Name: Genotypisierung von Pflanzen und Tieren Proben ohne vorherige DNA-Aufreinigung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Lernen Sie Direct PCR zur Genotypisierung von Pflanzen und Tieren ohne DNA-Aufreinigung. Diese Methode spart Zeit und Ressourcen bei der molekularbiologischen Analyse von Arabidopsis, Eiche und transgenen Mäusen.

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Für die Arabidopsis Proben und den betroffenen PCR-Primer wir danken Professor Jaakko Kangasjärvi und seine Gruppe, die Pflanze Stress-Group, Plant Biology, Department of Biosciences, University of Helsinki. Die Experimente mit der traditionellen Methode wurden von Frau Airi Lamminmäki durchgeführt. Transgene Maus Proben wurden durch Dr. Jaana Vesterinen, Institut für Biomedizin / Biochemie, Universität Helsinki vorgesehen. Harris Uni-Core und Harris Cutting Mat sind Warenzeichen der Shunderson Communications Inc. Alle anderen Warenzeichen sind Eigentum von Thermo Fisher Scientific Inc. und ihrer Tochtergesellschaften.

Ein. Genotypisierung von Arabidopsis Pflanze Personen mit Direct Protocol <ol><li> Um die dCAPS Genotypisierungsassay unmittelbar beginnen am Arabidopsis Pflanzenblatt, erste formulieren 20 oder 50 ul-PCR-Reaktionen unter Verwendung des Phire Plant Direct PCR Kit, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Anschließend schneiden Sie einen 0,50 mm Punch aus einer Arabidopsis Pflanze Blatt mit dem Harris Uni-Core und Harris Cutting Mat. Halten Sie den Puncher fest, drücken Sie die Schneide in das Gewebe und drehen Sie den Puncher hin und her. </li><li> Drücken Sie den Kolben, um den Stempel Disc in einer PCR-Reaktion auszuwerfen. Sicherzustellen, dass die Probe in die PCR-Lösung fällt und nicht auf den Rohrwänden kleben. </li><li> Reinigen der Schneidkante der Stanze zwischen jeder Probe, um eine Kreuzkontamination durch Eintauchen in 2% NaClO Lösung zu verhindern. Drücken Sie den Kolben nach oben und unten ein paar Mal, und wischen Sie die Schneide mit einem sauberen Papiertuch. Die Schneidmatte sollte auchgespült zwischen Proben. </li><li> Als nächstes beschäftigen Thermo Scientific Piko 24-well Thermocycler und Thermo Scientific Piko PCR Plate, um die PCR-Reaktionen mit den Fahrrad in Tabelle 2 beschrieben sind. Die PCR-Reaktionen können auch in herkömmlichen PCR Thermocycler durchgeführt werden. </li><li> Nach der PCR Spin-Down des pflanzlichen Materials. Übertragen 5 ul der Überstand in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Add 4 l Wasser und 1 ul Restriktionsenzym SspI. Vorsichtig mischen und kurz abzentrifugieren, um Inhalte in den Boden des Röhrchens zu sammeln. Inkubieren des Reaktionsgemisches für eine Stunde bei 37 ° C. Inaktivierung des Restriktionsenzyms durch Inkubation bei 65 ° C für 20 min. </li><li> Wenn Amplifikation von DNA direkt aus pflanzlichen Geweben, sind die PCR-Produkte Anlage und PCR-abgeleiteten Komponenten, die mit dem Restriktionsverdau Enzym stören könnten. Daher kann es erforderlich sein, entweder verdünnte (z. B. 1:2 oder 1:3 in Wasser) oder Reinigung des PCR-Produkts vor ter nachfolgende Verdau, beispielsweise durch Verwendung eines geeigneten kommerziellen Kit wie Thermo Scientific GeneJET PCR Purification Kit. </li><li> Nach Restriktionsenzymverdauung, analysieren die erhaltenen Fragmente auf einem Agarose Gel. Hinzufügen 2,5 ul 5x Ladepuffer zu der Reaktion und führen Agarosegelelektrophorese mit 10 ul der resultierenden Mischung. </li></ol> 2. Amplifikation spezifischer DNA-Fragmente von 15-jährigen Eichenlaub mit dem Dilution Protocol <ol><li> Um zu beginnen, schneiden Sie ein 2 mm Stempel Eichenblatt. </li><li> Legen Sie die Probe in 20 ul Verdünnungspuffer mit dem Phire Plant Direct PCR Kit geliefert. Reinigen der Schneidkante der Stanze und Schneidmatte wie zuvor. </li><li> Crush the leaf Probe mit einem 100 ul Pipettenspitze durch kurzes Drücken gegen die Rohrwand. Je nach pflanzlichem Material, die Verdünnung Protokoll funktioniert manchmal besser ohne Zerkleinerung der Probe. </li><li> Drehen Sie die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge bis ter Reaktionen sind in der Unterseite der Rohre. </li><li> Der Überstand kann direkt in der PCR verwendet werden, oder es kann 1:10 oder 1:100 in sterilem Wasser verdünnt werden je nach Art der Probe. Verwenden Sie 0,5 ul zu 1 ul des Überstands oder Verdünnung als Vorlage für einen 20 ul PCR-Reaktion. Bereiten Sie die Reaktion wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Sobald die Reaktionen hergestellt werden, beschäftigen Thermo Scientific Piko 24-well Thermocycler und Thermo Scientific Piko PCR Plate, um die PCR-Reaktionen mit den Fahrrad in Tabelle 2 beschrieben sind. Die PCR-Reaktionen können auch in herkömmlichen PCR Thermocycler durchgeführt werden. </li><li> Nach PCR zunächst 5 ul 5x Ladepuffer zu der Reaktion und führen Agarosegelelektrophorese mit 15 ul der resultierenden Mischung. </li></ol> 3. Genotypisierung von transgenen Mäusen mit dem Dilution Protocol <ol><li> Beginnen Sie mit der Verdünnung Protokoll an transgenen Mäusen, indem Sie einen 2 mm Stempel der mouse Ohr in 20 ul Verdünnungspuffer mit 0,5 ul DNARelease Additive mit dem Phire Tiergewebe Direkte PCR Kit geliefert. </li><li> Inkubiere die Proben bei Raumtemperatur für 2 min, gefolgt von 2-minütiger Inkubation bei 98 ° C. </li><li> Dreh die Proben kurz in einer Mikrozentrifuge bis die Reaktionen im Boden der Rohre sind. </li><li> Verwenden 1 ul Überstand als Matrize für eine PCR-Reaktion 20 ul, die wie in Tabelle 3 beschrieben. Jeder Überstand, die nicht wird sofort verwendet werden können, um ein neues Röhrchen überführt und bei -20 ° C. </li><li> Weiter beschäftigen a Thermo Scientific Piko 24-well Thermocycler und Thermo Scientific Piko PCR Plate, um die PCR-Reaktionen mit den Fahrrad in Tabelle 4 beschrieben sind. Auch hier können die PCR-Reaktionen auch in der konventionellen PCR-Cycler durchgeführt werden. </li><li> Nach der PCR werden 5 ul 5x Ladepuffer zu der Reaktion und führen Agarosegelelektrophorese wi-ten 15 ul der resultierenden Mischung. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse In der Technik wird die dCAPS Restriktionsstelle innerhalb des SNP von Interesse entweder eingeführt oder zerstört Verwendung eines PCR-Primer mit einem oder mehreren Mismatches an die Ziel-DNA. Genotypisierung von Arabidopsis-Pflanze Individuen wurde mit dem dCAPS Technik direkt vom Blatt Schläge ausgeführt. Die amplifizierten Produkte wurden verdaut und die resultierenden Fragmente enthüllt des Genotyps jedes einzelnen wurden durch Gelelektrophorese analysiert (Abbildung 2). In diesem Beispiel wurden die 160 bp PCR-Produkte, die die SNP-Stelle von Interesse (G oder A-Allel) im Genom von Arabidopsis Pflanzenblatt Stempel mit dem Phire Plant Direct PCR Kit amplifiziert. Der Vorwärts-Primer enthielt eine Fehlpaarung am 3&#39;-Ende, wodurch eine bestimmte SspI-Restriktionsschnittstelle in der Ziel-DNA, die die SNP von Interesse (A-Allel), aber nicht enthaltenim anderen Allel des SNPs (2B). Verdünnung Protokolle sind für anspruchsvolle Pflanzenmaterial, wie dem Eichenblatt, wegen seiner hohen Konzentration von phenolischen Verbindungen. Mit der Verdünnung hier beschriebene Protokoll wurde das 297 bp Fragment des Chloroplasten-DNA mit dem 3-Schritt-Protokoll. Eichenblatt Proben mit verschiedenen Verdünnungen werden in 3 gezeigt, zusätzlich zu positiven und negativen Kontrollen. Die Phire Tiergewebe Direkt PCR Kit wurde mit einem herausfordernden Protokoll, bei dem nur ein Primer Set zur Amplifikation von zwei Fragmente mit einer großen Größe Differenz wurde verwendet, was zu Ausbeuten reichlich beider korrekt dimensionierten Produkten von 1.500 bp für transgene Mäuse und 200 bp für beschäftigt Wildtyp-Mäusen (Abbildung 4). Je schwächer obere Band mit heterozygoten Mäusen ist aufgrund der Konkurrenz von beiden Templates (Allele) für den gleichen Primerpaars, jedoch ist der Genotypten Ergebnisse sind eindeutig. Die Stabilität der Proben unter Verwendung des Verdünnungs-Protokoll wurde auch getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verdünnung Proben bei -20 ° C für mindestens ein Jahr gelagert werden. Darüber hinaus hat Wiederholtes Einfrieren / Auftauen nicht signifikant auf die Reaktion (Abbildung 5). Auch gezeigt wird die robuste Amplifikation aus Mäuseohr Gewebeproben unter Verwendung Phire DNA-Polymerase und das Direct-PCR-Methode im Vergleich zu Heißstart Taq-Polymerase und gereinigte DNA (Abbildung 6). <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Komponenten </td><td fo:width=".75in"> 20 ul Reaktionsansatz </td><td fo:width=".75in"> 50 ul Reaktionsansatz </td><td fo:width=".75in"> Finale Conc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> In den 20 ul </td><td> In den 50 ul </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Werk PCR Buffer </td><td> 10 ul </td><td> 25 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> X ul </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA Polymerase </td><td> 0,4 ul </td><td> 1 ul </td><td></td></tr><tr><td> Sample / Direct Protocol </td><td></td><td> 0,50 mm Punch </td><td></td></tr><tr><td> Sample / Verdünnungsprotokoll </td><td> 0,5-1 ul </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1.<html> Reaktionsbedingungen für Plant PCR verwendet in diesem Protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Cycle Step </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Zeit </td><td fo:width=".4in"> Cycles </td></tr><tr><td> Initiale Denaturierung </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturierung Glühen * Erweiterung </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 Sek. 5 Sek. 20 sec </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Letzte Extension </td><td> 72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min halten </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Radfahren Bedingungen für Pflanzen PCR verwendet in diesem Protokoll. * Die Tm Rechner anoscientific.com / pcrwebtools &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; www.thermoscientific.com / pcrwebtools wird empfohlen, wenn die Bestimmung der Tm für Grundierungen mit Phire Heißstart DNA Polymerase II verwendet werden. Die empfohlene Glühtemperatur für Grundierungen ≤ 20 nt ist gleich der untere Tm durch die webtool gegeben. Für Primer&gt; 20 nt, verwenden eine Glühtemperatur 3 ° C höher als die untere durch die Tm webtool gegeben. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> Komponenten </td><td fo:width=".75in"> 20 ul Reaktionsansatz </td><td fo:width=".75in"> Finale Conc. </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> In den 20 ul </td><td></td></tr><tr><td> 2x Phire Tiergewebe PCR Buffer </td><td> 10 ul </td><td> 1x </td></tr><tr><td> Primer A </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> X ul </td><td> 0,5 uM </td></tr><tr><td> Phire Hot Start II DNA Polymerase </td><td> 0,4 ul </td><td></td></tr><tr><td> Sample / Verdünnungsprotokoll </td><td> 1 ul </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Reaktionsbedingungen für Tiergewebe PCR verwendet in diesem Protokoll. <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1in"> Cycle Step </td><td fo:width=".5in"> Temp. </td><td fo:width=".5in"> Zeit </td><td fo:width=".4in"> Cycles </td></tr><tr><td> Initiale Denaturierung </td><td> 98 ° C </td><td> 5 min </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Denaturierung Glühen * Erweiterung </td><td> 98 ° C X ° C 72 ° C </td><td> 5 Sek. 5 Sek. 20 Sek. ≤ 1 kb 20 sec / kb&gt; 1 kb </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Letzte Extension </td><td>72 ° C 4 ° C </td><td> 1 min Halten </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. Radfahren Bedingungen für Tiergewebe PCR in diesem Protokoll verwendet. * Die Tm Rechner an <a href="http://www.thermoscientific.com/pcrwebtools" target="_blank">www.thermoscientific.com / pcrwebtools</a> wird empfohlen, wenn die Bestimmung der Tm für Grundierungen mit Phire Hot Start DNA Polymerase II verwendet werden. Die empfohlene Glühtemperatur für Grundierungen ≤ 20 nt ist gleich dem unteren Tm durch die webtool gegeben. Für Grundierungen&gt; 20 nt, verwenden eine Glühtemperatur 3 ° C höher ist als die untere durch die Tm webtool gegeben. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Direkte PCR-Workflow. Direkte PCR kann mit zwei alternativen Protokollen werden. Im direkten Protokoll eine winzige Menge an Probe wird direkt mit dem PC hinzugefügtR Reaktion. Die Verdünnung Protokoll verwendet eine kurze Vorinkubationsschritt vor der PCR an DNA aus der Probe Material freizusetzen. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Genotypisierung von Arabidopsis-Pflanze Personen mit dCAPS Technik direkt vom Blatt Schläge. A) 2A zeigt das Prinzip der dCAPS Assay durchgeführt. Die Restriktionsstelle innerhalb des SNP von Interesse entweder eingeführt oder entfernt wird durch PCR unter Verwendung eines Primers mit einer oder mehreren Fehlanpassungen der Ziel-DNA. Die PCR-Produkte werden verdaut und die resultierenden Fragmente offenbaren des Genotyps jedes einzelnen, wenn sie durch Elektrophorese analysiert. B) 0,50 mm Stempeln aus Pflanzenblättern direkt wurden in 50 ul PCR-Reaktionen platziert. Die 160 bp-PCR-Produkten, die die SNP-Stelle (G oder A-Allel) wurden mit Primer Einführen eines einzigartigen SspI Ort an der A-Allel amplifiziert. Die ungereinigten PCR-Produkte waren VerdauungTed mit SspI Restriktionsenzym. Erhaltenen Fragmente wurden auf einem 3% Agarosegel analysiert. Spur M ist der Größenmarker; Fahrspuren A und G den SNP-Allelen von jeder Probe entsprechen. Die erhaltenen Ergebnisse wurden durch herkömmliche Analyse der DNA-Extraktion durch PCR und Restriktionsverdau (Daten nicht gezeigt), gefolgt bestätigt. Die negative Kontrolle Reaktionen ohne Template-DNA wurden im Test einzurichten enthalten und auf einem separaten Agarosegel parallel zu den eigentlichen PCR-Reaktionen, bevor Sie die Aufschlüsse (Daten nicht gezeigt). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/3844/3844fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Verdünnungsprotokoll Verwendung Eichenblatt Proben. Die Verdünnung Protokoll wurde verwendet, um das 297 bp-Fragment von Chloroplasten-DNA in Eiche Blattproben (3-Punkt-Protokoll, Annealing bei 62 ° C) in verschiedenen Verdünnungen zu amplifizieren (1:100, 1:10, 1 : 1 und 2:1) und positiven und negativen conKontrollen [C +: Positivkontrolle aus gereinigte DNA (Arabidopsis), C-: negative Kontrolle ohne Template-DNA]. Die Probe Nomenklatur stellt die Probenentnahme vor Ort (Städte in Finnland) und die Probe Nummerierung. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Genotypisierung von transgenen Mäusen, die mit einem Primerpaar mit der Verdünnung Protokoll. Ear Geweben aus neun einzelnen Mäusen (Bahnen 1-9) wurden in 20 ul Verdünnungspuffer einschließlich DNARelease Additiv platziert. Nach Inkubationen bei Raumtemperatur und 98 ° C, 1 ul Überstand wurde als Matrize in der PCR-Reaktion 20 ul verwendet. Fragment Größen: 1.500 bp (transgene) und 200 bp (Wildtyp). <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. Proben, die nach der Verdünnung Protokoll sind langfristig lagerstabil. Proben Mäuseohr Geweben waren inc.<html> ubated in 20 ul Verdünnungspuffer einschließlich DNARelease Additive und einer wiederholtes Einfrieren / Auftauen (Spur 1), bei -20 ° C für ein Jahr (Spur 2) gespeichert, oder sofort verwendet für die PCR (Spur 3). Die amplifizierte Fragment Größen waren 900 bp, 1500 bp und 3.200 bp. <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Phire Tiergewebe Direkte PCR Kit übertrifft eine kommerzielle DNA-Aufreinigung mit einem hot start Taq DNA Polymerase kombiniert. Vier Amplikons (0.5-1.5 kb) aus Maus-Ohr Geweben unter Verwendung der Verdünnung Protokoll Phire Tiergewebe Direkte PCR Kit wurden verstärkt. Zum Vergleich wurde DNA zunächst unter Verwendung eines handelsüblichen DNA-Extraktions-Kits und die gleichen Fragmente wurden amplifiziert unter Verwendung einer Hot-Start-Taq DNA-Polymerase gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Nur mit dem Phire Tiergewebe Direkte PCR Kit waren alle vier Amplikons erfolgreich verstärkt. t &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3844/3844fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Universal-Vergleich der Workflow mit Schätzung der Zeiten / konsumierten Reagenzien. Thermo Scientific Direkte PCR Ansatz zur DNA-Isolierung Ansatz, der Extraktionspuffer Ansatz und die PCR-Puffer Ansatz verglichen. Die geschätzte Zeit für jeden Ansatz vor der PCR-Schritt wird in roter Schrift angezeigt. Die Thermo Scientific Direkte PCR-Ansatz dauert nur 0-4 min für die Probenvorbereitung vor PCR. Unter jedem Verfahren werden die verbrauchten Reagenzien aufgeführt. Die Thermo Scientific Direkte PCR-Ansatz verwendet die geringste Menge von Reagenzien im Vergleich zu den anderen Methoden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3844/3844fig7large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> .

<ol><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemical+Bulletin%22%5BJournal%5D)">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19, 11-15 (1987).</li>
<li>Kim, C. S., Lee, C. H., Shin, J. S., Chung, Y. S., Hyung, N. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+isolation+of+high+quality+genomic+DNA+from+fruit+trees+and+conifers+using+PVP%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for isolation of high quality genomic DNA from fruit trees and conifers using PVP.</a> Nucleic Acids Research. 25, 1085-1086 (1997).</li>
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Produktion und den freien Zugang zu diesem Artikel wird von Thermo Fisher Scientific, Inc. gesponsert

Der direkte PCR-Ansatz hier gezeigt ermöglicht PCR-Amplifikation direkt von kleinen Mengen von ungereinigten Proben, wodurch die benötigte Zeit und vereinfacht den Workflow für pflanzliche und tierische Genotypisierung (Abbildung 7). Auch hier gezeigt, ist die Verwendung des Verdünnungs-Protokoll in Verbindung mit der direkten PCR Ansatz (Abbildung 3). Die Verdünnung Protokoll wird mit schwierigen Proben (z. B. ältere Blätter der Pflanze, Pflanzenarten, die störenden Verbindungen enthalten) oder mit langen (oder GC-reich) Amplikons empfohlen. Dieses Protokoll ist besonders nützlich, wenn ein neues PCR-Experiment Direkte, so dass für die Optimierung der Reaktion. Das Protokoll kann als Werkzeug zur gelegentlichen Schwierigkeiten wie geringe Ausbeuten aufgrund der Unterschiede in Gewebematerial und / oder Primer verwendet adressieren dienen. Darüber hinaus, wenn Sie mehrere Reaktionen aus der gleichen Probe, die Verwendung von der Verdünnung Protokoll gewährleistet die gesamte Probe nicht in einer verbrauchtenReaktion. Um DNA aus Pflanzen für die PCR zu reinigen, war die Konvention zur Zelllyse durch DNA-Isolierung mit verschiedenen Komponenten, die potenziell mit PCR-Analyse 8 stören könnten folgen durchzuführen. Für besonders anspruchsvolle Pflanzen mit hohem Gehalt an phenolischen Substanzen, Zusatz von Polyvinylpyrrolidon wurde traditionell verwendet, um die Verbindungen, die an DNA binden nach Zelllyse 2,5 entfernen. Wie hier deutlich, können diese komplizierte, zeitaufwendige Schritte durch Verwendung des Phire Plant Direct PCR Kit, um die Ziel-DNA zu erkennen vermieden werden. Zell-Lyse und DNA-Isolierung Schritte können ausgelassen mit empfindlicher dCAPS Techniken direkt aus Arabidopsis-Pflanze Blätter (Abbildung 2). Wie hier gezeigt, die Verdünnung Protokoll verwaltet effektiv das Vorhandensein von Komponenten, die mit problematischen PCR (Abbildung 3) eingreifen können. Traditionell war eine Voraussetzung für die Tier-Genotypisierung isolatiauf genomischer DNA aus tierischem Gewebe durch einen toxischen, zeitaufwändiger Prozess durch einen langwierigen Inkubation mit Proteinase K bis Haut und Bindegewebe, durch organische Lösungsmittelextraktion, Alkoholfällung und Zentrifugationsschritte 6,9,10 gefolgt verdauen charakterisiert. Wie hier gezeigt, wird eine Vereinfachung des Prozesses, bei Verwendung des Phire Tiergewebe Direkt PCR Kit erzielt, so dass transgene Mäuse ohne vorherige DNA-Reinigung (Abb. 4) genotypisiert werden. Das Beispiel in diesem Artikel gezeigt wird besonders schwierig, da nur ein Primer für die Amplifikation von zwei Fragmenten wurde mit einer großen Größenunterschied verwendet. Trotz des Protokolls angeborenen Schwierigkeit der Direct PCR-Ansatz in Verbindung mit der einfachen Verdünnungsprotokoll in hohen Ausbeuten der beiden PCR-Produkte (Abb. 4) führte zu verwenden. PCR-basierte Target-DNA-Nachweis hat viele Anwendungen in Forschung, einschließlich der Analyse des Genotyps zu identifizierendie Rollen von Genen in Entwicklung, Physiologie und Krankheiten. Aufgrund der Toleranz Inhibitor der spezialisierten DNA-Polymerasen können die Protokolle in kürzester Zeit ohne vorherige DNA-Aufreinigung erfolgen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Phire Plant Direct PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-130 </td><td> 200 Reaktionen (50 ul) </td></tr><tr><td> Phire Tiergewebe Direkte PCR Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-140 </td><td> 200 reations (50 ul) </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,35 mm (pink) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-180S / L </td><td> Menge: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Uni-Core 0,50 mm (blau) </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-185S / L </td><td> Menge: 5/25 </td></tr><tr><td> Harris Schneidematte 6,4 × 7,6 cm </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> F-190 </td><td> Menge: 5 </td></tr><tr><td> SspI </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> ER0771 </td><td> 100 ul (100 Reaktionen) </td></tr><tr><td> Piko 24-Well Thermal Cycler </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> TCP0024 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Well Piko PCR Plates </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SLP0241 </td><td></td></tr><tr><td> GeneJET PCR Purification Kit </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> K0701 K0702 </td><td> 50 preps 250 preps </td></tr></tbody></table>

genotypisierung von pflanzen und tieren proben ohne vorherige dna-aufreinigung

Genotyping of Plant and Animal Samples without Prior DNA Purification

Die Direct PCR Ansatz erleichtert PCR-Amplifikation direkt von kleinen Mengen von ungereinigten Proben, und wird hier seit mehreren pflanzlichen und tierischen Geweben (Abbildung 1) gezeigt. Direkte PCR wird auf speziell dazu entworfen Thermo Scientific Phusion und Phire DNA-Polymerasen, die eine Doppelstrang-DNA-Bindungsdomäne, die ihnen einzigartige Eigenschaften, wie hohe Toleranz von Inhibitoren umfassen basiert. PCR-basierte Target-DNA-Nachweis hat zahlreiche Anwendungen in der Pflanzenforschung, einschließlich Pflanzen Genotyp-Analyse und Verifikation von Transgenen. PCR aus Pflanzengeweben traditionell beinhaltet eine erste DNA-Isolierung Schritt, die teuer oder toxischen Reagenzien erfordern. Das Verfahren ist zeitaufwendig und erhöht das Risiko der Kreuzkontamination 1, 2. Umgekehrt, indem Thermo Scientific Phire Plant Direct PCR Kit die Ziel-DNA kann leicht erkannt werden, ohne vorherige DNA-Extraktion. In dem Modell hier gezeigt, einBeispiel abgeleitet gespalten verstärkt polymorphe Sequenzanalyse (dCAPS) 3,4 direkt aus Arabidopsis-Pflanze Blätter durchgeführt. dCAPS Genotypisierung Assays können verwendet werden, um single nucleotide polymorphisms (SNPs) von SNP-Allel-spezifische Restriktionsendonukleaseverdau 3 zu identifizieren. Einige pflanzliche Proben sind in der Regel schwieriger, wenn mit Direct PCR-Methoden, wie sie Komponenten, die mit PCR stören, wie Phenol-Verbindungen enthalten. In diesen Fällen ist ein zusätzlicher Schritt, um die Verbindungen zu entfernen traditionell 2,5 erforderlich. Hier wird dieses Problem durch eine schnelle und einfache Verdünnung Protokoll Direkte PCR-Amplifikation (Abbildung 1), gefolgt überwinden. Fünfzehn Jahre alte Eiche Blätter werden als Modell für anspruchsvolle Anlagen eingesetzt, wie die Probe enthält hohe Mengen an phenolischen Verbindungen, einschließlich Tanninen. Gentransfer in Mäusen ist breit verwendet, um die Rolle von Genen bei entwickelte studierenpment, Physiologie und Erkrankungen des Menschen. Die Verwendung dieser Tiere erfordert Screenen auf die Anwesenheit des Transgens, üblicherweise mit PCR. Traditionell beinhaltet dies eine zeitaufwendige DNA Isolation Schritt, währenddessen die DNA für die PCR-Analyse von Ohr, Schwanz oder Zehe Geweben 6,7 gereinigt wird. Allerdings kann mit den Thermo Scientific Phire Tiergewebe Direkte PCR Kit transgenen Mäusen ohne vorherige DNA-Aufreinigung genotypisiert werden. In diesem Protokoll transgenen Maus Genotypisierung wird direkt von Mausohr Gewebe erreicht, wie hier für ein anspruchsvolles Beispiel, wo nur ein Primer für die Amplifikation von zwei Fragmente unterschiedlicher stark in Größe verwendet wird demonstriert.

Die Direct PCR hier vorgestellte Ansatz ermöglicht PCR-Amplifikation direkt von kleinen Mengen von ungereinigten pflanzlichen und tierischen Gewebe.

Genotypisierung von Pflanzen und Tieren Proben ohne vorherige DNA-Aufreinigung

Der Direct-PCR-Ansatz ermöglicht die PCR-Amplifikation direkt aus geringen Mengen nicht aufgereinigter Proben und wird hier für verschiedene Pflanzen und ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos besteht darin, drei Beispiele der PCR-Amplifikation direkt aus geringen Mengen ungereinigter Proben zu demonstrieren, einschließlich pflanzlichen und tierischen Geweben. Die direkte PCR kann mithilfe zweier alternativer Protokolle durchgeführt werden. Bei dem direkten Protokoll wird eine winzige Menge an unreinigter Probe direkt der PCR-Reaktion hinzugefügt, während das Verdünnungsprotokoll einen kurzen Vorinkubationsschritt vor der PCR erfordert, um die DNA aus dem Probenmaterial freizusetzen.Im ersten Beispiel wird die Genotypisierung von Arabidopsis mithilfe des direkten Protokolls durchgeführt. Eine allelespezifische Restriktionsstelle wird in die Ziel-DNA eingefügt, und anschließend werden allelespezifische Einzelnukleotid-Polymorphismen nach der Verdauung mit Restriktionsendonukleasen identifiziert. Danach wird das Verdünnungsprotokoll angewendet, um zunächst spezifische DNA-Fragmente aus 15 Jahre alten Eichenblättern zu amplifizieren und anschließend transgene Mäuse direkt aus Mausear-Gewebe zu genotypisieren.In allen drei Beispielen wird die DNA-Amplifikation ohne vorherige Probenaufreinigungsschritte mittels der direkten PCR-Methode erreicht. Der Hauptvorteil der direkten PCR gegenüber den herkömmlichen Methoden besteht darin, dass keine DNA-Extraktions- oder Reinigungsschritte erforderlich sind. Dies führt zu Einsparungen sowohl bei der Zeit als auch bei den Kosten.Beginnen Sie die Analyse abgeleiteter, gespaltener, amplifizierter polymorpher Sequenzen oder den Decaps-Genotypisierungs-Assay, indem Sie zunächst PCR-Ansätze von 20 oder 50 Mikroliter mit dem Plant Direct PCR-Kit gemäß der schriftlichen Anleitung formulieren. Schneiden Sie danach mit dem Harris Uni Unicorn und dem Schneidematte einen 0,50 Millimeter großen Probenauszug aus einem Blatt einer Arabidopsis-Pflanze, wobei Sie den Stanzer festhalten. Drücken Sie die Schneidkante in das Gewebe und drehen Sie den Stanzer vor und zurück.Drücken Sie den Kolben, um die Stanzscheibe in eine PCR-Reaktionsmischung auszuwerfen. Stellen Sie sicher, dass die Probe in die PCR-Lösung fällt und nicht an den beiden Wänden haften bleibt. Um Kreuzkontaminationen im direkten Protokoll zu vermeiden, ist es entscheidend, die richtige Methode zur Reinigung des Probenahmewerkzeugs anzuwenden.Reinigen Sie die Schneidkante des Stanziertools zwischen jeder Probe, indem Sie sie in eine 2%ige Natriumhypochlorit-Lösung tauchen. Drücken Sie den Kolben mehrmals hoch und runter und wischen Sie die Schneidkante mit einem sauberen Papiertuch ab. Die Schneidematte sollte zwischen den Proben ebenfalls gespült werden.Anschließend verwenden Sie einen Pico-24-Well-Thermocycler und eine PCR-Platte, um die PCR-Reaktionen unter den in der dem Video beiliegenden Text beschriebenen Zyklenbedingungen durchzuführen. Nach der PCR-Zentrifugation des Pflanzenmaterials übertragen Sie fünf Mikroliter des Überstandes in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen nach Zugabe von vier Mikrolitern Wasser. Geben Sie ein Mikroliter des Restriktionsendonukleases SSP1 hinzu, mischen Sie vorsichtig und zentrifugieren Sie kurz, um den Inhalt am Boden des Röhrchens zu sammeln.Die Reaktionsmischung eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend das Restriktionsenzym durch 20-minütige Inkubation bei 65 Grad Celsius inaktivieren. Nach der Restriktionsenzymverdauung 2,5 Mikroliter 5×-Ladepuffer zur Reaktion hinzufügen.Führen Sie eine Agarose-Gelelektrophorese durch, um die resultierenden Fragmente zu analysieren, indem Sie 10 µL der resultierenden Mischung in das Gel laden. Schneiden Sie zunächst eine zwei Millimeter große Probe aus einem Eichenblatt. Geben Sie die Probe in 20 µL Verdünnungspuffer, der mit dem Plant Direct PCR Kit geliefert wurde.Reinigen Sie die Schneidkante des Stichs und des Schneidemattes wie zuvor, zerkleinern Sie die Blattprobe mit einer 100-Mikroliter-Pipettenspitze, indem Sie sie kurz gegen die Röhrenwand drücken. Zentrifugieren Sie die Proben kurz in einem Mikrozentrifugenröhrchen, bis die Reaktionsansätze am Boden der Röhrchen liegen. Der Überstand kann direkt in der PCR verwendet oder im Verhältnis 1:10 oder 1:100 in sterilem Wasser verdünnt werden.Verwenden Sie je nach Probentyp 0,5 bis 1 Mikroliter des Überstandes oder der Verdünnung als Vorlage für eine 20-Mikroliter-PCR-Reaktion. Richten Sie die Reaktionen gemäß der schriftlichen Anleitung ein. Führen Sie nach der Vorbereitung der Reaktionen die PCR-Reaktionen mit dem PICO 24-Well-Thermocycler und der PCR-Platte unter Verwendung der im Text beschriebenen Zyklenbedingungen durch.Nach der PCR fünf Mikroliter eines 5x-Ladepuffers zur Reaktion hinzufügen und eine Agarose-Gelelektrophorese mit 15 Mikrolitern des resultierenden Gemischs durchführen. Beginnen Sie das Verdünnungsprotokoll zur Genotypisierung transgener Mäuse, indem Sie eine zwei Millimeter große Gewebeprobe aus der Mausohr in 20 Mikroliter Verdünnungspuffer mit 0,5 Mikroliter DNA-Freisetzungszusatz, der dem Kit für tierisches Gewebe beiliegt, geben. Inkubieren Sie die Proben mit dem Direct-PCR-Kit bei Raumtemperatur für zwei Minuten, gefolgt von einer zweiminütigen Inkubation bei 98 Grad Celsius.Nach der Zentrifugation der Proben verwenden Sie ein Mikroliter Überstand als Vorlage für eine 20-Mikroliter-PCR-Reaktion. Überstand, der nicht sofort verwendet wird, kann in ein neues Röhrchen überführt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Als letzter Schritt werden der 24-Loch-Thermocycler und die PCR-Platte verwendet, um die PCR-Reaktionen unter den im schriftlichen Verfahren aufgeführten Zyklenbedingungen durchzuführen. Nach der PCR fügen Sie fünf Mikroliter eines 5x-Ladepuffers zur Reaktion hinzu und führen eine Agarose-Gelelektrophorese mit 15 Mikrolitern des resultierenden Gemischs nach der D-Caps-Technik durch. Die Restriktionsstelle innerhalb des betreffenden SNPs wird entweder eingeführt oder zerstört, indem ein PCR-Primer mit einem oder mehreren Basenpaar-Mismatches zur Ziel-DNA verwendet wird.In diesem Beispiel wurden die 160 Basenpaare langen PCR-Produkte, die die SNP-Stelle des Interesses mit dem g- oder a-Allel im Arabidopsis-Genom enthalten, aus Pflanzenblattproben mit dem FirePlant Direct PCR Kit amplifiziert. Der vorwärts gerichtete Primer enthielt eine Fehlanpassung am 3'-Ende, wodurch eine für SS P1 spezifische Restriktionsstelle in der Ziel-DNA erzeugt wurde, die das A-Allel, jedoch nicht das andere Allel des SNP, enthielt. Die nicht gereinigten PCR-Produkte wurden mit dem SS P1-Restriktionsenzym digeriert, und die resultierenden Fragmente wurden in einem Agarosegel analysiert. Die Gelen g und a entsprechen den SNP-Allelen jeder Probe.In diesem Bild befinden sich die intakten PCR-Produkte links und die digerierten Fragmente rechts. Verdünnungsprotokolle sind bei anspruchsvollem Pflanzenmaterial wie Eichenblatt aufgrund der hohen Konzentration an phenolischen Verbindungen erforderlich, wobei das hier beschriebene Verdünnungsprotokoll angewendet wird. Das 297 Basenpaare lange Fragment der Chloroplasten-DNA wurde mit einem Dreischritt-Protokoll amplifiziert.Eichenblattproben mit unterschiedlicher Verdünnung werden zusätzlich zu positiven und negativen Kontrollen gezeigt. Mit dem Direct-PCR-Kit für Tiergewebe wurde die Amplifikation von zwei Fragmenten mit großem Größenunterschied unter Verwendung nur eines Primer-Satzes durchgeführt, wobei reichliche Mengen beider korrekt dimensionierter Produkte entstanden: 1500 Basenpaare für transgene Mäuse und 200 Basenpaare für Wildtyp-Mäuse. Die schwächere obere Bande bei heterozygoten Mäusen resultiert aus der Konkurrenz beider Matrizen um denselben Primeransatz.Jedoch sind die Genotypisierungsergebnisse eindeutig. Die Stabilität der mittels Verdünnungsprotokoll hergestellten Proben wurde ebenfalls getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass verdünnte Proben, die wiederholten Einfrier- und Auftauzyklen ausgesetzt waren, sowie Proben, die mindestens ein Jahr bei minus 20 Grad Celsius gelagert wurden, vergleichbar waren mit Proben, die unmittelbar für die PCR verwendet wurden. Um die Leistungsfähigkeit dieses Verfahrens weiter zu überprüfen, wurden vier Amplikone aus Mausohrgewebe unter Verwendung des Verdünnungsprotokolls des Fire-Animal-Tissue-Direct-PCR-Kits amplifiziert.Zum Vergleich wurde DNA zunächst mithilfe eines kommerziellen DNA-Extraktionskits gereinigt, und die gleichen Fragmente wurden mit einer Hot-Start-Taq-DNA-Polymerase gemäß den Herstellerempfehlungen amplifiziert. Nur mit dem Fire-Animal-Tissue-Direct-PCR-Kit wurden alle vier Amplikone erfolgreich amplifiziert. Die Direkte-PCR ist besonders nützlich in Genotypisierungsstudien, die die Amplifikation einer großen Anzahl von Proben erfordern. Das Auslassen des DNA-Reinigungsschritts kann die für das Experiment benötigte Zeit erheblich verkürzen. Die Methode bietet zusätzliche Vorteile, indem sie das Kontaminationsrisiko verringert und wertvolles Probenmaterial schont.

genotyping-of-plant-and-animal-samples-without-prior-dna-purification

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