Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die unterschiedlichen Subpopulationen spezialisierter Zellen in Biofilmen des Modellorganismus Bacillus subtilis sichtbar zu machen und zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst transkriptionelle Reporter in das Chromosom von B. subtilis eingefügt werden. Diese Reporter werden ausschließlich in der zu untersuchenden Zellsubpopulation exprimiert.

Der nächste Schritt besteht darin, die Entwicklung eines Biofilms zu fördern, indem B. subtiles in dem biofilmbildenden Medium Ms GG gg kultiviert wird. Nach der Biofilmbildung werden die Zellen aus dem Biofilm dispergiert und mit Parafomaldehyd fixiert. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Detektion des Fluoreszenzsignals, das von einzelnen Zellen der mikrobiellen Gemeinschaft mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie emittiert wird.

Letztendlich zeigen die Ergebnisse, wie Zellen, die spezialisiert sind auf die Produktion und Sekretion, sowie die extrazelluläre Matrix, aus der der Biofilm besteht, eine unterschiedliche Teilpopulation darstellen im Vergleich zu den Zellen, die das Signal­molekül Surfactant sezernieren, das für die Differenzierung der Teilpopulation von Matrix-produzierenden Zellen verantwortlich ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Quantifizierung der Transkriptionsexpression mithilfe von Vita-Ities-Assays oder der Mikroarray-Analyse liegt darin, dass wir die Genexpression auf Einzelzell-Ebene verfolgen und insbesondere kleine Zellpopulationen sichtbar machen können, die spezialisiert sind, ein bestimmtes Gen zu exprimieren.

Diese Genexpressionen werden nicht erfasst, wenn die Gesamtpopulation analysiert wird. Integrative Plasmide werden zur Markierung von B. subtiles verwendet, und hier ist ein Beispiel gezeigt. PTAA, der Promotor der Gene, die für die Produktion von Tass verantwortlich sind.

Ein Matrixprotein wird mithilfe der Restriktionsstellen ECO R one und Hindi three in den Vektor kloniert. Die Expression des CFP-Reportergens steht nun unter der Kontrolle von ptap A. Um das Verfahren zur Markierung von B zu beginnen, linearisieren Sie das integrierende Plasmid durch enzymatische Verdauung. Die empfohlene Restriktionsenzyme ist XH oh one. Wenn das integrierende Plasmid bereit ist, induzieren Sie natürliche Kompetenz im B-subtlest-Stamm 1 68, indem Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius in kompetenzinduzierendem Medium kultivieren.

Fügen Sie das linearisierte Plasmid der Kultur aus kompetenten B. subtilis-Zellen hinzu und inkubieren Sie zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Danach plattieren Sie die Zellen auf Agar mit Spektinomycin und inkubieren sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Das Chromosom von B. subtilis weist zwei neutrale Loci auf, AmyE und lacA, die zur Integration von Reportergenfusionen verwendet werden können, ohne die Entwicklung des Biofilms zu beeinträchtigen. Das linearisierte PKM008-Plasmid integriert durch doppelte Rekombination in das Genom von B. subtilis.

Der nächste Schritt besteht darin, den Reporter mittels des SPP1-Phagentransduktionsprotokolls von dem markierten Stamm auf einen Stamm zu übertragen, der in der Lage ist, Biofilme zu bilden. Für dieses Video werden nur die wichtigsten Schritte des Protokolls gezeigt. Kultivieren Sie den Donorstamm 1 68, der die Reporterfusion trägt, in TY-Medium bei 37 Grad Celsius, bis die Kultur die frühe stationäre Phase erreicht hat, und geben Sie 200 Mikroliter Zellen zu 100 Mikrolitern verdünnter Phagelösung in ein Glasröhrchen.

Und lassen Sie uns 15 Minuten bei 37 Grad Celsius stehen. Als Nächstes pipettieren Sie heißes TY-Weichagar in das Röhrchen und mischen gründlich durch Wirbeln. Vorsichtig auf eine frische TY-Platte auftragen und 8 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit Phagenhalos entstehen können.

Um die Phagenhalos zu sammeln, fügen Sie drei Milliliter TY-Medium zur Platte hinzu und verwenden Sie die Glaspipette, um das Obergar zu zerkleinern. Überführen Sie die Agarsuspension in ein 15-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Vortexen Sie vorsichtig, um das Agar zu zerkleinern, und zentrifugieren Sie anschließend 15 Minuten bei 1000 ×g.

Überführen Sie das Überstand in ein neues Gefäß. Lassen Sie das Überstand durch einen 22-Mikron-Spritzenfilter laufen. Verwenden Sie dieses Überstand, um eine Kultur des Empfängerstamms, die in TY-Medium gezüchtet wurde, zu infizieren.

Geben Sie 30 Mikroliter Überstand zu 10 Milliliter Kultur, die im Verhältnis 1:10 verdünnt wurde, und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius. Danach zentrifugieren Sie bei 5.000 U/min sieben Minuten lang, resuspendieren das Pellet in 200 Mikrolitern TY-Medium und streichen es auf eine Platte, die Spektinomycin plus 10 Millimolar Natriumcitrat enthält.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 12 bis 36 Stunden. Wählen Sie eine Kolonie aus und kultivieren Sie sie über Nacht in flüssigem LB bei 37 Grad Celsius. Geben Sie abschließend drei Mikroliter der Übernachtkultur auf festes Biofilmbildungs-induzierendes Medium.

Lassen Sie die Zellen 72 Stunden bei 30 Grad Celsius wachsen. Nach drei Tagen Wachstum entwickeln die auf der Oberfläche des Ms.GG-Agars gebildeten Biofilme eine komplexe morphologische Architektur an der Oberfläche des Agars. Um dieses Verfahren zu beginnen, verwenden Sie einen Zahnstocher oder eine Pinzette, um den Biofilm von der Oberfläche des MSGG-Agars zu entfernen.

Die Konsistenz des Biofilms sollte es ermöglichen, ihn vollständig von der Oberfläche des Agars abzulösen. Legen Sie den Biofilm in einem Stück in drei Milliliter PBS-Puffer und dispergieren Sie den Biofilm vorsichtig. Führen Sie 12 Impulse mit einer Leistung von drei und einer Amplitude von 0,7 Sekunden durch, um die Proben vor der Einzelzellanalyse zu fixieren.

Suspendieren Sie 300 Mikroliter der Zellsuspension in einem Milliliter einer 4 %igen Paraformaldehydlösung und inkubieren Sie genau sieben Minuten bei Raumtemperatur. Nach der siebenminütigen Fixierung waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS-Puffer. Schließlich resuspendieren Sie die Zellen in 300 Mikrolitern PBS-Puffer vor der Fluoreszenzmikroskopie.

Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie 200 Mikroliter einer 0,8 %igen Agarose-Lösung über den Objektträger pipettieren und diese vorsichtig mit einem weiteren Objektträger bedecken. Nach zwei Minuten entfernen Sie den oberen Objektträger vorsichtig, um eine Schicht Agarose zu erhalten, die am unteren Objektträger haftet. Geben Sie 2 Mikroliter fixierter Zellen auf die Oberfläche der Agarose-Schicht und bedecken Sie diese mit einem Deckglas.

Platzieren Sie die Probe auf dem Objekttisch des Fluoreszenzmikroskops. Stellen Sie die Anregungsdauer entsprechend einer negativen Kontrolle ein, die unter den für das Experiment gewählten Bedingungen keine Fluoreszenz zeigt. Die Belichtungszeit sollte zwischen 50 und 200 Millisekunden liegen.

Erfassen Sie ein Fluoreszenzbild sowie ein Hellfeldbild für jedes Blickfeld. Um die Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse vorzubereiten, dispergieren Sie die Probe fixierter Zellen durch schonende Beschallung. Führen Sie zwei Serien mit jeweils 12 Impulsen bei einer Ausgabeleistung von fünf und einer Amplitude von 0,7 Sekunden durch, um Zellklumpen in Einzelzellen zu zerlegen, ohne eine Zelllyse zu verursachen.

Überprüfen Sie die Wirksamkeit der Zellzerstreuung mittels Lichtmikroskopie. Verdünnen Sie die Probe anschließend im Verhältnis 1 zu 100 in PBS-Puffer. Für diese Analyse der YFP-Fluoreszenz wird ein BD FACS Canto II-Durchflusszytometer verwendet.

Eine Laseranregung bei 488 Nanometern in Kombination mit einem 530/30-Filter wird für die CFP-Fluoreszenz verwendet. Eine Laseranregung bei 405 Nanometern in Kombination mit einem 408/40-Filter wird verwendet, um den Durchflusszytometer mit zwei negativen Kontrollen zu kalibrieren. Eine Probe mit PBS-Puffer ohne in Suspension befindliche Zellen sollte als negative Kontrolle für die Größe der vom Durchflusszytometer erfassten Partikel dienen.

Eine Probe ohne fluoreszierenden Reporter sollte als negativer Kontrollwert für die fluoreszenztechnische Empfindlichkeit des Durchflusses dienen. Nach der Kalibrierung die mit einem fluoreszierenden Reporter markierte Probe in den Durchflusszytometer geben; für jede Probe mindestens 50.000 Ereignisse bei einer Durchflussrate zwischen 303.000 Ereignissen pro Sekunde analysieren. Wenn B. subtilis auf einer Platte mit dem biofilmbildungsinduzierenden Medium MSGG wächst, ist nach drei Tagen Inkubation bei 30 Grad Celsius die Bildung von Biofilmen zu beobachten.

Der Biofilm zeigt eine komplexe morphologische Architektur, die auf die unterschiedlichen beteiligten Zellsubpopulationen hinweist. Beispielsweise führt die Produktion der extrazellulären Matrix und von Biofilmen zur Bildung von Falten auf der Oberfläche der Kolonie. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die Visualisierung der Zelldifferenzierung in einem einzigen markierten Stamm mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Dieser Stamm trägt den fluoreszierenden Reporter Ptap, ein CFP, das in der Unterpopulation der Matrix produzierenden Zellen exprimiert wird, die blau gefärbt sind. Diese Unterpopulation produziert und sekretiert die extrazelluläre Matrix, aus der der Biofilm besteht. Dieses nächste Bild zeigt das Ergebnis der Visualisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie eines doppelt markierten Stammes, der den Reporter Ptap, ein CFP, sowie den zusätzlichen Reporter P Surfactin YFP trägt.

Dieser zweite Reporter ermöglicht die Überwachung der Zellsubpopulation, die für die Sekretion des Signalstoffes Surfactin verantwortlich ist, welches die Signaltransduktion zur Differenzierung der Matrix-produzierenden Zellen auslöst. Hier sind die Matrix-produzierenden Zellen fälschlicherweise blau eingefärbt, während die Tensid-produzierenden Zellen fälschlicherweise gelb eingefärbt sind, Ergebnisse der 2D-Durchflusszytometrie unter Verwendung eines einzelnen markierten Stammes, der den Reporter ptap trägt. Ein YFB wird hier dargestellt.

Der unbehandelte Kontrollstamm ohne Gene für fluoreszierende Proteine zeigte eine einzelne Population mit geringer relativer Fluoreszenz in Zellen, die ptap enthielten. Ein YFP unter nicht biofilmbildenden Bedingungen differenzierte die Teilpopulation der Matrixproduzenten nicht, und die gesamte Population zeigte ebenfalls eine geringe relative Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu wurde unter biofilmbildenden Bedingungen eine Teilpopulation von Zellen mit hoher relativer Fluoreszenz als Schulter rechts der geringen relativen Fluoreszenz detektiert.

Hier werden die Spitzenwerte aus der 3D-Durchflusszytometrie gezeigt. Die Fluoreszenzsignale der überwachten Kanäle sind auf der X-Achse für YFP und der Y-Achse für CFP dargestellt. Im oberen linken Feld ist ein Stamm ohne fluoreszierende Proteingene als Kontrolle für die Hintergrundfluoreszenz abgebildet. Im oberen rechten Feld wurde ein einfach markierter Stamm verwendet, um die Teilpopulation der Surfactin-Produzenten im gelb markierten YFP-Fluoreszenzkanal nachzuweisen.

Im unteren linken Bereich wurde ein anderer einzelner markierter Stamm verwendet, um die Teilpopulation der Matrixbildner nachzuweisen. Im blau umrandeten CFP-Fluoreszenzkanal werden die Teilpopulationen der Matrixbildner und der Tensidbildner mithilfe des doppelt markierten Stammes verfolgt, und die Ergebnisse dargestellt. In diesem unteren rechten Bereich.

Es werden zwei Subpopulationen von Zellen detektiert, die hohe Mengen der fluoreszierenden Reporter exprimieren. Jede Population ist abgegrenzt dargestellt, was zeigt, dass keine Überlappung in der Expression der Reporter zwischen den beiden Subpopulationen spezialisierter Zellen besteht. Diese letzte Abbildung zeigt die Quantifizierung der Subpopulationen von Matrix-produzierenden Zellen und Kannibalen mittels 3D-Durchflusszytometrie.

Im oberen rechten Feld wurde ein einzelner markierter Stamm verwendet, um die Teilpopulation der Kannibalen nachzuweisen. Im gelb umrandeten YFP-Fluoreszenzkanal wurde beschrieben, dass sich diese Teilpopulation der Kannibalen koordiniert mit der Teilpopulation der Matrixproduzenten differenziert. Im unteren linken Feld wird die Teilpopulation der Matrixproduzenten in einem anderen einzelnen markierten Stamm im CFP-Fluoreszenzkanal detektiert.

Die Ergebnisse des doppelt markierten Stammes im unteren rechten Feld, eingerahmt in Blau, zeigten eine einzige Subpopulation fluoreszierender Zellen, die sowohl YFP als auch CFP ausprägen, eingerahmt in Grün. Die gleichzeitige Expression der beiden Reporter weist darauf hin, dass beide Differenzierungspfade in derselben Subpopulation koordiniert aktiviert werden. Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die unterschiedlichen Subpopulationen von Zellen, die einen mikrobiellen Biofilm bilden, mithilfe der Zellanalyse der Zellpopulation – beispielsweise mittels fluoreszenzmikroskopischer Bildgebung oder Durchflusszytometrie – sichtbar machen und quantifizieren kann.