Name: Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mittels Fluorescence Resonance Energy Transfer mit Polydiacetylen-Liposomen. Diese Methode ermöglicht sensitiven Biosensing.

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Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde durch die National Science Foundation, National Institute of Health (NIH), Materialwirtschaft Technology Center (MTC) und ORDA am SIUC vorgesehen. Wir danken NSF für ein Stipendium (CHE-0959568) für den Kauf eines FE-SEM. Wir möchten Prof. Matthew McCarroll für hilfreiche Diskussionen danken. Julia Reyes wird gerne COLCIENCIAS, kolumbianische Agentur und Universidad Pedagogica y Tecnologica de Colombia für ihre Stipendien und finanzieller Unterstützung danken.

A. Synthese und Charakterisierung von PDA Liposomen 4,5,6 Hinweis 1: Schützen Sie die PDA-Lösung von Licht mit Aluminiumfolie Verpackung auf jedem Behälter durch alle experimentellen Schritte. Anmerkung 2: Zwei verschiedene Sätze von Liposomenlösung (B und C) wurden folgende Verfahren A hergestellt (Synthese und Charakterisierung von Liposomen PDA). Ein. Synthese von N-Hydroxysuccinimid Diacteylene (NHS-PCDA) <ol><li> Liposomen herzustellen, wird ein wesentlicher Bestandteil PCDA-NHS erforderlich. Wir haben PCDA-NHS synthetisiert, indem folgende Vorgehensweise: </li><li> Hinzufügen 10,12-pentacosadiynoic Säure (PCDA) (0,267 g, 0,713 mmol), N-Hydroxysuccinimid (0,0914 g, 0,786 mmol) und 1 - (3 - (dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (0,144 g, 0,713 mmol ) in trockenem CH 2 Cl 2 (20 ml). </li><li> Man rührt die Lösung bei Raumtemperatur für 2 Stunden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Lösungsmittel durch rotary Verdampfer ergeben eine trockene Dünnfilm. </li><li> Verwenden Scheidetrichter, um den Rückstand mit Diethylether (25 ml) und Wasser (25 ml) dreimal extrahiert. </li><li> Die organische Schicht wird mit MgSO 4 (1,0 g) für eine halbe Stunde. Filtern und Entfernung des Lösungsmittels durch Rotationsverdampfung um einen weißen Feststoff Pulver (0,24 g,&gt; 90%) zu erhalten. </li><li> Analysieren endgültige Verbindung unter Nuclear Magnetic Resonance (NMR). </li><li> 1 H-NMR (300 MHz, DMSO), δ (ppm): 0,893 (t, 3H), 1,268 (m, 26H), 1,512 (m, 4H), 1,754 (m, 2H), 2.252 (t, 4H), 2,365 (m, 1H), 2,610 (m, 1H), 2,842 (s, 2H). </li></ol> 2. Liposomenpräparat 5,6,7 <ol><li> Aufzulösen PCDA: PCDA-NHS: 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) :: 8: 1: 1 in 20 ml Dichlormethan. </li><li> Filtern der Lösung mit einem Filterpapier, um Aggregate zu entfernen. </li><li> Man dampft das Lösungsmittel vollständig um einen dünnen Film von Monomeren zu ergeben. </li><li> Trocknen Sie die Dünnschicht Nacht unter vacuum. </li><li> Hydrat der Film mit entionisiertem Wasser (50 ml), um eine Liposomen-Lösung einer gewünschten Konzentration (0,65 bis 1 mM) zu machen. </li><li> Beschallen der erhaltenen Suspension mit einer Sonde Sonicator bei 76 ° C für ~ 18 min. </li><li> Ausweiten vorsichtig die Lösung durch ein Filterpapier, um die Lipid-Aggregate zu entfernen </li><li> Man kühlt die Lösung bei 4 ° C über Nacht zur Selbstorganisation der Monomere zu fördern. Die endgültige Lösung sollte optisch klar. </li><li> Polymerisieren die selbstorganisierte Diacetylen Monomere (Liposom) durch Bestrahlung mit 254 nm UV-Strahlung für ~ 2 min unter Verwendung eines Stiftes Ray UV-Quelle (4,5 mW / cm 2) in Luft. </li><li> Liposom Lösung war bei Raumtemperatur stabil für mindestens zwei Wochen. Die Lösung war stabil, wenn gekühlt. </li></ol> B. Herstellung von Rhodamin-markiertes Rinderserumalbumin (BSA-Rh) modifiziert PCDA Liposomen Ein. Die Bindung von BSA-Rh auf die Oberfläche von Liposomen <ol><li> Lösen BSA-Rh in PBS buffer (Ionenkonzentration betrug 0,01 M, pH 7,2), um die Endkonzentration von 1,2 pM von BSA-Rhodamin Lösung. </li><li> 2 ml (1,2 pM) von BSA-Rhodamin zu 10 ml Liposomenlösung in Schritt A.2. (Siehe oben) bei Raumtemperatur hergestellt. </li><li> Klassische Reaktion zur Bindung von Aminogruppen aus der Lysinrest von Proteinen an Carbonsäure durch NHS Gruppe aktiviert wurde befolgt (Reaktionsschema in Fig. 2). NHS-PCDA entwickelt wurde (Abbildung 2, Stufe 1) für kovalent bindendes Protein-Moleküle mit Liposomen mit NHS-Amin-Reaktionen (Abb. 2, Schritt 2). NHS ist ein ausgezeichnetes Mittel, das Verlassen des Amin-Carbonsäure-Reaktion in der Vorwärtsrichtung antreibt. Die Ausbeute dieser Reaktion unter geeigneten Bedingungen müssen quantitativ sein. </li><li> Entfernung von freiem BSA-Rh: Tränken Sie ein Spectra / Por Biotech Cellulose Ester (CE)-Membran (MW C O: 100.000) in entionisiertem wasser für 15 min. Diese Membran wird zur Dialyse verwendet umgesetztes BSA-Rhodamin (Molekulargewicht ~ 66.000 Da) in entionisiertem Wasser. </li><li> Transferieren es vorsichtig in die Lösung in der Dialysemembran. </li><li> Wechseln Sie das Wasser bei 2 h, 8 h, 14 h, 24 h und 36 h während der Dialyse. </li><li> Sammeln Sie die endgültige Lösung in einer Durchstechflasche mit Aluminiumfolie abgedeckt. </li></ol> C. Herstellung von SR-diamin und Biotin-markierte Liposomen Ein. Anstelle der Verwendung von DMPC im Schritt 2.1, verwenden wir Biotin-markierten-(1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Biotinyl) (Biotin-DOPE). <ol><li> Befolgen Sie alle Schritte durch 2,2 bis 2,9. </li><li> Anstelle von BSA-Rh in Schritt B, verwenden Diamin tagged Sulforhodamin (SR-Diamin). </li><li> Befolgen Sie alle weiteren Schritte in B. </li><li> Die Liposomen in dieser Zubereitung enthaltene Biotin und auf ihren Oberflächen SR-diamin. Nachfolgende Schritte waren ähnlich zu A und B (siehe oben) mit einer Ausnahme: Streptavidin wurde der Lö hinzugefügtan Biotin-Streptavidin Wechselwirkung durch Veränderungen in der zu untersuchen FRET Effizienz. </li></ol> D. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Titel Figure" src="/files/ftp_upload/3805/3805figtitle.jpg" /> Titel Figure. Ein Cartoon Erläuterung der Reaktion und FRET auftretenden der Liposomenoberfläche (hergestellt durch folgenden Schritt B). A. Überwachung von Protein Bindung an Liposomen mittels FRET 1 Überwachung von FRET zwischen Rhodamin und PDA Liposomen in Schritt B. hergestellten Anregungs-und Emissionsspektren von BSA-Rh und Absorptionsspektrum PDA getroffen werden (Abbildung 3A). Man kann klar erkennen, dass das Emissionsspektrum des BSA-Rh überlappt mit dem Absorptionsspektrum des PDA. Dies erfüllt die Resonanz Voraussetzung für die FRET-Mechanismus. BSA-Rhodamin markierten Liposomen vor und nach der Polymerisation wurde mit UV-V analysiertist und Fluoreszenzspektroskopie. Für das isolierte Donor und Akzeptor, FRET der Wirkungsgrad stark von Donor-Akzeptor-Distanz (r) und J 1 (j-Wert). Das Abschrecken der Emission beobachtet (Abbildung 3B) wegen FRET zwischen Rhodamin und PDA durch das Auftreten von elektronischen Absorptionsspektrum blauen PDA nach Photopolymerisation. In unserem Fall, FRET-Effizienz ist Null für unpolymerisierten Liposomen und Rhodamin weil J = 0 für unpolymerisierten Liposomen im sichtbaren Bereich. Wir führten ähnlichen Versuchen mit nur PDA Liposomen, die nicht enthielt NHS auf ihrer Oberfläche. In diesen Fällen wurde BSA-Rh nicht an die Oberfläche der Liposomen markiert. In diesem Fall betrug der durchschnittliche Abstand zwischen Rhodamin und PDA (r durchschnittlich) viel größer als Förster-Radius (R 0 = 2,8 nm). So haben wir nicht beobachten einen starken Rückgang der Fluoreszenzintensität. Diese Beobachtung einlso schlägt vor, dass die Fluoreszenzlöschung dominant ist, wenn r &lt;2,8 nm. J und R 0-Werte wurden anhand folgender Formeln: [1] J (λ) = ∫ F D (λ) ε A (λ) λ 4 dλ R 0 = 0,211 [k 2 n -4 J Q D (λ)] 1/6 Der Extinktionskoeffizient (ε) aus blau-PDA ist in dem Bereich von ~ 2.000 bis 10.000 M -1 cm -1 vor der Zugabe von Streptavidin. Der Extinktionskoeffizient von blau-PDA ist abhängig von der Photopolymerisation Zustand. [2] Zum Beispiel wird ε-Werte größer sein für eine Lösung, die eine längere Zeit polymerisiert wurde. Ferner kann die Selbstorganisation der Diacetylen Monomere beeinflussen auch die ε-Werte. Die J calculations berücksichtigen diese Veränderungen, und sie spiegeln Veränderungen in den PDA Extinktionskoeffizienten durch Biotin-Streptavidin molekularen Wechselwirkungen. J-Werte sind berechnet anhand der experimentellen PDA Absorption und SR-101 Emissionsdaten. Die Veränderungen in den J-Werte sind auf im elektronischen Absorptionsspektrum PDA nach Zugabe von Streptavidin zu der Lösung (4C) zu verlagern. Die Einheit von J Werten M -1 cm -1 nm 4. B. Überwachung von FRET mit Zugabe von Streptavidin an die Biotin-markierte Liposomenlösung Hinweis 1: Überwachung von FRET zwischen Rhodamin und PDA Liposomen in Schritt C oben hergestellt. Anregungs-und Emissionsspektren des Sulforhodamin-tagged diamine (SR-diamin) und Absorptionsspektrum PDA getroffen werden (4A). Unpolymerisierten und polymerisierten Biotin markiert Liposomen wurden mittels UV-Visund Fluoreszenzspektroskopie. Die Emission von Rhodamin (SR-101) wird um ca. 45% nach der Polymerisation (4B) hindeutet Fluoreszenzlöschung durch FRET verringert. Fügen Sie 40 ul Aliquots (1 pM) von Streptavidin Lösung zu 2 ml des Liposom-Lösung. Mit der Zugabe von Streptavidin zu der Lösung wird Veränderungen in J-Wert beobachtet (4C). Wie Biotin an Streptavidin bindet, der blaue Peakintensität PDA Liposom (zentriert bei ~ 645 nm in 1) wurde während einer Erhöhung der Absorptionspeaks bei 540 nm vermindert wird beobachtet (A BBILDUNG 1S). 4D zeigt Änderungen in der FRET Wirkungsgrad. Die FRET-Effizienz mit der Zunahme der Streptavidin Konzentration sank steht auch im Einklang mit unserer Vorhersage. Notieren Sie sich die SR-Emission nach jeder 40 ul Aliquot Zugabe von Streptavidin. Wir beobachteten eine stetige Zunahme der Rhodamin-Emission nach der Zugabe von StreptAvidin (Abb. 5). Diese Erhöhung der Rhodamin-Emission ist aufgrund einer Abnahme in der J-Wert für die Sulforhodamin Emissionsspektrum und PDA Absorptionsspektrums nach Biotin-Streptavidin-Wechselwirkungen. Auf molekularer Ebene werden die Biotin-Streptavidin-Wechselwirkung, um feine Änderungen in der effektiven Länge der Konjugation PDA was zu einer Abnahme in der blau-PDA Form zu einer thermodynamisch stabilen Form der roten PDA 2 zur Folge hat. Dies ist die Grundlage der Veränderungen des J-Werte. Interessanterweise kann die feinen Unterschiede in den molekularen Wechselwirkungen kovalent oder nicht-kovalent gebundenen Biotin PDA Liposomen sondiert werden mit unseren Messen Assay 4. Wir haben auch Kontrollexperimente durchgeführt und überwacht haben die Emission der Kontrollproben unter denselben experimentellen Bedingungen wie die für Streptavidin-Biotin-System. Die Kontrollversuche bestehen aus: (1) liposomaler Lösungen, enthalten Biotin auf ihrerOberfläche wurden Pufferlösung von gleichem Volumen und Konzentration zugesetzt, und (2) Liposom-Lösung ohne Biotin-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche Streptavidin wurden von gleichem Volumen und Konzentration zugesetzt. Die Intensität des Biotin-markierten Liposomen Lösung nach der Zugabe von Streptavidin zeigten erhöhte Intensität, aber die Intensität der Liposomenlösung der Kontrollversuche (zum Beispiel, siehe Abbildung 2B), auf der anderen Seite zeigte eine im Emissionsintensität vermindert. Dies wird Verdünnung der Lösung zugeschrieben. Diese Experimente zeigten deutlich, dass das verstärkte Emission der Lösung aufgrund der spezifischen molekularen Wechselwirkungen war. Förster-Radius (R 0) für Rhodamin und PDA Paar berechnet (Gleichung 2) auf ~ 2,80 nm betragen. Dies bedeutet, dass für isolierte PDA-Rhodamin Paaren, 50% der angeregten Zustand Rhodaminmoleküle ihre Energie übertragen PDA haben, wenn r 2,80 nm beträgt. Wir obs<html> erved dass, wenn Biotin kovalent an das Rückgrat gebunden PDA, die Emission Anstieg 2-3 mal größer als die von nicht-kovalent gebundenem Biotin an Liposomen betrug. 4 Diese Ergebnisse legen nahe, dass unsere vorgeschlagenen Systems empfindlich auf kleine Unterschiede in der Interaktion zu unterscheiden am Wandler (Linker zwischen Biotin und Liposom-Doppelschicht) aufgrund kovalent und nicht-kovalent gebundene Rezeptoren, die an Liposomen. Abhängig von den Scan-und Datenerfassungsfunktionen des Spektrophotometers, die Echtzeit-Überwachung (in Millisekunden bis Sekunden Zeitskala) von Protein-Interaktionen (im UV-VIS-Spektroskopie) sind mit diesem Sensorsystem möglich. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig1.jpg" /> Abbildung 1. Absorptionsspektren der blauen und roten PDA-Lösungen. (Inset) optische Aufnahmen mit einer Digitalkamera aufgenommen wurden. g &quot;/&gt; Abbildung 2. Reaktionsschema für die PCDA-NHS-Synthese (Schritt 1). Reaktion von PCDA-NHS an den Aminsubstituenten von Proteinen (Schritt 2). Schritt 2 ist die Basis der Bindung Lysinrest von Proteinen an der Carbonsäure PCDA Monomer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3805/3805fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img alt="3A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3A.jpg" /> 3A. Beobachteten Veränderung der FRET Wirkungsgrad ist durch die Änderungen im Absorptionsspektrum des PDA. Vor der Polymerisation es keine Überlappung zwischen BSA-Rh-Emission und Absorption PDA aber nach der Polymerisation PDA Absorption überlappt mit BSA-Rh Emission, die die Anforderung für FRET ist. Rhodamin ein Donor (rot) und polymerisierten PDA Liposomen wirken als Akzeptor (blau). <img alt="3B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig3B.jpg" /> Abbildung3B. Fluoreszenzspektren von BSA-Rh tagged Liposomen vor (blau) und nach PCDA Polymerisation (rot). Eine große Abnahme in der Rhodamin-Emission wurde beobachtet aufgrund zwischen Rhodamin und PDA FRET. <img alt="4A" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4A.jpg" /> .. 4A Spektrale Überlappung (J) Änderung für PDA (blau oder rot) und Sulforhodamin Absorptionsspektrum Emissionsspektrum (orange) 4A ist das repräsentative Spektrum für extremen Zustand, das heißt, wenn ein Überschuss an Streptavidin zu der Lösung gegeben wurde. 4A zeigt einen nahezu vollständigen Blau-nach-Rot PDA Transformation nach der Zugabe eines Überschusses an Streptavidin. Es ist deutlich erkennbar, dass J (spektrale Überlappung) mit blau-Verschiebung des PDA Absorptionsspektrum erhöht <img alt="4B" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4B.jpg" /> 4B. Fluoreszenz-Spektren vor (blau) und nach (red) Liposom Polymerisation. <img alt="4C" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4C.jpg" /> 4C Zustand für FRET:. J Änderung zwischen Donor (Sulforhodamin) und Akzeptor (PDA) mit dem Streptavidin zusätzlich zur Liposomenlösung. <img alt="4D" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig4D.jpg" /> Figur 4D. FRET Effizienz Änderung zwischen der Donor (Sulforhodamin) und Akzeptor (PDA) mit dem Streptavidin zusätzlich zur Liposomenlösung. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3805/3805fig5.jpg" /> Abbildung 5. Rhodamin Emissionsspektrum nach der Zugabe von Streptavidin-Aliquots auf den PDA Liposomenlösung. Inset zeigt eine vergrößerte Ansicht der Emission Veränderungen in der SR-101 Spektren.

<ol><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , 3rd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers. (1999).</li>
<li>Charych, D. H., Nagy, J. O., Spevak, W., Bednarski, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Colorimetric+Detection+of+a+Receptor-Ligand+Interaction+by+a+Polymerized+Bilayer+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct Colorimetric Detection of a Receptor-Ligand Interaction by a Polymerized Bilayer Assembly.</a> Science. 261, 585-588 (1993).</li>
<li>Yoon, B., Lee, S., Kim, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Conceptual+and+Technological+Advances+in+Polydiacetylene-based+Supramolecular+Chemosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Recent Conceptual and Technological Advances in Polydiacetylene-based Supramolecular Chemosensors.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 1958-1968 (2009).</li>
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<li>Li, X., McCarroll, M., Kohli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+Fluorescence+Resonance+Energy+Transfer+in+Conjugated+Liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Modulating Fluorescence Resonance Energy Transfer in Conjugated Liposomes.</a> Langmuir. 22, (2006).</li>
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<li>Yarimaga, O., Im, M., Choi, Y. -K., Kim, T. W., Jung, Y. K., Park, H. G., Lee, S., Kim, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Color+Display+System+Based+on+Thermochromic+Conjugated+Polydiacetylene%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Research%22%5BJournal%5D)">A Color Display System Based on Thermochromic Conjugated Polydiacetylene.</a> Macromolecular Research. 18, 404-407 (2010).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine selektive Bindung der Lysinrest von Protein auf Liposomenoberfläche unter Verwendung NHS-Amin-Umsetzungsprodukte. Diese FRET basierten Methode ist dazu in der Lage Echtzeit-Überwachung von Biotin-Streptavidin-Bindung und Protein (BSA) Bindung an der Oberfläche der Liposomen. Ähnliches Verfahren angewendet werden, um die Bindungseigenschaften Dynamik der verschiedenen Protein-Wechselwirkungen mit ihrer selektiven Rezeptoren zu untersuchen. Es gibt Flexibilität bei der Auswahl Fluorophore, die Änderungen in...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen Reagenz </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 10,12-pentacosadiynoic Säure (PCDA) </td><td> GFS Chemikalien </td><td> 3261 </td><td> Lichtempfindlich </td></tr><tr><td> N-Hydroxysuccinimid (NHS) </td><td> Acros Organics </td><td> 157270250 </td><td> Feuchtigkeitsempfindlich </td></tr><tr><td> 1 - (3 - (dimethylamino) propyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC) </td><td> Chem-Impex International </td><td> 00050 </td><td></td></tr><tr><td> 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 850345P </td><td></td></tr><tr><td> Rhodamin-markierte Bovine Serum Albumin (BSA-Rh) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A4537 </td><td></td></tr><tr><td> (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Biotinyl) (Biotin-DOPE) </td><td> Avanti Polar Lipids </td><td> 870282 </td><td></td></tr></tbody></table>

echtzeit-Überwachung von ligand-rezeptor-wechselwirkungen mit fluorescence resonance energy transfer

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET ist ein Prozess, bei dem Energie ist nicht strahlend von einem angeregten Donor-Molekül zu einem Grundzustand Akzeptor Molekül übertragen über weitreichende Dipol-Dipol-Wechselwirkungen ein. Im vorliegenden Abfühlen Assay, verwenden wir eine interessante Eigenschaft der PDA: Blauverschiebung im UV-Vis elektronischen Absorptionsspektrum PDA (Abbildung 1), nachdem ein Analyt wechselwirkt mit Rezeptoren an PDA 2,3,4,7. Diese Verschiebung in der PDA-Absorptionsspektrum liefert Änderungen der spektralen Überlappung (J) zwischen PDA (Akzeptor) und Rhodamin (Donor), die auf Änderungen in der FRET-Wirkungsgrad führt. Somit werden die Wechselwirkungen zwischen Analyt (Ligand) und Rezeptoren durch FRET zwischen Donor-Fluorophore und PDA detektiert. Insbesondere zeigen wir, das Erfassen eines Modells Proteinmolekül Streptavidin. Darüber hinaus zeigt die kovalente Bindung von-Rinderserumalbumin (BSA) an der Oberfläche der Liposomen mit Mechanismus FRET. Diese Wechselwirkungen zwischen ter Doppelschicht Liposomen und Proteinmoleküle können in Echtzeit erfasst werden kann. Das vorgeschlagene Verfahren ist ein allgemeines Verfahren zum Erfassen kleinen chemischen und biochemischen großen Molekülen. Da Fluoreszenz ist intrinsisch empfindlicher als Farbmessung, kann die Nachweisgrenze des Assays in sub-nanomolaren Bereich oder unteren 8 sein. Weitere, PDA als universelle Akzeptor in FRET zu handeln, was bedeutet, dass mehrere Sensoren mit PDA (Akzeptor) mit Gebern und verschiedene Rezeptoren auf der Oberfläche der PDA Liposomen befestigt funktionalisiert entwickelt werden können.

Wir demonstrieren FRET zwischen konjugiertes Polymer Polydiacetylen (PDA) und Fluorophor auf die Oberfläche des PDA Liposomen für die Erfassung von Biomolekülen gebunden. PDA Liposomen auch Rezeptormoleküle auf ihren Oberflächen für Biomoleküle als Sonden verwendet werden enthalten. Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen auf Änderungen des FRET-Effizienz zwischen dem Fluorophor und PDA, welche die Grundlage des Fühlmechanismus ist zu führen.

Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET ist ein Prozess, bei dem Energie strahlungsfrei von einem angeregten Donormolekül auf ein Akzeptormolekül im Grundzustand über weitreichende ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer zu überwachen. Die hier vorgestellte Methode nutzt eine interessante Eigenschaft der PDA-BLUESHIFT im UV/Vis-Elektronenabsorptionsspektrum von PDA. Nachdem ein Analyt mit an PDA gebundenen Rezeptoren interagiert hat, wird zunächst Polymer D-Acetylen oder PDA synthetisiert, und anschließend werden PDA-Liposomen hergestellt.Dann wird das mit R-Domäne markierte BSA an die PDA-Liposomenoberfläche gebunden. Wenn anschließend der Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer gemessen wird, überlappt das Emissionsspektrum des an Liposomen gebundenen BSA-R-Domäne mit dem Absorptionsspektrum von PDA.Dies erfüllt die Resonanzbedingung für den FRET-Mechanismus. Somit können Daten gewonnen werden, die auf Wechselwirkungen zwischen Liganden und Rezeptoren hinweisen. Der Hauptvorteil dieser Methode gegenüber bestehenden Verfahren wie ELISA ist, dass sie sehr einfach und kostengünstig ist.Da die Fluoreszenz von Natur aus empfindlicher ist als die Kalorimetrie, können wir die Nachweisgrenze bei sehr niedrigen subnanomolaren oder noch geringeren Konzentrationen errei

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Forschung

JoVE Journal

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Biologie

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Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

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Oberflächenplasmonresonanz (SPR) ist eine markierungsfreie Verfahren zur Detektion biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit. Hierin wird ein Protokoll für ein Membranprotein: Rezeptor-Interaktion Experiment beschrieben, bei der Diskussion der Vor- und Nachteile der Technik.

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Der Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) zwischen zwei Fluorophor-Molekülen kann zur Untersuchung von Proteininteraktionen in der lebenden Zelle verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Verfügung gestellt, wie FRET in lebenden Zellen gemessen werden kann, indem die sensibilisierte Emission des Akzeptors und das Abschrecken des Donormoleküls mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie detektiert werden.

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Die Studie beschreibt die Methodik der FRET-Kartierung, einschließlich der Auswahl der Markierungsstellen, der Auswahl der Farbstoffe, der Erfassung und der Datenanalyse. Diese Methodik ist effektiv bei der Bestimmung von Bindungsstellen, Konformationsänderungen und dynamischen Bewegungen in Proteinsystemen und ist am nützlichsten, wenn sie in Verbindung mit vorhandenen 3D-Strukturinformationen durchgeführt wird.

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: Eine neue Methodik zur Aufklärung globaler Strukturmerkmale

Dieses Protokoll beschreibt einen BRET-basierten Assay zur Messung der Wechselwirkungen der CRAF-Kinase mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen. Das Protokoll beschreibt die Schritte zur Vorbereitung der Zellen, zum Ablesen der BRET-Emissionen und zur Datenanalyse. Ein Beispielergebnis mit der Identifizierung geeigneter Kontrollen und der Fehlerbehebung für die Assay-Optimierung wird ebenfalls vorgestellt.

Biolumineszenz-Resonanz-Energietransfer (BRET)-basierter Assay zur Messung der Wechselwirkungen von CRAF mit 14-3-3-Proteinen in lebenden Zellen

Die Elektrophysiologie ist der Goldstandard für die Untersuchung der Aktivität von Ionenkanälen. Es gibt jedoch viele alternative Ansätze, einschließlich optischer Methoden. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Überwachung der Aktivität des leucinreichen Repeats mit 8 Kanälen (LRRC8)-gebildeten Anionenkanälen unter Verwendung einer auf Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basierenden Methode zwischen den Untereinheiten.

Überwachung der Leucin-reichen Repeat-haltigen 8-Kanal-Aktivität (LRRC8/VRAC) mittels sensibilisiertem Emissions-Förster-Resonanz-Energietransfer (SE-FRET)

Dieser Artikel bietet eine detaillierte Beschreibung, wie Proben für die Tracking von Einzelproteinen in festgestützten Lipiddoppelschichten erstellt werden können. Es erklärt außerdem ein einfaches Fluoreszenzmikroskop mit Einzelmolekülempfindlichkeit und hoher Bildrate. Abschließend skizzieren wir das Verfahren zur Extraktion von Einzelprotein-Trajektorien.

Verfolgung einzelner Proteine in Lipid-Doppelschichten mittels Fluoreszenzmikroskopie

Erfahren Sie die Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mittels Fluorescence Resonance Energy Transfer mit Polydiacetylen-Liposomen. Diese Methode ermöglicht sensitiven Biosensing.

Echtzeit-Überwachung von Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen mit Fluorescence Resonance Energy Transfer

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