Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Die Multiphotonenmikroskopie von fixiertem Gewebe ist normalerweise auf geringe Eindringtiefen von nur wenigen hundert Mikrometern begrenzt. Kürzlich konnten wir erstmals die Anwendung der Multiphotonenmikroskopie bis in Tiefen von mehreren Millimetern in fixierten Mausorganen nach optischer Klärung mit einer Lösung aus Benzylalkohol und Benzoylbenzoat demonstrieren. In unserer ersten Demonstration bildete die Technik die intrinsische Gewebefluoreszenz ab.

Jedoch besteht ein wachsendes Interesse daran, optische Klärmethoden bei Gewebe zu verwenden, das fluoreszierende Proteine wie GFP exprimiert. Hier stellen wir ein Protokoll für die Multiphotonenmikroskopie von geklärtem Hirngewebe mit derselben Benzylalkohollösung vor, die die Fluoreszenz des gelben fluoreszierenden Proteins, das im Oberschenkel exprimiert wird, erhält. Ein Promotor im Maushirn ermöglicht die hochauflösende Ganzorganabbildung von Mäusen mittels Multiphotonenmikroskopie, die durch die optische Klärung des Organs vor der Bildgebung ohne Klärung ermöglicht wird. Multiphotonen.

Die Bildgebung des Gehirns ist auf 300 Mikrometer unterhalb der Gewebeoberfläche begrenzt, da Streueffekte des Lichts durch die unterschiedlichen Brechungsindizes von Wasser und den Proteinen, aus denen das Gehirngewebe besteht, verursacht werden. Um diese Einschränkung zu überwinden, wird das Organ entwässert und das Wasser durch eine Flüssigkeit ersetzt, die einen ähnlichen Brechungsindex wie die Proteine des Gewebes aufweist. Dieser Prozess der optischen Klärung trägt dazu bei, die Lichtstreuung erheblich zu verringern und ermöglicht eine verbesserte Bildgebung in größeren Tiefen unterhalb der Gewebeoberfläche.

Bilder von Batta et al. zeigen, wie diese Technik zur Betrachtung der Histologie verschiedener Mausorgane unter Verwendung intrinsischer Fluoreszenz und der zweiten harmonischen Generierung angewendet werden kann. Dieses erste Bild zeigt den Mäusetestikel, aufgenommen 1,4 Millimeter unterhalb der Gewebeoberfläche. Die hohe Auflösung der Multiphotonenmikroskopie ermöglicht es uns, heranzuzoomen und einen klaren Blick auf die einzelnen sich in den seminiferen Tubuli bildenden Spermienzellen zu erhalten.

Wie ganz rechts zu sehen ist, zeigen wir ein Bild der Mauslunge, das ebenfalls 1,4 Millimeter unterhalb der Gewebeoberfläche aufgenommen wurde. Dieses Bild veranschaulicht eine zweikanalige Multiphotonen-Aufnahme, bei der die Elastinbestandteile rot und das Kollagen grün markiert sind; bei einer Vergrößerung sind einzelne Alveolen leicht zu unterscheiden. Schließlich zeigen wir hochauflösende Bilder der inneren Regionen des Maushirns, die 850 Mikrometer unterhalb der Gewebeoberfläche aufgenommen wurden. Durch eine Vergrößerung des Neokortex und Hippocampus des Gehirns sind einzelne Astrozyten und Neuronenzellkörper deutlich erkennbar.

Jedoch erhält das optische Klärprotokoll von Badra bei optisch geklärten Organen, die fluoreszierende Proteine wie YFP enthalten können, das fluoreszierende Signal dieser fluoreszierenden Proteine überhaupt nicht. Das hier vorgestellte Protokoll stellt eine neuartige Methode dar, um die vollständige optische Klärung und Abbildung ganzer Organe von Mäusen durchzuführen und gleichzeitig das fluoreszierende Signal von YFP und Neuronen zu bewahren, indem das Gehirn mit einer abgestuften Ethanolreihe dehydriert und mit einer 1:2-Lösung aus Benzylalkohol und Benzolat, auch bekannt als BAB, geklärt wird, was sich als wirksam erwiesen hat, um Schäden an den fluoreszierenden Proteinen zu reduzieren und deren fluoreszierendes Signal zu erhalten. Für die Multiphotonen-Bildgebung werden zunächst YFP-Mäuse gewogen und anschließend mittels intraperitonealer Injektion von Ketamin-Xylazin anästhesiert.

Ein chirurgischer Narkosegrad muss vor dem Eingriff bestätigt werden. Das Tier sollte alle fünf Minuten überprüft werden, um festzustellen, ob es auf einen kräftigen Zehen- oder Schwanzdruck reagiert. Reagiert das Tier, ist eine zusätzliche Dosis Ketamin-Xylazin erforderlich.

Nach der Anästhesie werden die Mäuse durch Befestigung jedes Gliedes mit Laborband an einem Operationsbett so fixiert, dass sich die Maus in Rückenlage befindet und ihre Brust für den Eingriff freiliegt. Zunächst wird ein Schnitt unterhalb des Xiphoidfortsatzes gesetzt, um entlang der Basis des Brustkorbs einen weiteren Schnitt anzulegen. Dabei werden Schere und Pinzette verwendet, um die Haut während des Schneidens zurückzuziehen. Anschließend werden zwei Schnitte entlang beider Seiten des Brustbeins der Maus ausgeführt, um eine Gewebeklappe zu bilden, die mit einer Hämостaseklemme von der Brusthöhle weggehalten wird, sodass das Herz freiliegt. Danach wird eine 23-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens eingeführt und ein kleiner Schnitt in die Muskelwand des rechten Vorhofs gemacht, um dem Blut einen Abfluss zu ermöglichen. Unmittelbar nach dem Öffnen des rechten Vorhofs wird eine Perfusion mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei vier Grad Celsius begonnen, bis kein Blut mehr aus dem rechten Vorhof austritt.

Während der Perfusion wird eine peristaltische Pumpe verwendet, die so eingestellt ist, dass die Flüssigkeit 3,8 bis 5 cm von der Nadelöffnung entfernt ausgestoßen wird. Sobald das gesamte Blut abgeleitet ist, wird das Perfusionsmedium auf eine 4 %ige Paraformaldehydlösung bei vier Grad Celsius umgestellt, bis der Körper der Maus spürbar starr und steif wird. Nach der Perfusion wird die Maus vom Operationsfeld genommen und enthauptet, um die Entfernung des Gehirns mit einer Pinzette und einer Iris-Schere zu beginnen.

Der Schädel wird in kleinen Abschnitten beginnend am Hinterhaupt und in Richtung Schädelfront fortschreitend entfernt. Mit der Schere werden alle zwei bis vier Millimeter kleine Schnitte über den Schädel geführt, während die Pinzette verwendet wird, um vorsichtig das Knochenmaterial in kleinen Stücken vom Gehirn zu lösen; dies wird durchgeführt, bis die gesamte Oberfläche des Gehirns freigelegt ist. Anschließend wird das Gehirn mit einem chirurgischen Spatel aus dem Schädel entfernt und in ein Glasgefäß mit 4 % Paraformaldehyd zur Fixierung für sechs Stunden gegeben.

Während wir uns bei dieser Demonstration hauptsächlich auf die Bildgebung des YFP-exprimierenden Maushirns konzentrieren, werden wir zusätzlich eine Maus optisch klären, ein Hinterbein präparieren und einen Abschnitt des Dünndarms schneiden, um die Klarungseigenschaften dieses Verfahrens optimal zu veranschaulichen. Nach der Postfixierung werden das Gehirn und die anderen Gewebe zweimal in PBS gewaschen. Anschließend werden die Gewebeproben bei Raumtemperatur durch eine Reihe von Inkubationen in Ethanol in steigenden Konzentrationen von 50 %, 70 %, 90 % und 100 % entwässert.

Jede Inkubation dauert zwei Stunden und anschließend eine weitere. Eine Inkubation mit 100 % Ethanol über 12 Stunden dient der effizienten Entfernung des Wassers aus dem fixierten Gewebe. Nach der Dehydrierung wird die letzte 100 %ige Ethanol-Lösung abgegossen, und die Gewebeproben werden zwei Stunden lang in einer 1:1-Lösung aus Ethanol und BAB getaucht, bevor sie in eine 100 %ige BAB-Klärungslösung überführt werden.

Einmal in BAB werden das Gehirn und andere Gewebeproben innerhalb von vier bis fünf Stunden deutlich transparent. Hier zeigen wir ein Zeitraffervideo der ersten sechs Stunden des optischen Klärprozesses. Die Sprungmarke kennzeichnet den Zeitpunkt, zu dem die eins-zu-eins-Lösung aus Ethanol und BAB durch eine 100 %ige BAB-Lösung ersetzt wurde.

Nach sechs Stunden zeigen alle Organe Anzeichen von Transparenz, beispielsweise ist nun der Knochen im Hinterbein der Maus für optimale Klärungsergebnisse deutlich sichtbar. Das Gehirn sollte sechs Tage lang bei Raumtemperatur im Dunkeln vor hellem Licht geschützt geklärt werden. Sobald das Gehirn geklärt und zur Bildgebung bereit ist, wird es mit Sano-Acryl oder Superkleber an der Unterseite der Petrischale befestigt.

Nachdem der Kleber getrocknet ist, wird das Gehirn in BAB eingetaucht und die Petrischale unter das Objektiv zur Bildgebung platziert. Für die Bildgebung verwenden wir ein Multiphotonenmikroskop mit einem MI-Tie-Titansaphir-Laser, der eine anpassbare Anregungswellenlänge zwischen 710 und 990 Nanometern aufweist. Die Anregungswellenlänge, die wir zur Erzeugung von YFP-Signalen verwenden, beträgt 886 Nanometer.

Das reflektierte fluoreszierende Signal wird anschließend mit einem 5x-Objektiv von NIKon aufgenommen, das eine Abbildung mit großem Sichtfeld ermöglicht. Das reflektierte fluoreszierende Signal wird mithilfe eines Bandpassfilters mit 535/50 nm gefiltert und mit einem Detektor hoher Quantenausbeute gesammelt. Multiplier 2 von OMA Matsu-Bildern wird mit der ScanImage-Software bei einer Auflösung von 2048 × 2048 Pixeln und einer Scanrate von zwei Millisekunden pro Zeile verarbeitet, um hochauflösende YFP-Bilder zu erzeugen.

Nach Abschluss der Bildgebung wird das Gehirn aus der P-two-Schale entnommen und in BAB bei Lichtabschirmung für zukünftige Bildgebungsverfahren aufbewahrt. Die hier gezeigten repräsentativen Bilder und Videos demonstrieren die hochauflösende Multiphotonen-Bildgebung, die durch optische Klärung ermöglicht wird. Die Ganzgehirn-Bildgebung erlaubt es, YFP-markierte Neuronen in den verschiedenen Schichten des Hippocampus und der Neokortex bis zu einer Tiefe von zwei Millimetern unterhalb der Gewebeoberfläche deutlich sichtbar zu machen.

Hier zeigen wir ein Video eines 1,2 Millimeter dicken Bildstapels eines gesamten Mundbodens, der 0,8 bis zwei Millimeter tief ins Gehirn hinein aufgenommen wurde, um die verschiedenen anatomischen Schichten des Hippocampus sichtbar zu machen. Im Folgenden ist ein repräsentatives Bild eines koronaren Schnitts 1,94 Millimeter posterior zu Bergman dargestellt, das aus dem zwei Millimeter tiefen Bildstapel entnommen wurde, in dem die verschiedenen Schichten des Hippocampus beschriftet wurden. Durch eine Vergrößerung des Neokortex sind die einzelnen Axone und die Zellkörper der Neuronen der Schicht fünf der peralen Neuronen des Neokortex bis zu 1,02 Millimeter unterhalb der Gewebeoberfläche deutlich unterscheidbar.

Hier zeigen wir einen Bildstapel von Neuronen der Schicht fünf, der zwischen 700 und 1020 Mikrometern unterhalb der Gewebeoberfläche aufgenommen wurde. Das Folgende ist ein repräsentatives Bild aus diesem Stapel, das 774 Mikrometer tief im Gehirn aufgenommen wurde. Mithilfe desselben Bildstapels wurde eine 3D-Rekonstruktion des Neuronengebiets mit der Image-J-Software erstellt.

Die hohe Auflösungsfähigkeit der Multiboten-Mikroskopie ermöglicht es uns auch, Bilder ganzer einzelner Neuronen darzustellen. Hier zeigen wir eine Rekonstruktion eines Neurons der fünften Schicht der Neokortex, bei dem D genetische Prozesse deutlich sichtbar sind. Damit schließen wir unsere Darstellung der optischen Klärung und der gesamten Mausprobe, die YFP exprimiert, ab.

Die Durchführung dieser Technik ist relativ einfach und, wie wir gezeigt haben, zur Betrachtung und Abbildung zahlreicher verschiedener Regionen und Strukturen der Mausverletzung geeignet. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg.