Name: Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Lernen Sie die Isolation primärer Mikroglia aus neonatalem Rattenhirngewebe durch mechanische Dissoziation und Schüttelkultur. Diese Methode liefert hochreine Zellen für in-vitro-Studien zur Neuroinflammation.

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Gefördert durch das Programm an der intramuralen Uniformed Services University.

1. Dissection of Neonatal Rattenhirngewebe <ol><li> Frost Leibovitz L-15 konditionierten Medien (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) auf 4 ° C Warm Kulturmedium (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin) auf 37 ° C Bereiten Sie vier Petrischalen 60x15 mm mit 4-5 ml der konditionierten L-15 Medien auf dem Eis. Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente mit 100% Ethanol. </li><li> Spülen Sie die P2 neugeborenen Welpen Rap mit 70% Ethanol. (Neonatal Rattenjungen zwischen P1-P5 Jahren können in diesem Protokoll verwendet werden.) </li><li> Schnell enthaupten ein Jungtier mit einer sterilen scharfen Schere und legen Sie den Kopf sofort in 70% Ethanol. Wiederholen Sie dies für insgesamt 5 Rattenjungen dann übertragen Köpfe in Kochsalzlösung. </li><li> Entfernen Sie die ganze Gehirne aus den Köpfen und Ort in eine Petrischale mit 4 - 5 ml L-15-Lösung (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) auf Eis. </li><li> Wiederholen Sie die Prozeduren von 1,2 bis 1,4 für die restlichen Welpen im Wurf. </li><li> Entfernen Sie die Meningen des Gehirns und übertragen die desIRED Hirngewebe (dh Kortex, Kleinhirn ganze Gehirn, etc.) in eine neue Petrischale mit 5.4 ml L-15-Lösung (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) auf Eis. </li></ol> 2. Herstellung von gemischten Zellpopulation <ol><li> Ohne schädliche Hirngewebe mit einer Schere oder einem Messer, übertragen das Gewebe mit einer 10 ml Pipette in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifuge bei 2500 RCF konischen für 5 min bei 4 ° C </li><li> Absaugen des Überstandes. Fügen Sie 4-5 ml frischem L-15-Medien (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep). </li><li> Pipette Gewebe nach oben und unten 10 Mal mit einem sterilen 10 ml Pipette. </li><li> Legen Sie eine Zelle Sieb (100 um Poren) auf ein frisches 50 ml konischen Röhrchen. Pipette Gewebe nach oben und unten einmal mit einer sterilen 5 ml Pipette und mit der Pipette bündig mit der Zelle Sieb, verzichtet das Material durch die Zelle Sieb in das konische Röhre. </li><li> Spülen Sie die Zelle Sieb mit 4-5 ml frischem L-15-Medien (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep). </li><li> Zentrifugieren konisch mit gespannten Zellen bei 2.500 RCF für 5 min bei 4 ° C </li></ol> 3. Plating und Wartung von Mixed Gliazelle Kulturen <ol><li> Für jedes Jungtier Gehirn verarbeitet werden, bereiten 1 sterile T-75-Kolben durch Zugabe von 12 ml Kulturmedium (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin) in jeden Kolben. </li><li> Den Überstand von den pelletierten Zellen und fügen 5-6 ml Kulturmedium zu dem Zellpellet. Und Abpipettieren 10 Mal mit einer 10 ml Pipette. </li><li> Übertragen Sie ein gleiches Volumen an Zellsuspension zu jedem T-75-Kolben. </li><li> Inkubieren Flaschen in einem 5% CO 2-Inkubator bei 37 ° C für insgesamt 1-3 Wochen. </li><li> Flaschen sollten zunächst für 5 Tage bebrütet werden, und am fünften Tag, ersetzen Sie die Kulturmedien in jeder Flasche mit 12 ml frisches Medium und zurück in den Inkubator. Dann, alle 3 Tage, ersetzen Sie die konditionierten Medien in jeder Flasche mit 12 ml frisches Medium bis zur Konfluenz zu erreichen. Diese werden muss tunne sehr sorgfältig ohne den Boden berührt der Kolben in dem die Zellen anhaften. </li></ol> 4. Isolierung und Beschichtung von primären Mikroglia <ol><li> Nach gemischten Glia-Kulturen vollständig konfluent sind, entfernen Flaschen aus dem Inkubator und decken Kolben Kappen mit Parafilm den Gasaustausch mit der Umgebungsluft zu verhindern. </li><li> Schüttelkolben bei 100 rps (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) für 1 Stunde bei 37 ° C </li><li> Sammeln Medien aus allen Kolben mit einer 10 ml Pipette, ohne dass der Astrozyten Schicht auf der Kolbenoberfläche. Legen Sie die Medien in 50 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie frisches Medium zu den Kolben und Flaschen zurück in den Inkubator. </li><li> Zentrifuge konische Röhrchen bei 2500 RCF für 5 min bei 4 ° C </li><li> Absaugen des Überstandes aus allen konischen Röhrchen. Die Zellpellets sind hochreine Mikroglia-Zellen. Resuspendieren Pellets in 1 ml der Mikroglia Plattierung (DMEM + 10% FES + 1% Penicillin / Streptomycin). </li><li> Zählen Sie die Zelldichte in den Medien mit resuspendierteneinem Hämocytometer. </li><li> Setzen Sie einen passenden Volumen von Mikroglia Plattierungsmedien um ein 2 x 10e5 Zellen pro ml Dichte zu erreichen. Platte als geeignet für experimentelle Analyse. </li><li> Erlauben Sie Mikroglia über Nacht zu befestigen. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Die oben beschriebenen Protokoll Ergebnisse in hoher Reinheit primären Kulturen Mikroglia. Durch immunhistochemische für einen Makrophagen / Mikroglia-Zell-spezifische Marker (Iba1) bestimmt, sind vernickelt Mikroglia Kulturen&gt; 90% (Abbildung 2). Zusätzlich, Anfärbung von Astrozyten, Oligodendrozyten und Neuronen-spezifische Marker Zelle zeigt minimale Kontamination (Abbildung 2). Nach der Gründung gemischten Glia-Zellkulturen, können Mikroglia durch Schütteln bis zu 4 aufeinander folgenden Zeitpunkten isoliert werden. Der anfängliche Isolation Mikroglia wird nachgeben etwa 2,2 x 106 Zellen / ml oder etwa 9 Millionen Zellen pro 10 Flaschen und dem erwarteten Ertrag verringert sich mit jedem weiteren shake. Mikrogliazellen mit dieser Methode isoliert wurden erfolgreich zur Phagozytose Fähigkeit, Funktion wie die Produktion von Stickoxid, und neuronale Toxizität (Abbildung 3) 13 bis 14 untersuchen verwendet. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> 1. Übersicht des Protokolls zur Herstellung von gemischten Kulturen Gliazellen und Isolierung der primären Mikroglia. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> Abbildung 2. Isolierung von hochreiner Mikroglia als durch immunhistochemische Analyse unter Verwendung von Mikroglia (Iba-1, rot), Astrozyten (GFAP, grün), Neuron (NeuN, rot) und Oligodendrozyten nachgewiesen (CC1, rot) spezifische Marker. Die Färbung für DNA von Zellen in Kultur durch DAPI (blau) wird ebenfalls angezeigt. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> Abbildung 3. Mikroglia isoliert in der Methode beschrieBett in einer Reihe von Tests, einschließlich verwendet worden, aber nicht beschränkt auf, Phagozytose Assays,-Assays und Neurotoxizität beschränkt. In diesen Studien haben wir gefunden, dass Mikroglia (Iba-1-positiven, grün), bei Bestrahlung mit steuern (A) oder LPS (B) behandelten Medien, die Erhöhung des Phagozytose von fluoreszenzmarkierten Latexkügelchen (rot), die quantifiziert werden kann ( C). Ferner kann LPS (1ng/ml) Behandlung zu erhöhen die Produktion von Stickoxid in Mikroglia (D). Schließlich sowohl über Transwell-Einsatz-getrennt oder direkt Mikroglia-Neuron-Kulturen, haben wir festgestellt, dass Mikroglia mit LPS kann neuronalen Zelltod induzieren wie von Lactatdehydrogenase (LDH) Freisetzung (E, F) gemessen.

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Während dieses Protokoll routinemäßig benutzt wird, um reines und gesundes Mikroglia Experimente für die Forschung zu produzieren, wird sorgfältige Prüfung der technischen Aspekte bei der kritischen Teile des Verfahrens die Variabilität zu minimieren in dem isolierten Mikroglia. Erstens, während der Präparation von Hirngewebe aus neugeborenen Ratten Welpen, arbeitet in einer zeitgemäßen Weise ist notwendig, um hypoxische und ischämische Schädigung des Gewebes zu minimieren. Es ist jedoch auch wichtig, um die vollständig...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Petrischalen </td><td> Marke Fisher </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Sharp Präparierscheren </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 7b Pinzette-Standard-Spitzen, gebogen, 11cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont Nr. 5 Zangen-Standard-Spitzen, gerade, 11 cm </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml konischen Zentrifugenröhrchen </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml serologischen Pipetten </td><td> Grenier Bio One </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml serologischen Pipetten </td><td> Grenier Bio One </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 um sterile Nylon Zellsieb </td><td> Falke </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 Zellkulturflaschen </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15-Medium </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Fetale Pferdeserum </td><td> Fischer </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100% Ethanol </td><td> Die Warner Graham Company </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 10X, pH 7,4 </td><td> Quality Biological, Inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X in sterilem, destilliertem Wasser </td></tr><tr><td> Biohazard Taschen </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Hämocytometer </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6-well-Zellkulturplatten mit Cellbind Oberfläche </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

primäre mikroglia isolation vom gemischten zellkulturen von gliazellen neonatal rattenhirngewebe

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Mikroglia-Konto für ca. 12% der gesamten Zellpopulation im Gehirn von Säugetieren. Während Neuronen und Astrozyten die wichtigsten Zelltypen des Nervensystems angesehen werden, spielen eine bedeutende Rolle Mikroglia im normalen Gehirn-Physiologie durch die Überwachung Gewebe für Schmutz und Krankheitserregern und Aufrechterhaltung der Homöostase im Parenchym über Phagozytoseaktivität 1,2. Mikroglia sind während einer Reihe von Verletzungen und Krankheiten, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen, traumatische Hirnverletzung, und das Nervensystem Infektion 3 aktiviert. Unter diesen aktivierenden Bedingungen, erhöhen die Mikroglia Phagozytenaktivität, unterzogen morpohological und proliferative Veränderungen und aktiv sezernieren reaktiven Sauerstoff und Stickstoff Arten, entzündungsfördernde Zytokine und Chemokine, oft Aktivieren eines parakrine oder autokrine Schleife 4-6. Da diese Mikrogliazellen Antworten auf Krankheitsentstehung beitragen, neurologischen Erkrankungen, gezielter Forschung auf microglia gerechtfertigt ist. Aufgrund der zellulären Heterogenität des Gehirns, ist es technisch schwierig, eine ausreichende Mikroglia Probenmaterial mit hoher Reinheit zu erhalten während der in vivo-Experimente. Aktuelle Forschungen über die neuroprotektiven und neurotoxischen Funktionen von Mikroglia erfordern eine technische Routine-Methode, um konsequent zu generieren rein und gesund Mikroglia mit ausreichenden Ertrag für das Studium. Wir präsentieren, in Text und Video, ein Protokoll zur reinen primären Mikroglia aus gemischten Glia Kulturen zu isolieren für eine Vielzahl von nachgelagerten Anwendungen. Kurz gesagt, nutzt diese Technik dissoziierten Hirngewebe von neugeborenen Ratten Welpen zu gemischten Glia-Zellkulturen zu produzieren. Nachdem die gemischten Kulturen glialen Konfluenz erreichen, werden die primären Mikroglia mechanisch von der Kultur durch eine kurze Dauer Schütteln isoliert. Die Mikroglia sind dann in hoher Reinheit für die experimentelle Untersuchung überzogen. Das Prinzip und das Protokoll dieser Methodik wurdenin der Literatur beschrieben 7,8. Darüber hinaus werden alternative Methoden zur primären Mikroglia isolieren gut beschrieben 12.09. Homogenisierte Hirngewebe kann durch Dichtegradientenzentrifugation getrennt werden, um primäre Mikroglia 12 ergibt. Jedoch ist die Zentrifugation von mittlerer Länge (45 Min.) und kann eine Zellschädigung und Aktivierung sowie verursachen angereicherten Mikroglia und anderen zellulären Populationen führen. Ein anderes Protokoll wurde verwendet, um primäre Mikroglia in einer Vielzahl von Organismen zu isolieren durch längeres (16 Stunden), während Schütteln in Kultur 9-11. Nach dem Schütteln wird das Medium Überstand zentrifugiert, um Mikroglia zu isolieren. Diese längere Zwei-Schritt-Isolierung Verfahren kann auch stören Mikroglia-Funktion und Aktivierung. Wir nutzen vor allem die folgenden Mikroglia Isolation Protokoll in unserem Labor für eine Reihe von Gründen: (1) primäre Mikroglia in vivo simulieren Biologie treuer als verewigt Nagetier Mikroglia-Zelllinien, (2) Nominalen mechanischen Störungen minimiert potenzielle Zellfunktionsstörungen oder Aktivierung, und (3) ausreichende Ausbeute ohne Durchgang der gemischten Gliazellen Kulturen erhalten werden. Es ist wichtig zu beachten, dass dieses Protokoll Hirngewebe von Neugeborenen verwendet Rattenjungen Mikroglia isolieren und dass die Verwendung von älteren Ratten zu isolieren Mikroglia wesentlich beeinflussen können die Ausbeute, Aktivierungsstatus und funktionellen Eigenschaften von isolierten Mikroglia. Es gibt Hinweise darauf, dass Altern mit Mikroglia Dysfunktion, erhöhte Neuroinflammation und neurodegenerativen Erkrankungen verknüpft ist, so haben frühere Studien Mikroglia ex vivo Erwachsenen verwendet werden, um ein besseres Verständnis der Rolle der Mikroglia bei neurodegenerativen Erkrankungen, wo Altern ist wichtiger Parameter. Jedoch können ex vivo Mikroglia in Kultur nicht für längere Zeit aufbewahrt werden. Daher, während dieses Protokoll verlängert die Lebensdauer der primären Mikroglia in Kultur ist darauf hinzuweisen, dass die Mikroglia d verhaltenifferently aus adulten Mikroglia und in-vitro-Studien sollte sorgfältig abgewogen werden, wenn zu einem In-vivo-Einstellung übersetzt.

Isolieren primären Mikroglia aus der zellulären Heterogenität des Gehirns ist wichtig, um deren Rolle bei physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine mechanische Isolation und gemischten Zellkultur-Technik, die eine hohe Ausbeute und hoher Reinheit liefert, lebensfähigen primären Mikrogliazellen für<em&gt; In-vitro-</em&gt; Studien-und Downstream-Anwendungen.

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Mikroglia machen etwa 12 % der gesamten Zellpopulation im Gehirn von Säugetieren aus. Während Neuronen und Astrozyten als die wesentlichen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, primäre Mikroglialzellkulturen aus neonatalen Rattengehirnen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn isoliert und die Hirnhäute entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Gehirn zu homogenisieren und die gemischte Gliazellkultur in T-75-Flaschen auszuplatzieren.Anschließend werden die Kolben 10 bis 14 Tage lang inkubiert, bis eine Astrozyten-Monoschicht Konfluenz erreicht hat. Im letzten Schritt werden die Kolben geschüttelt, um Mikroglia freizusetzen, die auf der Astrozyten-Monoschicht wachsen, wodurch eine gereinigte Kultur von Mikroglia erhalten wird. Letztendlich können hochreine primäre Mikroglia in nachfolgenden in-vitro-Einzelzellkulturen und Co-Kultur-Assays verwendet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Perico-Dichtegradientenmethode liegt darin, dass eine geringe mechanische Zerstörung die Dysfunktion oder Aktivierung von Mikrogliazellen minimiert und dass Mikrogliazellen für Experimente über mehrere Wochen nach der ursprünglichen Präparation gewonnen werden können. Ich werde dieses Verfahren gemeinsam mit Tammy Tero demonstrieren, einer Doktorandin im Labor von Dr. Clifton Dau guard. Die während dieses Protokolls erzielten hochreinen Mikrogliazellkulturen können in In-vitro-Experimenten eingesetzt werden, um die Funktion der Mikroglia unter normalen physiologischen Bedingungen sowie unter pathologischen Krankheitsbedingungen zu untersuchen.Die Mikroglia, ihre Reaktion auf Gewebeschäden sowie auf entzündliche Reize, ist von direkter Bedeutung für neurologische Verletzungen und neurodegenerative Erkrankungen. Personen, die neu in dieser Methode sind, haben in der Regel Schwierigkeiten, da sie nicht vertraut damit sind, wie die Hirnhäute rechtzeitig aus dem Gehirngewebe entfernt werden, um eine Kontamination der primären Mikroglia-Kulturen mit Fibroblasten zu verringern. Außerdem ist darauf zu achten, dass die Astrozyten-Monoschicht beim Schütteln der Kolben und beim Umgang mit den Mikroglia-Kulturen nicht beschädigt wird.Um das Verfahren vorzubereiten, kühlen Sie Chi Livi in L-15-Medien auf vier Grad Celsius ab, stellen Sie sie für 60 mm × 15 mm Petrischalen mit L-15-Medien bereit und legen Sie sie auf Eis. Erwärmen Sie das Kulturmedium auf 37 Grad Celsius, und vergewissern Sie sich, dass alle chirurgischen Instrumente sterilisiert wurden. Nachdem Sie ein P1-bis-P5-Rattenjunges mit einer scharfen Schere enthauptet haben, tauchen Sie den Kopf in 70 % Ethanol.Nachdem die Köpfe von fünf Rattenwürfen gesammelt wurden, überführen Sie die Köpfe in Kochsalzlösung. Entfernen Sie das gesamte Gehirn aus jedem Kopf, indem Sie vorsichtig Schnitte beidseits des Schädels oberhalb der Ohren durchführen und das Gehirn herausziehen und in eine der Petrischalen mit L-15-Medium auf Eis legen. Sobald die ersten fünf Gehirne in das auf Eis stehende L-15 überführt wurden, können die nächsten fünf Würfe auf die gleiche Weise verarbeitet werden, wenn alle Gehirne gesammelt wurden.Entfernen Sie die Hirnhäute, indem Sie vorsichtig mit einer Pinzette eine Kante des meningealen Blattes erfassen und sie behutsam von der darunterliegenden Großhirnrinde ablösen. Es ist entscheidend, die Hirnhäute vollständig zu entfernen und dies so schnell wie möglich durchzuführen. Nach der Entfernung der Hirnhäute überführen Sie jedes Gehirn in eine frische Petrischale mit L-15-Medium auf Eis.Aspirieren Sie das Gehirngewebe und das Medium mit einer 10-Milliliter-Pipette in eine sterile 50-Milliliter-Konischgefäß. Zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten bei 2.500 RCF und 4 °C. Nach der Zentrifugation wird das Überstand abpipettiert.Der Überstand wird dann mit einer sterilen 10-Milliliter-Pipette abgenommen. Den Pellet in vier bis fünf Milliliter frischem L-15-Medium suspendieren, das Medium und das Gewebe zehnmal auf- und abpipettieren. Danach einen Zellfilter mit 100-Mikron-Porendurchmesser auf ein frisches 50-Milliliter-Konischgefäß setzen.Verwenden Sie eine sterile Fünf-Milliliter-Pipette, um die Gewebesuspension mehrmals auf- und abzupipettieren, und geben Sie anschließend unter Ausspülen der Pipette durch den Zellfilter das Material in ein kegelförmiges Reagenzglas. Spülen Sie den Filter mit vier bis fünf Millilitern frischem, gekühltem L-15-Medium aus. Zentrifugieren Sie danach bei 2.500 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.Für jedes verarbeitete Rattenwelpengehirn einen sterilen T-75-Flasche vorbereiten, indem 12 Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium in jede Flasche gegeben werden. Danach, nach dem Absaugen des Überstands von den zellulären Pellets, 5 bis 6 Milliliter Kulturmedium zum Zellpellet hinzufügen und 10-mal mit einer 10-Milliliter-Pipette auf- und abpipettieren. Anschließend eine gleiche Menge der Zellsuspension in jede T-75-Flasche überführen.Inkubieren Sie die Kolben für eine bis drei Wochen in einem 5 %igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 °C, wobei die Zellen in den ersten fünf Tagen nach der initialen Aussaat ungestört bleiben sollen. Ersetzen Sie nach fünf Tagen das konditionierte Medium in jedem Kolben vorsichtig durch 12 Milliliter frisches Medium, um Konfluenz zu erreichen. Dies muss äußerst sorgfältig erfolgen, ohne den Boden des Kolbens zu berühren, an dem sich die Zellen angeheftet haben.Wenn die gemischten Gliazellkulturen vollständig konfluent sind, entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator. Verschließen Sie die Kolbenkappen mit Parafilm, um einen Gasaustausch mit der Umgebungsluft zu verhindern, und stellen Sie die Kolben für eine Stunde in einen Schüttelinkubator, der auf 100 RPS und 37 Grad Celsius eingestellt ist. Nach Ablauf der Stunde sammeln Sie das Medium mit einer 10-Milliliter-Pipette aus den Kolben, ohne die Astrozytenschicht zu stören, und geben es in 50-Milliliter-Konischgläser. Geben Sie frisches Medium in die Kolben und stellen Sie diese wieder in den Inkubator.Nachdem die Röhrchen bei 2.500 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert wurden, den Überstand abpipettieren und die Zellen in einem Milliliter Mikroglia-Plattierungsmedium resuspendieren. Anschließend die Zellen mit einem Hämocytometer und standardisierten Verfahren zählen. Sobald die Zellanzahl bestimmt ist, ein geeignetes Volumen an Mikroglia-Plattierungsmedium hinzufügen, um eine Zellkonzentration zu erreichen.Konzentration von zwei Mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter Platte ist für das Experiment geeignet; anschließend in den Inkubator zurückstellen. Um den Mikroglia eine Übernachtung zur Anheftung zu ermöglichen. Die Zellen wurden mit einem Antikörper gegen IBA1, einen Mikroglia-Marker, immungefärbt, der rot erscheint.Die Kultur weist eine minimale Kontamination mit neuronalen Zellen auf, wie dieses Mikroskopbild der Immunfärbung mit einem Antikörper gegen einen neuen neuronalen Marker (NA) zeigt, der rot erscheint. Der Schnitt wurde mit DAPI kontrastgefärbt, um alle Zellkerne blau darzustellen. Dieses Bild zeigt die Immunfärbung mit GFAP, einem Marker für Astrozyten.Die Astrozyten erscheinen grün. Hier sehen wir ein Bild der Mikroglialkultur, die mit einem Antikörper gegen CC1, einem Oligodendrozyten-Marker, immungefärbt wurde. Die Oligodendrozyten erscheinen rot.Dieses Histogramm zeigt die Ergebnisse der Quantifizierung der einzelnen Zelltypen. Es ist ersichtlich, dass die ausgesäten Mikroglia-Kulturen eine Reinheit von über 90 % aufweisen. Dieses Fluoreszenzmikroskopbild zeigt eine Mikroglia-Kultur, die mit einem Antikörper gegen IBA1 markiert wurde.Die roten Bereiche sind fluoreszierend markierte Latexkügelchen. Die hier gezeigte Mikrogliazellkultur wurde mit einem Nanogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid behandelt, und es ist erkennbar, dass die Mikrogliazellen die fluoreszierend markierten Latexkügelchen phagozytiert haben. Hier werden die Ergebnisse des Phagozytose-Assays in einem Histogramm dargestellt.Eine erhöhte Phagozytose wird nach der Behandlung mit LPS beobachtet. Diese Abbildung zeigt, dass auch die Produktion von Stickstoffmonoxid in Mikroglia-Kulturen nach Zugabe von LPS ansteigt. Schließlich sind sowohl direkte als auch durch Transwell-Einsätze getrennte Mikroglia-Neuronen-Kulturen anfälliger für einen erhöhten Zelltod nach Inkubation mit LPS, gemessen anhand der Freisetzung von Lactatdehydrogenase. Sobald der erste Teil dieser Technik beherrscht ist, kann das Verfahren bis zum Ansäen in T-75-Flaschen innerhalb von eineinhalb Stunden durchgeführt werden, und der gesamte Vorgang kann innerhalb von zwei Wochen abgeschlossen sein.Ein weiterer Aspekt bei der Optimierung dieses Protokolls ist die Bestimmung der Dauer. Die gemischten Gliazellkulturen sollten vor der Isolierung primärer Mikrogliazellen zur Aussaat beibehalten werden, nachdem hochreine Kulturen etabliert wurden. Mit diesem Verfahren kann die Mikrogliafunktion in vitro untersucht werden; die Messung der Stickstoffmonoxidproduktion, die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen sowie die phasische Aktivität können alle mittels routinemäßiger Labormethoden bestimmt und quantifiziert werden.Daher können Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften mit der Entwicklung dieses Verfahrens die Aktivität von Mikrogliazellen in einem homogenen zellulären Umfeld untersuchen und ihre Funktionen unter verschiedenen neurologischen Bedingungen erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre Mikrogliazellkulturen aus neonatalen Rattengehirnen herstellt. Nachdem zunächst das Gehirn isoliert und die Hirnhäute entfernt werden, wird das Gehirn homogenisiert und in Kolben ausplattiert; anschließend werden die Kolben 10 bis 14 Tage lang inkubiert, bis eine Astrozyten-Monoschicht Konfluenz erreicht hat.Der letzte Schritt besteht darin, die Kolben zu schütteln, um Mikrogliazellen freizusetzen, die auf der Oberseite der Astrozyten-Monoschicht wachsen, was zu einer gereinigten Kultur von Mikrogliazellen führt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen. Dabei werden Mikroglia von anderen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen mit Hilfe von Platten getrennt, die mit einem monoklonalen Antikörper beschichtet sind, der spezifisch für Mikroglia ist.

Isolierung und Kultivierung von Mikroglia aus Rattengehirnen mit serumfreien Medien

Das Video demonstrierte die Methode zur Isolierung und Kultivierung von Zellen aus einem neugeborenen Mäusegehirn. Es beinhaltete die enzymatische und mechanische Dissoziation des Gehirns, gefolgt von der Kultivierung in Wachstumsmedien ohne neuronalen Wachstumsfaktor, um eine gemischte Gliapopulation zu erhalten.

Gewinnung einer gemischten Gliazellkultur aus einem neonatalen Mausgehirn

Wir skizzieren Methoden für die effiziente und schnelle Isolierung / Kultur lebensfähiger Mikroglia aus dem Neugeborenen Hirnrinde und erwachsenen Rückenmark. Die Präparation und Beschichtung der kortikalen Mikroglia kann innerhalb von 90 Minuten erreicht werden, mit der anschließenden Mikroglia Ernte stattfindet ~ 10 Tage nach der ersten Sektion.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Ein Schlüssel zur erfolgreichen Untersuchung der Mikroglia-Biologie ist die Erhaltung der Immunfunktion Mikroglia ex vivo bei der Isolierung von ZNS-Gewebe. Trenn Mikroglia über Dreh Schütteln Ergebnisse in hochreiner und immunofunctional Zellkulturen durch Fluoreszenz-Bildgebung, Immunzytochemie, und ELISA folgenden Mikroglia-Aktivierung mit der proinflammatorische Stimuli Lipopolysaccharide (LPS) und Pam 3 4 CSK (Pam) bewertet.

Isolation kortikaler Mikroglia mit bewahrten Immunophänotyp und Funktionalität aus Murine Neugeborene

Hier präsentieren wir ein Protokoll Mikroglia aus postnataler Maus Welpen (Tag 1) für in - vitro - Experimente zu isolieren. Diese improvisierte Isolierungsmethode erzeugt sowohl hohe Ausbeute und Reinheit, einen bedeutenden Vorteil gegenüber alternativen Methoden, die für die Zwecke der Erläuterung Mikroglia biology breites Spektrum Experimente ermöglicht.

Schnelle und Refined CD11b Magnetic Isolierung von primären Mikroglia mit erhöhter Reinheit und Vielseitigkeit

Bemühungen, Mikroglia-Funktion im Detail zu verstehen haben durch das Fehlen von Mikroglia Kultur Modelle behindert worden, die die Eigenschaften der Reifen in Vivo Mikroglia rekapitulieren. Dieses Protokoll beschreibt einen Isolation und Kultur Ansatz entwickelt, um robuste überleben stark verzweigten Reife Ratte Mikroglia Bedingungen definiert-Mittel zu erhalten.

Isolation und Kultur von Nagetier Microglia zur Förderung einer dynamisches verzweigt Morphologie in serumfreien Medium

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur In-vitro-Isolierung mehrerer Gliazellpopulationen aus einem Maus-ZNS. Diese Methode ermöglicht die Segregation von regionalen Mikroglia, Oligodendrozytenvorläuferzellen und Astrozyten, um die Phänotypen jedes einzelnen in einer Vielzahl von Kultursystemen zu untersuchen.

Dissektion und Isolierung von murinen Glia aus mehreren Regionen des zentralen Nervensystems

Dieses Protokoll ist eine effiziente, kostengünstige und robuste Methode zur Isolierung primärer Mikroglia aus lebendem, erwachsenem, menschlichem Hirngewebe. Isolierte primäre menschliche Mikroglia kann als Werkzeug für die Untersuchung zellulärer Prozesse bei Homöostase und Krankheit dienen.

Gewinnung menschlicher Mikroglia aus erwachsenem menschlichem Hirngewebe

Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Dieses Protokoll beschreibt eine Mikroglia-neuronale Co-Kultur, die aus primären neuronalen Zellen hergestellt wurde, die an den Embryonaltagen 15-16 aus Mausembryonen isoliert wurden, und aus primären Mikroglia, die aus den Gehirnen von neugeborenen Mäusen an den postnatalen Tagen 1-2 erzeugt wurden.

Generierung und Co-Kultivierung von primären Mikroglia und kortikalen Neuronen von Mäusen

Lernen Sie die Isolation primärer Mikroglia aus neonatalem Rattenhirngewebe durch mechanische Dissoziation und Schüttelkultur. Diese Methode liefert hochreine Zellen für in-vitro-Studien zur Neuroinflammation.

Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

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