Einzel-Zell-Analyse Bacillus subtilis Biofilme mittels Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die unterschiedlichen Subpopulationen spezialisierter Zellen zu visualisieren und zu quantifizieren, die sich in Biofilmen des Modellorganismus bacillus subtles differenzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst transkriptionelle Reporter in das Chromosom von B subtles eingefügt werden. Diese Reporter werden ausschließlich in der Subpopulation der untersuchten Zellen exprimiert.

Der nächste Schritt besteht darin, die Entwicklung eines Biofilms zu fördern, indem B-Feinstoffe in dem Biofilm-induzierenden Medium, Frau GG gg, gezüchtet werden. Nach der Biofilmbildung werden die Zellen aus dem Biofilm dispergiert und mit para-Formaldehyd fixiert. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, das von einzelnen Zellen der mikrobiellen Gemeinschaft emittierte Fluoreszenzsignal mittels Fluoreszenz, Mikroskopie und Durchflusszytometrie zu detektieren.

Letztendlich zeigen die Ergebnisse, wie sich Zellen darauf spezialisierten, zu produzieren und zu sezernieren. Die extrazelluläre Matrix, aus der der Biofilm besteht, unterscheidet sich von den Zellen, die das Tensid sezernieren, das Signalmolekül, das für die Differenzierung der Subpopulation der Matrixproduzenten verantwortlich ist. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Quantifizierung der Transkriptionsexpression mit Vita Ities-Assays der Mikrostrahlenanalyse besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Genexpression auf Einzelzellebene zu überwachen und besonders kleine Zellpopulationen von Zellen zu visualisieren, die darauf spezialisiert sind, ein bestimmtes Gen zu exprimieren.

Diese Genexpressionen werden bei der Analyse der Gesamtpopulation nicht nachgewiesen. Integrative Plasmide werden zur Markierung von B-Feinstoffen verwendet, und hier wird ein Beispiel gezeigt. PTAA, der Promotor der Gene, die für die Produktion von Tass verantwortlich sind.

Ein Matrixprotein wird unter Verwendung der Restriktionsstellen ECO R eins und Hindi drei in den Vektor kloniert. Die Expression des CFP-Reportergens steht nun unter der Kontrolle von ptap A, um das Verfahren zur Markierung von B zu beginnen, subtile Linearisierung des integrativen Plasmids durch enzymatische Verdauung. Das empfohlene Restriktionsenzym ist XH oh eins, wenn das integrative Plasmid bereit ist, induzieren Sie die natürliche Kompetenz im subtilsten B-Stamm 1 68, indem Sie die Zellen fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem kompetenzinduzierenden Medium wachsen lassen.

Geben Sie das linearisierte Plasmid in die Kultur der kompetentesten B-Zellen und inkubieren Sie nach zwei Stunden zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, plattieren Sie die Zellen auf Agar mit Spect Mycin und inkubieren Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius. Das subtles-Chromosom B hat zwei neutrale Loci, Amy, E, E und LAC A, die zur Integration von Reporterfusionen verwendet werden können, ohne die Entwicklung des Biofilms zu beeinflussen. Das linearisierte Plasmid PKM 0 0 8 integriert sich durch doppelte Rekombination in das Genom von B-Feinstoffen.

Der nächste Schritt besteht darin, den Reporter vom markierten Stamm auf einen Stamm zu übertragen, der in der Lage ist, Biofilme zu bilden, indem das SPP-Ein-Phagen-Transduktionsprotokoll verwendet wird. Für die Zwecke dieses Videos werden nur die wichtigen Schritte im Protokoll gezeigt. Der Donorstamm 1 68 wird gezüchtet, wobei die Reporterfusion in TY-Medium bei 37 Grad Celsius untergebracht wird, bis die Kultur bei 200 Mikrolitern Zellen auf 100 Mikroliter verdünnten Phagenbestand in einem Glasröhrchen die frühe stationäre Phase erreicht.

Und lassen Sie uns 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius stehen. Als nächstes pipettieren Sie heißes TY-Soft-Agar in das Röhrchen und mischen es gründlich durch Vortexen. Vorsichtig auf eine frische TY-Platte verteilen und acht bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit Phagen-Halos entstehen können.

Um die Phagen-Halos zu sammeln, geben Sie drei Milliliter TY-Medium auf die Platte und verwenden Sie die Glaspipette, um den oberen Agar aufzubrechen. Übertragen Sie die Agar-Suspension in ein 15-Milliliter-Falkenröhrchen. Den Agar vorsichtig aufbrechen, und dann 15 Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren.

Den Überstand in ein neues Röhrchen umfüllen. Führen Sie den Überstand durch einen 22-Mikron-Spritzenvorsatzfilter. Verwenden Sie diesen Überstand, um eine Kultur des Empfängerstamms zu infizieren, die in TY-Medium gezüchtet wurde.

Geben Sie 30 Mikroliter Überstand zu 10 Millilitern Kultur, verdünnt eins zu 10, und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Danach zentrifugieren Sie sieben Minuten lang bei 5.000 U/min, reanimation suspendieren Sie das Pellet in 200 Mikrolitern TY-Medium und verteilen Sie es auf einer Platte mit SPECT-Mycin plus 10 Millimolar. Natriumcitrat.

Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 12 bis 36 Stunden. Wählen Sie eine Kolonie aus und züchten Sie sie über Nacht in flüssigem LB bei 37 Grad Celsius. Zum Schluss werden drei Mikroliter der Übernachtkultur auf festes Biofilm-induzierendes Medium aufgebracht.

Lassen Sie die Zellen 72 Stunden lang bei 30 Grad Celsius wachsen. Nach drei Tagen Wachstum entwickeln Biofilme, die sich auf der Oberfläche des Ms.GG Agars bilden, eine komplexe morphologische Architektur in der Oberfläche des Agars. Um diesen Vorgang zu beginnen, verwenden Sie einen Zahnstocher oder eine Pinzette, um den Biofilm von der Oberfläche des MSGG-Agars zu entfernen.

Die Konsistenz des Biofilms sollte es ermöglichen, ihn von der Oberfläche des Agars abzulösen. Legen Sie den Biofilm in einem Stück in drei Milliliter PBS-Puffer und dispergieren Sie den Biofilm mild. Führen Sie 12 Pulse mit einer Ausgabe von drei und einer Amplitude von 0,7 Sekunden durch, um die Proben vor der Einzelzellanalyse zu fixieren.

Resus suspendiert 300 Mikroliter der Zellsuspension in einem Milliliter, einer 4%igen Paraform-Aldehydlösung, und inkubiert genau sieben Minuten lang bei Raumtemperatur. Nach der siebenminütigen Fixierung die Zellen dreimal in PBS-Puffer waschen. Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellen vor der Fluoreszenzmikroskopie in 300 Mikrolitern PBS-Puffer.

Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie 200 Mikroliter 0,8 % Agros über den Objektträger pipettieren und ihn vorsichtig mit einem weiteren Objektträger abdecken. Entfernen Sie nach zwei Minuten die obere Rutsche vorsichtig, um eine Schicht Agros zu erhalten, die an der unteren Stelle an der Rutsche haftet. Zwei Mikroliter fixierte Zellen auf die Oberfläche der Agros-Schicht legen und mit einem Mikroskop-Deckglas abdecken.

Legen Sie die Probe auf den Tisch des Fluoreszenzmikroskops. Stellen Sie die Anregungsperiode gemäß einer Negativkontrolle ein, die unter den für das Experiment ausgewählten Bedingungen keine Fluoreszenz zeigt. Die Belichtungszeit sollte zwischen 50 und 200 Millisekunden liegen.

Erfassen Sie sowohl ein Fluoreszenzbild als auch ein Hellfeldbild für jedes Sichtfeld. Um die Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse vorzubereiten, dispergieren Sie die Probe der fixierten Zellen durch milde Beschallung. Führen Sie zwei Serien von 12 Impulsen mit einer Ausgabe von fünf und einer Amplitude von 0,7 Sekunden durch, um Klumpen in einzelne Zellen zu verteilen, ohne eine Zelllyse zu verursachen.

Bestätigen Sie die Effizienz der Zelldispersion durch Lichtmikroskopie. Verdünnen Sie anschließend die Probe um eins auf 100 in PBS-Puffer. Für diese Analyse der YFP-Fluoreszenz wird ein BD-Fax-Canto-Zwei-Durchflusszytometer verwendet.

Für die CFP-Fluoreszenz wird eine Laseranregung bei 488 Nanometern gekoppelt mit einem 5 30 30 Filter verwendet. Eine Laseranregung bei 405 Nanometern gekoppelt mit einem 4 0 8 40 Filter wird verwendet, um das Durchflusszytometer mit zwei Negativkontrollen zu kalibrieren. Eine Probe von PBS-Puffer ohne Zellen in Suspension sollte als Negativkontrolle für die Größe des vom Durchflusszytometer erfassten Partikels dienen.

Eine Probe ohne Fluoreszenzreporter sollte als Negativkontrolle für die Fluoreszenzempfindlichkeit der Strömung dienen. Zytometer Nach der Kalibrierung legen Sie die mit einem Fluoreszenzreporter markierte Probe für jede Probe in das Durchflusszytometer, analysieren Sie mindestens 50.000 Ereignisse mit einer Flussrate zwischen 303.000 Ereignissen pro Sekunde. Wenn B Subtles auf einer Platte des Biofilm-induzierenden Mediums wächst, wird nach dreitägiger Inkubation bei 30 Grad Celsius eine MSGG-Biofilmbildung beobachtet.

Der Biofilm zeigt eine komplexe morphologische Architektur, die auf die unterschiedlichen beteiligten Zellsubpopulationen hinweist. Zum Beispiel führt die Produktion der extrazellulären Matrix und der Biofilme zur Bildung von Falten auf der Oberfläche der Kolonie. Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für die Visualisierung der Zelldifferenzierung in einem einzelnen markierten Stamm mittels Fluoreszenzmikroskopie.

Dieser Stamm beherbergt den fluoreszierenden Reporter Ptap, ein CFP, das in der Subpopulation von matrixproduzierenden Zellen exprimiert wird, die blau gefärbt sind. Diese Subpopulation produziert und sezerniert die extrazelluläre Matrix, die den Biofilm bildet. Das nächste Bild ist das Ergebnis der Fluoreszenzmikroskopie der Visualisierung eines doppelt markierten Stammes, der den Reporter Ptap, A CFP und den zusätzlichen Reporter P Surfactin YFP beherbergt.

Dieser zweite Reporter ermöglicht die Überwachung der Subpopulation von Zellen, die für die Sekretion des Signalmoleküls Surfactin verantwortlich sind, das die Signalkaskade für die Differenzierung der Matrixproduzenten auslöst. Hier sind die Matrixproduzenten in Blau falschgefärbt, während die Tensidproduzenten in Gelb falsch gefärbt sind, die Ergebnisse der 2D-Durchflusszytometrie mit einem einzigen markierten Stamm, der den Reporter-ptap beherbergt. Hier wird ein YFB vorgestellt.

Der unbehandelte Kontrollstamm ohne fluoreszierende Proteingene zeigte eine einzelne Population mit niedrigen relativen Fluoreszenzzellen, die ptap beherbergten. Ein YFP unter nicht biofilminduzierenden Bedingungen differenzierte die Subpopulation der Matrixproduzenten nicht, und die gesamte Population zeigte auch eine niedrige relative Fluoreszenz. Im Gegensatz dazu wurde unter Biofilm-induzierenden Bedingungen eine Subpopulation von Zellen mit einer hohen relativen Fluoreszenz als Schulter rechts von der niedrigen relativen Fluoreszenz nachgewiesen.

Die Spitzenergebnisse der 3D-Durchflusszytometrie sind hier dargestellt. Die Fluoreszenzsignale der überwachten Kanäle werden in der X-Achse für YFP und in der Y-Achse für CFP dargestellt. Für CFP zeigt das obere linke Feld einen Stamm ohne fluoreszierende Proteingene als Kontrolle für die Hintergrundfluoreszenz. Im rechten oberen Bild wurde ein einzelner markierter Stamm verwendet, um die Subpopulation der Surfactinproduzenten im gelb umrandeten YFP-Fluoreszenzkanal zu detektieren.

Im unteren linken Bereich wurde ein anderer einfach markierter Stamm verwendet, um die Subpopulation der Matrixproduzenten zu erkennen. Im blau umrandeten CFP-Fluoreszenzkanal werden die Subpopulationen von Matrixproduzenten und Tensidproduzenten mit dem doppelt markierten Stamm überwacht und die Ergebnisse präsentiert. In diesem unteren rechten Bereich.

Es werden zwei Subpopulationen von Zellen nachgewiesen, die hohe Mengen an fluoreszierenden Reportern exprimieren. Jede Population ist eingerahmt, was zeigt, dass es keine Überlappung in der Expression der Reporter zwischen den beiden Subpopulationen spezialisierter Zellen gibt. Diese letzte Abbildung zeigt die Quantifizierung der Subpopulationen von Matrixproduzenten und Kannibalen mittels 3D-Durchflusszytometrie.

Im oberen rechten Feld wurde ein einzelner markierter Stamm verwendet, um die Subpopulation der Kannibalen zu erkennen. Im gelb umrandeten YFP-Fluoreszenzkanal wurde beschrieben, dass sich diese Subpopulation von Kannibalen koordiniert mit der Subpopulation der Matrixproduzenten differenziert. Im unteren linken Bereich wird die Subpopulation der Matrixproduzenten in einem anderen einzelnen markierten Stamm im CFP-Fluoreszenzkanal nachgewiesen.

Die Ergebnisse des doppelt markierten Stammes im unteren rechten Feld zeigten eine einzelne Subpopulation von fluoreszierenden Zellen, die sowohl YFP als auch grün umrahmte CFP exprimierten. Die gleichzeitige Expression der beiden Reporter deutet darauf hin, dass beide Zelldifferenzierungswege in derselben Subpopulation koordiniert aktiviert sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die unterschiedlichen Subpopulationen von Zellen, die einen mikrobiellen Biofilm bilden, mithilfe der Zellanalyse der Zellpopulation wie Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie visualisieren und quantifizieren können.