Die Überwachung der reduktiven und oxidativen Halbreaktionen eines Flavin-abhängige Monooxygenase mit Stopped-Flow Spektrophotometrie

Dieses Verfahren nutzt ein Stopped-Flow-Instrument, um die verschiedenen spektralen Formen von SID A zu detektieren und Geschwindigkeiten zu messen. Die von SID A katalysierte Reaktion kann in die reduktive und oxidative Halbreaktion des FAD unterteilt werden. Das oxidierte Flavin bindet an N-A-D-P-H und reagiert unter Bildung von reduziertem Flavin und NADP plus; die Reaktion mit molekularem Sauerstoff und die Bindung von Ornithin führen zur Bildung von C vier.

Ein Hydroxyflavin nach der Hydroxylierung von Ornithin dehydriert das Hydroxyflavin, wodurch das oxidierte Enzym entsteht. NA DP plus bleibt während des gesamten katalytischen Zyklus gebunden und ist das letzte Substrat, das freigesetzt wird. Das Stopped-Flow-Gerät ermöglicht eine schnelle Vermischung kleiner Reaktionsvolumina und zeichnet diese auf.

Die spektralen Änderungen über die Zeit, die mit einem schnellen Durchflussspektrophotometer gemessen werden, ermöglichen es, die Bildungs- und Zerfallsraten von transienten Zwischenstufen einer enzymkatalysierten Reaktion zu bestimmen. Zwei Mitglieder meines Labors, Rita Robinson und Enviro Romero, werden diese Experimente unter Verwendung der Aromastoff-Monooxygenase als Modellsystem demonstrieren. Geben Sie 250 Milliliter 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer in einen 500-Milliliter-Schüttelkolben, der einen Magnetrührer enthält.

Verschließen Sie den Kolben mit einem Gummistopfen, stellen Sie ihn auf ein Rührgerät und verbinden Sie das kurze Rohr des Kolbens mit einer Schlauchleitung. Entgasen Sie das Pufferlösung unter Vakuum eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rühren, anschließend spülen Sie mit Argon. Wiederholen Sie den Vorgang fünfmal.

Spülen Sie das Kolben schließlich 10 Sekunden lang mit Argon. Trennen Sie das Kolben vom Vakuumverteiler und stellen Sie es in die Handschuhbox. Fahren Sie fort, kräftig unter offener Kolbenstellung zu rühren.

Füllen Sie die Reservoir-Spritzen mit Glucose-Oxidase mit 18,13 Einheiten pro Milliliter und 100 Millimolar Glucose-Lösungen. Stellen Sie nun die Antriebsventile in die Ladeposition. Füllen Sie die Antriebsspritzen.

Drehen Sie als Nächstes das F-Ventil in die Antriebsposition. Klicken Sie in der Pro-Data-Steuerungssoftware auf „Stoppspritze leeren“ und drücken Sie dann das Puffermedium mit der Antriebsspritze F durch den Durchflusskreislauf, indem Sie den entsprechenden Antriebskolben manuell anheben. Fahren Sie anschließend mit den anderen drei Antriebsspritzen fort und equilibrieren Sie diese eine Stunde lang.

Füllen Sie nun die Reservoirspritzen erneut auf und wiederholen Sie das Spülen des gestoppten Flusssystems. Um einen mit Sauerstoff gesättigten Puffer herzustellen, sprudeln Sie die Lösung eine Stunde lang unter Rühren mit 100 % Sauerstoff durch.

Entfernen Sie dann die kurze Nadel aus dem Fläschchen und warten Sie 10 Sekunden. Danach entfernen Sie die lange Nadel und stellen das verschlossene Fläschchen in die Handschuhbox. Für die N-A-D-P-H-Lösung.

Stellen Sie ein 1,5-Milliliter-Einwegröhrchen, das ein Milligramm N-A-D-P-H enthält, in die Handschuhbox. Lösen Sie es in 300 Mikrolitern anaerobem, 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer bei pH 7,5 auf.

Entnehmen Sie 30 Mikroliter, um die NADPH-Konzentration zu bestimmen. Um nun den Sauerstoff aus dem Enzymstamm zu entfernen, überführen Sie die Lösung in ein 25-Milliliter-Fläschchen mit einem Rührfisch, einem Stopfen und einer Aluminiumkappe. Stellen Sie das Fläschchen auf Eis.

Verbinden Sie sich mit einer Schlenk-Leitung und entgasen Sie 20 Minuten lang unter Vakuum, gefolgt von einem Spülen mit Argon. Spülen Sie das Gefäß abschließend 10 Sekunden lang mit Argon und trennen Sie es von der Vakuumapparatur. Stellen Sie das Gefäß im Handschuhkasten auf Eis.

Wählen Sie im Fenster des Bedienfelds der Pro-Daten-Steuerungssoftware die Fotodiodenreihe, externe Auslösung und logarithmische Skala aus. Starten Sie außerdem die Pro-Daten-Anzeigesoftware und legen Sie das Verzeichnis für die Datenspeicherung fest.

Ersetzen Sie nun die Lösung in den Reservoir-Spritzen C und F durch anaeroben 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer mit pH 7,5. Schalten Sie die Ventile C und F in die Antriebsposition. Klicken Sie im Pro-Data-Steuerungssoftware auf „Stoppspritze entleeren“.

Danach drücken Sie den Puffer mithilfe der entsprechenden Antriebskolben manuell durch den Flusskreislauf, indem Sie diesen anheben. Wiederholen Sie die Spülung mit den Reservoir-Spritzen C und F noch dreimal. Um eine vollständige Entfernung der Glucose-Oxidase aus dem Flusskreislauf sicherzustellen, klicken Sie anschließend im Pro-Daten-Steuerungssoftware auf „Baseline“.

Ersetzen Sie die Lösung der Reservoir-Spritze F durch die Enzymlösung. Drehen Sie das F-Ventil in die Antriebsposition. Klicken Sie im Pro-Data-Steuerungssoftware auf „Stop-Spritze leeren“.

Drücken Sie die Enzymlösung aus der Antriebsspritze F manuell durch den Durchflusskreislauf, indem Sie den entsprechenden Antriebskolben anheben. Kehren Sie zur Pro-Daten-Steuerungssoftware zurück und stellen Sie die Erfassungszeit auf 60 Sekunden ein. Vergewissern Sie sich, dass beide Antriebsspritzen mit ihren jeweiligen Lösungen gefüllt sind und dass die Antriebskolben mit den Kolben der Antriebsspritzen in Kontakt stehen.

Schalten Sie beide Ventile in die Antriebsposition und klicken Sie in der Pro-Data-Steuerungssoftware auf „Erfassen“, um den Antrieb durchzuführen. Erfassen Sie die spektralen Daten der oxidierten Form des Enzyms im Dreifachansatz unter Verwendung des aus den Antrieben erhaltenen Werts bei 452 Nanometer. Bestimmen Sie die Enzymkonzentration vor dem Mischen und bereiten Sie vier Milliliter N-A-D-P-H-Lösung vor.

Füllen Sie die Füllreservoirspritze C mit einer um das 1,5-Fache konzentrierteren N-A-D-P-H-Lösung und entleeren und befüllen Sie die Stop-Spritze dreimal, wie zuvor gezeigt. Nehmen Sie nun Spektren während der Reduktion des Enzyms auf, spülen Sie den Inhalt aus dem Fließsystem mit anaerobem 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5. Klicken Sie nun im Pro-Daten-Steuerungssoftware auf „Baseline“.

Anschließend 200 µL Enzym-Stammlösung mit 1000 µL anaerobem, 100 mM Kaliumphosphatpuffer mischen, pH 7,5. Die Lösung der Reservoir-Spritze A durch die Enzymlösung ersetzen.

Schalten Sie das A-Ventil in der Pro-Data-Steuerungssoftware in die Antriebsposition. Klicken Sie auf „Spritze stoppen, leer“. Drücken Sie die Enzymlösung durch den Durchflusskreislauf, indem Sie den entsprechenden Antriebskolben manuell anheben.

Stellen Sie die Verzögerungszeit auf 0,5 Sekunden und die Erfassungszeit auf 60 Sekunden ein. Vergewissern Sie sich, dass alle Treiberspritzen mit den entsprechenden Lösungen gefüllt sind und die Treiberkolben mit den Kolben der Treiberspritzen in Kontakt stehen. Drehen Sie dann alle Treiberventile in die Antriebsposition und klicken Sie in der Pro-Data-Steuerungssoftware auf „Erfassen“.

Spektraldaten der oxidierten Form des Enzyms im Dreifachansatz gewinnen. Danach die Lösung der Reservoirspritze B durch eine N-A-D-P-H-Lösung ersetzen, die 1,5-fach stärker konzentriert ist als die Enzymlösung in Spritze A. Das Ventil B in die Antriebsposition schalten und die Stoppspritze dreimal wie zuvor im Steuerungsfenster gezeigt entleeren und erneut befüllen.

Stellen Sie die Verzögerungszeit auf 0,5 Sekunden ein. Führen Sie nach 20 Sekunden eine Akquisition durch und ersetzen Sie die Lösung der Reservoirspritze mit dem mit Sauerstoff angereicherten Puffer. Schalten Sie das C-Ventil in die Antriebsposition.

Spülen Sie dreimal in der Pro-Data-Steuerungssoftware. Stellen Sie die Verzögerungszeit auf 15 Sekunden und die Erfassungszeit auf 900 Sekunden ein. Setzen Sie die Spektrenaufnahme während der Reoxidation des vollständig reduzierten Enzyms im Stopped-Flow-Gerät fort.

Die anaerobe Reduktion von SID A mit NADPH kann durch Messung der Änderungen im Redoxzustand des Flavins unter Verwendung von Absorption bei 452 nm überwacht werden. Spektrale Änderungen werden über die Zeit von oxidiertem SID A bis zum Endspektrum vollständig reduzierten SID A aufgezeichnet. Die Geschwindigkeit dieses enzymatischen Schritts kann durch Anpassung der Daten an die geeignete Gleichung bestimmt werden. Die Oxidationsgeschwindigkeit und die Reaktionszwischenprodukte können ebenfalls mithilfe des Doppel-Mischmodus des Stopped-Flow in dieser Reaktion mit AF Sid A ermittelt werden. Das C4a-Hydroxyflavin-Zwischenprodukt wird eindeutig mit einem λmax von 380 Nanometern nachgewiesen, während das oxidierte Enzym ein λmax von 450 Nanometern aufweist.

Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung in vier bis sechs Stunden abgeschlossen werden. Denken Sie daran, sicherzustellen, dass die Lösungen anaerob sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man sowohl das relative als auch das ulzerative Ion von FLA unabhängig weiter stromabwärts in Experimenten wie der schnellen Chemie untersucht.

Quentin kann helfen, die traurige Natur der Zwischenprodukte zu erläutern.