieren. Jede Population ist abgegrenzt dargestellt, was zeigt, dass keine Überlappung in der Expression der Reporter zwischen den beiden Subpopulationen spezialisierter Zellen besteht. Diese letzte Abbildung zeigt die Quantifizierung der Subpopulationen von Matrix-produzierenden Zellen und Kannibalen mittels 3D-Durchflusszytometrie.Im oberen rechten Feld wurde ein einzelner markierter Stamm verwendet, um die Teilpopulation der Kannibalen nachzuweisen. Im gelb umrandeten YFP-Fluoreszenzkanal wurde beschrieben, dass sich diese Teilpopulation der Kannibalen koordiniert mit der Teilpopulation der Matrixproduzenten differenziert. Im unteren linken Feld wird die Teilpopulation der Matrixproduzenten in einem anderen einzelnen markierten Stamm im CFP-Fluoreszenzkanal detektiert.Die Ergebnisse des doppelt markierten Stammes im unteren rechten Feld, eingerahmt in Blau, zeigten eine einzige Subpopulation fluoreszierender Zellen, die sowohl YFP als auch CFP ausprägen, eingerahmt in Gr&uuml;n. Die gleichzeitige Expression der beiden Reporter weist darauf hin, dass beide Differenzierungspfade in derselben Subpopulation koordiniert aktiviert werden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verst&auml;ndnis daf&uuml;r haben, wie man die unterschiedlichen Subpopulationen von Zellen, die einen mikrobiellen Biofilm bilden, mithilfe der Zellanalyse der Zellpopulation – beispielsweise mittels fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung oder Durchflusszytometrie – sichtbar machen und quantifizieren kann.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Immunologie und Infektion

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Die Rolle des Sortiments (räumliche Trennung) in evolutionären Szenarien können mit einfachen mikrobiellen Systemen im Labor untersucht werden, die eine Anpassung der räumlichen Verteilung gesteuert ermöglichen. Durch eine Modifikation können die Gründer Zelldichte, verschiedene Sortiment Ebenen fluoreszenzmarkierte Bakterienstämme in der Kolonie Biofilme von Bacillus subtilis verwendet werden sichtbar gemacht .

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Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zu wachsen und qualitativ bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen durch konfokale und Elektronenmikroskopie analysiert.

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Durchflusszytometrie in Kombination mit visuellen clustering bietet eine einfach zu bedienende und schnelle Methode zur Untersuchung von aquatischer Biofilms. Biofilm-Charakterisierung, Erkennung von Veränderungen in der Struktur der Biofilm-Gemeinschaft und die Detektion von abiotischen Partikeln eingebettet im Biofilm einsetzbar.

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Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Untersuchung der subzellulären Lokalisierungsdynamik von Proteinen und zur Überwachung morphologischer Veränderungen mithilfe der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie in Bacillus subtilis und Staphylococcus aureus.

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Die Bildgebung von Bakterienzellen ist ein aufkommendem systembiologischen Ansatz, der sich auf die Definition statischer und dynamischer Prozesse konzentriert, die die Funktion großer makromolekularer Maschinen diktieren. Hier wird die Integration von quantitativer Live-Zell-Bildgebung und Kryo-Elektronentomographie verwendet, um Legionella pneumophila Typ IV Sekretionssystemarchitektur und -funktionen zu untersuchen.

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Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung von Durchflusszytometrie und Zählperlen zur Quantifizierung von Bakteriensporen, die mit Ethidiumbromid markiert sind. Die Methode ist auch effizient, um die kovalente Kopplung von Proteinen auf der Oberfläche intakter Sporen zu analysieren.

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Erfahren Sie, wie Sie spezialisierte Zellsubpopulationen in Bacillus subtilis-Biofilmen visualisieren und quantifizieren. Diese Methode nutzt Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie für Einzelzellanalysen.

Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

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