Primäre Mikroglia Isolation vom gemischten Zellkulturen von Gliazellen Neonatal Rattenhirngewebe

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, primäre Mikroglialzellkulturen aus neonatalen Rattengehirnen herzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn isoliert und die Hirnhäute entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, das Gehirn zu homogenisieren und die gemischte Gliazellkultur in T-75-Flaschen auszuplatzieren.

Anschließend werden die Kolben 10 bis 14 Tage lang inkubiert, bis eine Astrozyten-Monoschicht Konfluenz erreicht hat. Im letzten Schritt werden die Kolben geschüttelt, um Mikroglia freizusetzen, die auf der Astrozyten-Monoschicht wachsen, wodurch eine gereinigte Kultur von Mikroglia erhalten wird. Letztendlich können hochreine primäre Mikroglia in nachfolgenden in-vitro-Einzelzellkulturen und Co-Kultur-Assays verwendet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der Perico-Dichtegradientenmethode liegt darin, dass eine geringe mechanische Zerstörung die Dysfunktion oder Aktivierung von Mikrogliazellen minimiert und dass Mikrogliazellen für Experimente über mehrere Wochen nach der ursprünglichen Präparation gewonnen werden können. Ich werde dieses Verfahren gemeinsam mit Tammy Tero demonstrieren, einer Doktorandin im Labor von Dr. Clifton Dau guard. Die während dieses Protokolls erzielten hochreinen Mikrogliazellkulturen können in In-vitro-Experimenten eingesetzt werden, um die Funktion der Mikroglia unter normalen physiologischen Bedingungen sowie unter pathologischen Krankheitsbedingungen zu untersuchen.

Die Mikroglia, ihre Reaktion auf Gewebeschäden sowie auf entzündliche Reize, ist von direkter Bedeutung für neurologische Verletzungen und neurodegenerative Erkrankungen. Personen, die neu in dieser Methode sind, haben in der Regel Schwierigkeiten, da sie nicht vertraut damit sind, wie die Hirnhäute rechtzeitig aus dem Gehirngewebe entfernt werden, um eine Kontamination der primären Mikroglia-Kulturen mit Fibroblasten zu verringern. Außerdem ist darauf zu achten, dass die Astrozyten-Monoschicht beim Schütteln der Kolben und beim Umgang mit den Mikroglia-Kulturen nicht beschädigt wird.

Um das Verfahren vorzubereiten, kühlen Sie Chi Livi in L-15-Medien auf vier Grad Celsius ab, stellen Sie sie für 60 mm × 15 mm Petrischalen mit L-15-Medien bereit und legen Sie sie auf Eis. Erwärmen Sie das Kulturmedium auf 37 Grad Celsius, und vergewissern Sie sich, dass alle chirurgischen Instrumente sterilisiert wurden. Nachdem Sie ein P1-bis-P5-Rattenjunges mit einer scharfen Schere enthauptet haben, tauchen Sie den Kopf in 70 % Ethanol.

Nachdem die Köpfe von fünf Rattenwürfen gesammelt wurden, überführen Sie die Köpfe in Kochsalzlösung. Entfernen Sie das gesamte Gehirn aus jedem Kopf, indem Sie vorsichtig Schnitte beidseits des Schädels oberhalb der Ohren durchführen und das Gehirn herausziehen und in eine der Petrischalen mit L-15-Medium auf Eis legen. Sobald die ersten fünf Gehirne in das auf Eis stehende L-15 überführt wurden, können die nächsten fünf Würfe auf die gleiche Weise verarbeitet werden, wenn alle Gehirne gesammelt wurden.

Entfernen Sie die Hirnhäute, indem Sie vorsichtig mit einer Pinzette eine Kante des meningealen Blattes erfassen und sie behutsam von der darunterliegenden Großhirnrinde ablösen. Es ist entscheidend, die Hirnhäute vollständig zu entfernen und dies so schnell wie möglich durchzuführen. Nach der Entfernung der Hirnhäute überführen Sie jedes Gehirn in eine frische Petrischale mit L-15-Medium auf Eis.

Aspirieren Sie das Gehirngewebe und das Medium mit einer 10-Milliliter-Pipette in eine sterile 50-Milliliter-Konischgefäß. Zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten bei 2.500 RCF und 4 °C. Nach der Zentrifugation wird das Überstand abpipettiert.

Der Überstand wird dann mit einer sterilen 10-Milliliter-Pipette abgenommen. Den Pellet in vier bis fünf Milliliter frischem L-15-Medium suspendieren, das Medium und das Gewebe zehnmal auf- und abpipettieren. Danach einen Zellfilter mit 100-Mikron-Porendurchmesser auf ein frisches 50-Milliliter-Konischgefäß setzen.

Verwenden Sie eine sterile Fünf-Milliliter-Pipette, um die Gewebesuspension mehrmals auf- und abzupipettieren, und geben Sie anschließend unter Ausspülen der Pipette durch den Zellfilter das Material in ein kegelförmiges Reagenzglas. Spülen Sie den Filter mit vier bis fünf Millilitern frischem, gekühltem L-15-Medium aus. Zentrifugieren Sie danach bei 2.500 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius.

Für jedes verarbeitete Rattenwelpengehirn einen sterilen T-75-Flasche vorbereiten, indem 12 Milliliter vorgewärmtes Kulturmedium in jede Flasche gegeben werden. Danach, nach dem Absaugen des Überstands von den zellulären Pellets, 5 bis 6 Milliliter Kulturmedium zum Zellpellet hinzufügen und 10-mal mit einer 10-Milliliter-Pipette auf- und abpipettieren. Anschließend eine gleiche Menge der Zellsuspension in jede T-75-Flasche überführen.

Inkubieren Sie die Kolben für eine bis drei Wochen in einem 5 %igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 °C, wobei die Zellen in den ersten fünf Tagen nach der initialen Aussaat ungestört bleiben sollen. Ersetzen Sie nach fünf Tagen das konditionierte Medium in jedem Kolben vorsichtig durch 12 Milliliter frisches Medium, um Konfluenz zu erreichen. Dies muss äußerst sorgfältig erfolgen, ohne den Boden des Kolbens zu berühren, an dem sich die Zellen angeheftet haben.

Wenn die gemischten Gliazellkulturen vollständig konfluent sind, entfernen Sie den Kolben aus dem Inkubator. Verschließen Sie die Kolbenkappen mit Parafilm, um einen Gasaustausch mit der Umgebungsluft zu verhindern, und stellen Sie die Kolben für eine Stunde in einen Schüttelinkubator, der auf 100 RPS und 37 Grad Celsius eingestellt ist. Nach Ablauf der Stunde sammeln Sie das Medium mit einer 10-Milliliter-Pipette aus den Kolben, ohne die Astrozytenschicht zu stören, und geben es in 50-Milliliter-Konischgläser. Geben Sie frisches Medium in die Kolben und stellen Sie diese wieder in den Inkubator.

Nachdem die Röhrchen bei 2.500 RCF für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert wurden, den Überstand abpipettieren und die Zellen in einem Milliliter Mikroglia-Plattierungsmedium resuspendieren. Anschließend die Zellen mit einem Hämocytometer und standardisierten Verfahren zählen. Sobald die Zellanzahl bestimmt ist, ein geeignetes Volumen an Mikroglia-Plattierungsmedium hinzufügen, um eine Zellkonzentration zu erreichen.

Konzentration von zwei Mal 10 hoch fünf Zellen pro Milliliter Platte ist für das Experiment geeignet; anschließend in den Inkubator zurückstellen. Um den Mikroglia eine Übernachtung zur Anheftung zu ermöglichen. Die Zellen wurden mit einem Antikörper gegen IBA1, einen Mikroglia-Marker, immungefärbt, der rot erscheint.

Die Kultur weist eine minimale Kontamination mit neuronalen Zellen auf, wie dieses Mikroskopbild der Immunfärbung mit einem Antikörper gegen einen neuen neuronalen Marker (NA) zeigt, der rot erscheint. Der Schnitt wurde mit DAPI kontrastgefärbt, um alle Zellkerne blau darzustellen. Dieses Bild zeigt die Immunfärbung mit GFAP, einem Marker für Astrozyten.

Die Astrozyten erscheinen grün. Hier sehen wir ein Bild der Mikroglialkultur, die mit einem Antikörper gegen CC1, einem Oligodendrozyten-Marker, immungefärbt wurde. Die Oligodendrozyten erscheinen rot.

Dieses Histogramm zeigt die Ergebnisse der Quantifizierung der einzelnen Zelltypen. Es ist ersichtlich, dass die ausgesäten Mikroglia-Kulturen eine Reinheit von über 90 % aufweisen. Dieses Fluoreszenzmikroskopbild zeigt eine Mikroglia-Kultur, die mit einem Antikörper gegen IBA1 markiert wurde.

Die roten Bereiche sind fluoreszierend markierte Latexkügelchen. Die hier gezeigte Mikrogliazellkultur wurde mit einem Nanogramm pro Milliliter Lipopolysaccharid behandelt, und es ist erkennbar, dass die Mikrogliazellen die fluoreszierend markierten Latexkügelchen phagozytiert haben. Hier werden die Ergebnisse des Phagozytose-Assays in einem Histogramm dargestellt.

Eine erhöhte Phagozytose wird nach der Behandlung mit LPS beobachtet. Diese Abbildung zeigt, dass auch die Produktion von Stickstoffmonoxid in Mikroglia-Kulturen nach Zugabe von LPS ansteigt. Schließlich sind sowohl direkte als auch durch Transwell-Einsätze getrennte Mikroglia-Neuronen-Kulturen anfälliger für einen erhöhten Zelltod nach Inkubation mit LPS, gemessen anhand der Freisetzung von Lactatdehydrogenase. Sobald der erste Teil dieser Technik beherrscht ist, kann das Verfahren bis zum Ansäen in T-75-Flaschen innerhalb von eineinhalb Stunden durchgeführt werden, und der gesamte Vorgang kann innerhalb von zwei Wochen abgeschlossen sein.

Ein weiterer Aspekt bei der Optimierung dieses Protokolls ist die Bestimmung der Dauer. Die gemischten Gliazellkulturen sollten vor der Isolierung primärer Mikrogliazellen zur Aussaat beibehalten werden, nachdem hochreine Kulturen etabliert wurden. Mit diesem Verfahren kann die Mikrogliafunktion in vitro untersucht werden; die Messung der Stickstoffmonoxidproduktion, die Freisetzung von Zytokinen und Chemokinen sowie die phasische Aktivität können alle mittels routinemäßiger Labormethoden bestimmt und quantifiziert werden.

Daher können Forscher auf dem Gebiet der Neurowissenschaften mit der Entwicklung dieses Verfahrens die Aktivität von Mikrogliazellen in einem homogenen zellulären Umfeld untersuchen und ihre Funktionen unter verschiedenen neurologischen Bedingungen erforschen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre Mikrogliazellkulturen aus neonatalen Rattengehirnen herstellt. Nachdem zunächst das Gehirn isoliert und die Hirnhäute entfernt werden, wird das Gehirn homogenisiert und in Kolben ausplattiert; anschließend werden die Kolben 10 bis 14 Tage lang inkubiert, bis eine Astrozyten-Monoschicht Konfluenz erreicht hat.

Der letzte Schritt besteht darin, die Kolben zu schütteln, um Mikrogliazellen freizusetzen, die auf der Oberseite der Astrozyten-Monoschicht wachsen, was zu einer gereinigten Kultur von Mikrogliazellen führt.