Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Isolieren primären Mikroglia aus der zellulären Heterogenität des Gehirns ist wichtig, um deren Rolle bei physiologischen und pathologischen Bedingungen zu untersuchen. Dieses Protokoll beschreibt eine mechanische Isolation und gemischten Zellkultur-Technik, die eine hohe Ausbeute und hoher Reinheit liefert, lebensfähigen primären Mikrogliazellen für

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Herstellung primärer Mikroglia-Zellkulturen aus neonatalen Rattengehirnen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn isoliert und die Hirnhäute entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Gehirn zu homogenisieren und in gemischte Gliakulturen in T-75-Kolben zu füllen.

Anschließend werden die Kolben 10 bis 14 Tage lang inkubiert, bis eine Astrozyten-Monoschicht die Konfluenz erreicht hat. Der letzte Schritt besteht darin, die Kolben zu schütteln, um Mikroglia freizusetzen, die auf der Astrozyten-Monoschicht wachsen, was zu einer gereinigten Kultur von Mikroglia führt. Letztendlich können hochreine primäre Mikroglia in nachfolgenden in vitro Einzelzellkulturen und Co-Kultur-Assays verwendet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Perico-Gradientenmethode besteht darin, dass die nominelle mechanische Störung die Dysfunktion oder Aktivierung der Mikroglia minimiert und Mikroglia für Experimente noch Wochen nach der ersten Vorbereitung erzeugt werden können. Ich werde dieses Verfahren zusammen mit Tammy Tero, einer Doktorandin im Labor von Dr. Clifton Dau Guard, demonstrieren. Die im Rahmen dieses Protokolls erzielten hochreinen Mikrogliakulturen können in In-vitro-Experimenten verwendet werden, um die Mikrogliafunktion unter normalen physiologischen Bedingungen sowie pathologische Krankheitszustände zu untersuchen.

Mikroglia, die Reaktionsfähigkeit auf Gewebeschäden sowie Entzündungsreize haben eine direkte Relevanz für neurologische Verletzungen und neurodegenerative Krankheitszustände. Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie nicht wissen, wie sie die Hirnhäute rechtzeitig aus dem Hirngewebe entfernen können, um die Fibroblastenkontamination in den primären Mikrogliakulturen zu reduzieren. Darüber hinaus sollte darauf geachtet werden, dass die Astrozyten-Monoschicht beim Schütteln der Kolben und beim Umgang mit den Mikroglia-Kulturen nicht beschädigt wird.

Zur Vorbereitung auf den Eingriff wird Chi Livi mit L 15 Medien auf vier Grad Celsius versetzt, bereit für 60 x 15 Millimeter große Petrischalen mit L 15 Medien und auf Eis gelegt. Erwärmen Sie das Nährmedium auf 37 Grad Celsius und stellen Sie sicher, dass alle chirurgischen Instrumente sterilisiert wurden. Nachdem Sie einen Rattenwelpen von P eins bis P fünf mit einer scharfen Schere geköpft haben, lassen Sie den Kopf in 70%iges Ethanol fallen.

Nachdem die Köpfe von fünf Rattenbabys gesammelt wurden, geben Sie die Köpfe in Kochsalzlösung. Entfernen Sie das gesamte Gehirn von jedem Kopf, indem Sie vorsichtig Schnitte auf beiden Seiten des Schädels über den Ohren vornehmen und das Gehirn herausziehen und in eines der Petrithemen ziehen, das L 15 Medium auf Eis enthält. Sobald die ersten fünf Gehirne auf L 15 auf Eis übertragen wurden, können die nächsten fünf Jungtiere auf die gleiche Weise verarbeitet werden, wenn alle Gehirne gesammelt wurden.

Entfernen Sie die Hirnhäute, indem Sie mit einer Pinzette vorsichtig einen Rand des Hirnhautblattes greifen und vorsichtig von der darunter liegenden Rinde abziehen. Es ist wichtig, die Hirnhäute gründlich und so schnell wie möglich zu entfernen. Nach der Entfernung der Hirnhäute werden alle Gehirne in eine frische Petrischale mit L 15 Medium auf Eis gegeben.

Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um das Gehirngewebe und das Medium von der Platte in ein steriles konisches 50-Milliliter-Röhrchen zu aspirieren. Dann zentrifugieren Sie bei 2.500 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation aspirieren.

Das Supinat verwendet dann eine sterile 10-Milliliter-Pipette zum Reese. Suspendieren Sie das Pellet in vier bis fünf Millilitern frischem L 15-Medium, pipettieren Sie das Medium und das Gewebe 10 Mal auf und ab. Legen Sie anschließend ein 100-Mikron-Poren-Zellsieb auf ein frisches konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Verwenden Sie eine sterile Fünf-Milliliter-Pipette, um die Gewebesuspension auf und ab zu pipettieren, und geben Sie dann, während die Pipette in das Zellsieb gespült wird, das Material durch das Zellsieb in das konische Röhrchen ab. Spülen Sie das Sieb mit vier bis fünf Millilitern frisch gekühltem L 15-Medium. Zentrifugieren Sie dann Ihre 2.500 RCF fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Für jedes verarbeitete Gehirn des Rattenwelpen wird ein steriler T 75-Kolben hergestellt, indem 12 Milliliter Nährmedien aus der Vorkriegszeit in jeden Kolben gegeben werden. Nachdem Sie das Substrat aus den pelletierten Zellen abgesaugt haben, geben Sie fünf bis sechs Milliliter Nährmedium zu dem Zellpellet und pipettieren Sie mit einer 10-Milliliter-Pipette 10 Mal auf und ab. Anschließend wird ein gleiches Volumen der Zellsuspension in jeden Kolben T 75 überführt.

Inkubieren Sie die Kolben in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für ein bis drei Wochen, so dass die Zellen in den ersten fünf Tagen nach der ersten Beschichtung ungestört sitzen können. Nach fünf Tagen wird das konditionierte Medium in jedem Kolben durch 12 Milliliter frisches Medium ersetzt, um eine Konfluenz zu erreichen. Dies muss sehr vorsichtig erfolgen, ohne den Boden des Kolbens zu berühren, an dem die Zellen ansetzen.

Sobald die gemischten Gliakulturen vollständig zusammenfließen, nehmen Sie den Kolben aus dem Inkubator. Decken Sie die Kolbenkappen mit Param ab, um einen Gasaustausch mit der Umgebungsluft zu verhindern, und stellen Sie die Kolben nach Ablauf der Stunde eine Stunde lang in einen Schüttelinkubator mit 100 U/s und 37 Grad Celsius. Verwenden Sie eine 10-Milliliter-Pipette, um das Medium aus den Kolben zu sammeln, ohne die Astrozytenschicht zu stören, und geben Sie es in konische 50-Milliliter-Röhrchen ab. Geben Sie frische Medien in die Kolben und kehren Sie in den Inkubator zurück.

Nach dem Zentrifugieren der Röhrchen bei 2.500 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius aspiriert man das Supinat und suspendiert die Zellen erneut in einem Milliliter Mikroglia-Plattierungsmedium. Zählen Sie dann die Zellen mit einem menschlichen Zytometer und Standardverfahren. Sobald die Anzahl der Zellen bestimmt wurde, fügen Sie ein entsprechendes Volumen an Mikroglia-Beschichtungsmedien hinzu, um eine Zelle zu erhalten.

Eine Konzentration von zwei mal 10 auf die fünf Zellen pro Milliliterplatte ist für das Experiment und die Rückkehr in den Inkubator geeignet. Damit sich die Mikroglia über Nacht anheften können. Die Zellen wurden mit einem Antikörper immungefärbt, der spezifisch für IBA one ist, einem Mikrogliamarker, der rot erscheint.

Es gibt nur eine minimale Kontamination der Kultur mit neuronalen Zellen, wie dieses Mikroskopbild der Immunfärbung mit einem Antikörper für einen neuen neuronalen NA-Marker zeigt, der rot erscheint. Der Objektträger wurde mit DPI gegengefärbt, um alle Zellkerne blau zu färben. Dieses Bild zeigt die Immunfärbung mit GFAP und Astrozytenmarker.

Die Astrozyten erscheinen grün. Hier sehen wir ein Bild der Mikrogliakultur, die mit einem Antikörper gefärbt ist, der spezifisch für CC one, einen Oligodendrozytenmarker, ist. Die Oligodendrozyten erscheinen rot.

Dieses Histogramm zeigt die Ergebnisse der Quantifizierung jedes Zelltyps. Es ist zu erkennen, dass die plattierten Mikrogliakulturen zu mehr als 90% rein sind. Dieses Bild des Fluoreszenzmikroskops zeigt eine Mikrogliakultur, die als Immunfärbung für IBA one diente.

Die roten Bereiche sind fluoreszierend markierte Latexperlen. Die hier gezeigte Mikrogliakultur wurde mit einem Nanogramm pro Milliliter Lipo-Polysaccharid behandelt, und es ist zu sehen, dass die Mikrogliazellen eine Phagozytose aufweisen, die fluoreszenzmarkierten Latexkügelchen. Hier werden die Ergebnisse des Phagozytose-Assays in einem Histogramm dargestellt.

Nach der Behandlung mit LPS wird eine erhöhte Phagozytose beobachtet. Diese Abbildung zeigt, dass die Stickoxidproduktion auch in Mikrogliakulturen nach Zugabe von LPS zunimmt. Schließlich sind sowohl Direkt- als auch Transwell-Insertions-getrennte Mikroglia-Neuronenkulturen nach der Inkubation mit LPS anfällig für einen erhöhten Zelltod, gemessen an der Freisetzung von Laktatdehydrogenase. Sobald der erste Teil dieser Technik bis zur Plattieren in T 75 gemeistert wurde, können die Kolben in eineinhalb Stunden und das gesamte Verfahren innerhalb von zwei Wochen durchgeführt werden.

Eine weitere Überlegung bei der Optimierung dieses Protokolls ist die Bestimmung der Zeitdauer. Gemischte Gliakulturen sollten vor der Isolierung primärer Mikroglia für die Beschichtung nach der Etablierung von hochreinen Kulturen aufbewahrt werden. Mit diesem Verfahren kann die Funktion der Mikroglia in vitro beurteilt werden, die Messung der Stickoxidproduktion, der Zytokin- und Chemokinfreisetzung sowie der phasischen Aktivität kann mit routinemäßigen Labortests bestimmt und gemessen werden.

Mit der Entwicklung dieses Verfahrens haben Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften die Möglichkeit, die Aktivität von Mikroglia in einer homogenen zellulären Umgebung zu untersuchen und ihre Rolle unter verschiedenen neurologischen Erkrankungen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre Mikroglia-Zellkulturen aus neonatalen Rattengehirnen vorbereitet. Indem zuerst das Gehirn isoliert und die Hirnhäute entfernt werden, dann das Gehirn homogenisiert und in Kolben umgefüllt wird, werden die Kolben 10 bis 14 Tage lang inkubiert, bis eine Astrozyten-Monoschicht den Konfluenz erreicht hat.

Der letzte Schritt besteht darin, die Kolben zu schütteln, um Mikroglia freizusetzen, die auf der Astrozyten-Monoschicht wachsen, was zu einer gereinigten Kultur von Mikroglia führt.