Die Überwachung der reduktiven und oxidativen Halbreaktionen eines Flavin-abhängige Monooxygenase mit Stopped-Flow Spektrophotometrie

Bei diesem Verfahren wird ein Instrument mit gestoppter Strömung verwendet, um die verschiedenen spektralen Formen von SID A zu erfassen und die Raten zu messen. Die durch SID A katalysierte Reaktion kann in reduktive und oxidative Halbreaktionen von FAD unterteilt werden. Das oxidierte Flavin bindet an N-A-D-P-H und reagiert zu reduziertem Flavin und NADP sowie die Reaktion von molekularem Sauerstoff und Ornithin führt zur Bildung von C vier.

Ein Hydroxyflavin nach der Hydroxylierung von Ornithin, das Hydroxyflavin dehydriert und bildet das oxidierte Enzym. NA DP plus bleibt während des gesamten katalytischen Zyklus gebunden und ist das letzte Substrat, das freigesetzt wird. Das Stopp-Flow-Gerät ermöglicht das schnelle Mischen kleiner Mengen von Reaktanten und Aufzeichnungen.

Die spektralen Veränderungen im Laufe der Zeit Mit dem Stoffverlust-Spektrophotometer kann die Geschwindigkeit der Bildung und einer enzymkatalysierten Reaktion speziell von transienten Zwischenprodukten gemessen werden. Zwei Mitglieder meines Labors, Rita Robinson und Enviro Romero, werden diese Experimente mit Set A an der Flavor-Monooxygenase als Modellsystem demonstrieren. 250 Milliliter 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer werden in einen 500 Milliliter Buchnerkolben mit einem Rührstab gegeben.

Verschließen Sie den Kolben mit einem Gummistopfen, legen Sie ihn dann auf eine Rührplatte und verbinden Sie das kurze Rohr des Kolbens mit einer Sch-Flankenleitung. Der Puffer wird eine Stunde lang unter Vakuum bei Raumtemperatur unter Rühren entgast und anschließend mit Argonnen gespült. Fünfmal wiederholen.

Zum Schluss spülen Sie den Kolben 10 Sekunden lang mit Argonnen. Trennen Sie den Kolben vom Vakuumverteiler und legen Sie ihn in das Handschuhfach. Bei geöffnetem Kolben weiter kräftig umrühren.

Füllen Sie die Reservoirspritzen mit 18,13 Einheiten pro Milliliter Glukoseoxidase und 100 Millimolaren Glukoselösungen. Stellen Sie nun die Antriebsventile in die Laststellung. Füllen Sie die Antriebsspritzen.

Drehen Sie anschließend das F-Ventil in die Antriebsposition. Klicken Sie mit der Pro-Datensteuerungssoftware auf Stoppspritze leeren und schieben Sie dann den Puffer von der Antriebsspritze F durch den Durchflusskreislauf, indem Sie den entsprechenden Antriebszylinder manuell anheben. Fahren Sie mit den anderen drei Antriebsspritzen fort und äquilibrieren Sie eine Stunde lang.

Füllen Sie nun die Behälterspritzen wieder auf und wiederholen Sie das Spülen des gestoppten Durchflusssystems. Zur Herstellung von sauerstoffgesättigtem Puffer. Sprudeln Sie die Lösung eine Stunde lang unter Rühren mit 100% Sauerstoff.

Entfernen Sie dann die kurze Nadel aus der Durchstechflasche und warten Sie 10 Sekunden. Entfernen Sie die lange Nadel und legen Sie die geschlossene Durchstechflasche in das Handschuhfach. Für die N-A-D-P-H-Lösung.

Legen Sie ein 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen mit einem Milligramm N-A-D-P-H in das Handschuhfach. In 300 Mikrolitern anaerobem, 100 Millimolar Kaliumphosphatpuffer auflösen. pH-Wert 7,5.

Entnehmen Sie 30 Mikroliter, um die N-A-D-P-H-Konzentration zu bestimmen. Um nun Sauerstoff aus dem Enzymvorrat zu entfernen, geben Sie die Lösung in ein 25-Milliliter-Fläschchen, das einen Rührstabverschluss mit Weizen- und Stopfen und Aluminiumdichtung enthält. Auf Eis legen.

An eine Schlink-Leitung anschließen, dann 20 Minuten lang durch Vakuum entgasen, gefolgt von einer Spülung mit Argonnen. Spülen Sie das Fläschchen abschließend 10 Sekunden lang mit Argonnen und trennen Sie es vom Vakuumverteiler. Legen Sie das Fläschchen auf Eis in das Handschuhfach.

Im Fenster des Bedienfelds der Pro-Datensteuerungssoftware. Wählen Sie ein Fotodiodenarray, einen externen Trigger und eine logarithmische Skala. Starten Sie auch die Pro-Datenbetrachter-Software und definieren Sie das Verzeichnis für die Speicherung von Datendateien.

Ersetzen Sie nun die Lösung in den Reservoirspritzen C und F durch anaeroben 100 millimolaren Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5. Drehen Sie die Ventile C und F in die Antriebsstellung. Klicken Sie auf die Stoppspritze in der Pro Data Control Software leeren.

Schieben Sie dann den Puffer von beiden Antriebsspritzen durch den Durchflusskreislauf, indem Sie den entsprechenden Antriebsstößel manuell anheben. Wiederholen Sie das Spülen mit den Auffangspritzen C und F noch dreimal. Um eine vollständige Entfernung der Glukoseoxidase aus dem Durchflusskreislauf sicherzustellen, klicken Sie in der Pro Data Control Software auf die Baseline.

Ersetzen Sie die Lösung der Reservoirspritze F durch die Enzymlösung. Drehen Sie das F-Ventil in die Antriebsstellung. Klicken Sie auf die Stoppspritze in der Pro Data Control Software leeren.

Schieben Sie die Enzymlösung aus der Antriebsspritze F durch den Durchflusskreislauf, indem Sie den entsprechenden Antriebsstößel manuell anheben. Kehren Sie zur professionellen Datensteuerungssoftware zurück, um die Erfassungszeit auf 60 Sekunden einzustellen. Vergewissern Sie sich, dass beide Antriebsspritzen mit den entsprechenden Lösungen gefüllt sind und dass die Antriebsstößel mit der Antriebsspritze in Kontakt stehen. Kolben.

Drehen Sie beide Ventile in die Antriebsposition und klicken Sie in der Pro-Datensteuerungssoftware auf Erfassen, um den Antrieb durchzuführen. Spektraldaten der oxidierten Form des Enzyms werden in dreifacher Ausfertigung unter Verwendung des von den Antrieben erhaltenen Nanometerwerts A 4 52 erfasst. Bestimmen Sie die Enzymkonzentration vor dem Mischen und bereiten Sie vier Milliliter N-A-D-P-H-Lösung vor.

Füllen Sie die Reservoirspritze C mit der 1,5-fach konzentrierteren Spritze C mit der N-A-D-P-H-Lösung und entleeren und befüllen Sie die Stoppspritze dreimal wie zuvor gezeigt. Erfassen Sie nun Spektren während der Reduktion der Enzymspülinhalte aus dem Strömungskreislauf mit anaerobem 100 millimolaren Kaliumphosphatpuffer pH 7,5. Klicken Sie nun in der Pro-Datensteuerungssoftware auf Baseline.

Mischen Sie dann 200 Mikroliter Enzym-Stammlösung mit 1000 Mikrolitern anaerobem, 100 millimolar Kaliumphosphatpuffer. pH 7,5. Ersetzen Sie die Lösung der Reservoirspritze A durch die Enzymlösung.

Drehen Sie das A-Ventil in die Antriebsposition in der Pro Data Control Software. Klicken Sie auf die Stoppspritze leer. Schieben Sie die Enzymlösung aus der Antriebsspritze A durch den Durchflusskreislauf, indem Sie den entsprechenden Antriebsstößel manuell anheben.

Stellen Sie die Verzögerungszeit auf 0,5 Sekunden und die Erfassungszeit auf 60 Sekunden ein. Vergewissern Sie sich, dass alle Antriebsspritzen mit den entsprechenden Lösungen gefüllt sind und die Antriebszylinder mit den Kolben der Antriebsspritze in Kontakt stehen. Drehen Sie dann alle Antriebsventile in die Antriebsposition und klicken Sie in der pro data control software auf Erfassen.

Erhalten Sie spektrale Daten der oxidierten Form des Enzyms in dreifacher Ausfertigung. Ersetzen Sie anschließend die Lösung der Reservoirspritze B durch eine N-A-D-P-H-Lösung. 1,5-mal konzentrierter als die Enzymlösung in Spritze A.Drehen Sie das B-Ventil in die Antriebsstellung und entleeren und befüllen Sie die Stoppspritze dreimal, wie zuvor im Fenster des Bedienfelds gezeigt.

Stellen Sie die Verzögerungszeit auf 0,5 Sekunden ein. Eine Erfassung nach 20 Sekunden, ersetzen Sie die Lösung der Reservoirspritze Meer durch den sauerstoffhaltigen Puffer. Drehen Sie das C-Ventil in die Antriebsstellung.

Dreimal spülen in der Pro-Datensteuerungssoftware. Stellen Sie die Verzögerungszeit auf 15 Sekunden und die Erfassungszeit auf 900 Sekunden ein. Erfassen Sie weiterhin Spektren während der Reoxidation des vollständig reduzierten Enzyms im Instrument mit gestoppter Strömung.

Die anaerobe Reduktion von SID A mit N-A-D-P-H kann überwacht werden, indem hier Änderungen des Redoxzustands des Flavins mit einem Absorptionsmittel bei 452 gemessen werden. Spektrale Veränderungen werden im Laufe der Zeit von oxidiertem SID A bis zum letzten Spektrum von vollständig reduziertem SID A aufgezeichnet. Die Geschwindigkeit dieses enzymatischen Schritts kann bestimmt werden, indem die Daten an die entsprechende Gleichung angepasst werden. Die Oxidationsgeschwindigkeit und die Reaktionszwischenprodukte können auch unter Verwendung des Doppelmischmodus der gestoppten Strömung in dieser Reaktion durch AF Sid A bestimmt werden. Das C-Vier-A-Hydroxiflavin-Zwischenprodukt wird eindeutig mit einem Lambda max von drei 80 Nanometern nachgewiesen und das oxidierte Enzym hat ein Lambda max von 450 Nanometern.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in vier bis sechs Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Denken Sie daran, sicherzustellen, dass die Lösungen anaerob sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie sowohl das relative als auch das ulzerative Ion von FLA-unabhängigem Mono weiter unten im Experiment wie einer Schnellchemikalie untersuchen können.

Quentin kann helfen, die traurige Natur der Zwischenprodukte zu verdeutlichen.