Einsatz von künstlichen Sputum Mittlere bis antibiotische Wirkung gegen die getestet

Das Ziel dieses Experiments besteht darin, die Wirksamkeit von Antibiotika gegen Pseudomonas-Aeruginosa-Biofilme unter Bedingungen zu bewerten, die chronischen Infektionen in der Lunge von Patienten mit zystischer Fibrose entsprechen, wobei ein definiertes künstliches Sputummedium verwendet wird. Bakterielle Biofilme werden in 24-Loch-Mikrotiterplatten kultiviert.

Die Biofilme werden anschließend Antibiotika ausgesetzt. Danach werden die antibiotikabehandelten Kulturen mit Cellulase aufgelöst und mit einem metabolischen Farbstoff namens Srin inkubiert, der durch vitale Zellen von blau nach rosa reduziert wird. Durch die Messung der Extinktion der Vertiefungen kann die minimale hemmende Konzentration von Biofilm-Cecile-Zellen (B-S-M-I-C) bestimmt werden, um die Antibiotikasuszeptibilität unter nahezu physiologischen Bedingungen zu quantifizieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Bestimmung minimaler Hemmkonzentrationen basierend auf planktonischen Kulturen, liegt darin, dass die Bakterien in einem speziellen Medium gezüchtet werden, das alle Bestandteile von Sputum enthält und somit die Biofilmbildung fördert. Diese Biofilme sind gegenüber Antibiotika weitaus resistenter. Um das Medium herzustellen, bereiten Sie zunächst zwei Flaschen vor, wobei die erste Flasche 250 Milliliter steriles Wasser enthält.

Gegeben Sie langsam unter Rühren vier Gramm Fischsperma-DNA zu 250 Milliliter steriler Wasser hinzu. Rühren Sie die Lösung bei Raumtemperatur und lassen Sie die DNA im zweiten Gefäß auflösen. Fügen Sie anschließend langsam fünf Gramm Typ-2-Mucin aus Schweinemagen hinzu und rühren Sie erneut.

Nachdem die DNA- und Mucin-Lösungen bereit sind, lösen Sie die Aminosäuren in 100 Milliliter steriler Wasser auf, mit Ausnahme von L-Tyrosin und L-Cystein, die jeweils in 25 Milliliter Wasser oder 25 Milliliter 0,5-molarer Kaliumhydroxidlösung gelöst werden sollten. Anschließend lösen Sie 5,9 Milligramm DTPA, fünf Gramm Natriumchlorid und 2,2 Gramm Kaliumchlorid in 100 Milliliter Wasser auf. Geben Sie alle verschiedenen Lösungen in eine Ein-Liter-Flasche, fügen Sie fünf Milliliter Eigelbemulsion hinzu und ergänzen Sie die Mischung mit Wasser bis auf 850 Milliliter auf.

Unter Verwendung von einem molar Triss wird der pH-Wert auf 6,9 eingestellt und das Endvolumen mit Wasser auf einen Liter aufgefüllt. Um das Medium zu sterilisieren, wird es unter Verwendung einer Vakuumpumpe des Typs Vacuum Brand ME2 und einer Millipore-Sterilfiltereinheit mit 45 Millimeter Hals und einer Porengröße von 0,2 Mikron filtriert. Der Filtrationsvorgang kann über zwei Tage durchgeführt werden. Das ASM-Medium kann bis zu einem Monat bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Beginnen Sie damit, Übernachtkulturen von Pseudomona arosa in LB-Medium zu verdünnen, um einen OD-Wert von 0,05 zu erhalten. Verdünnen Sie die Bakterien anschließend im Verhältnis 1 zu 100 in SM-Medium; geben Sie 1,8 Milliliter der verdünnten Bakterienkultur in 21 Vertiefungen einer 24-Loch-Gewebekulturplatte und pipettieren Sie das gleiche Volumen an SM-Medium in die drei verbleibenden Vertiefungen, die als leere negative Kontrollen dienen. Verschließen Sie die 24-Loch-Platte mit Biofilm und stellen Sie sie unter mikroaerophile Bedingungen, um die Biofilmbildung zu ermöglichen. Diese Bedingungen können mithilfe von Campi-Gen-Gasgenerierungsbeuteln in großen anaeroben Gefäßen erzeugt werden.

Inkubieren Sie die Kultur drei Tage lang auf einem Schüttler bei 75 U/min und 37 Grad Celsius. Nach drei Tagen bilden sich Biofilme als gallertartige Masse mit Bakterienzellen, die sich nicht durch Pipettieren aufbrechen lassen. Sobald die Biofilme gebildet sind, geben Sie 200 Mikroliter pro Vertiefung Antibiotikum in seriell verdünnten Konzentrationen hinzu. Stellen Sie sicher, dass für jede zu testende Wirkstoffkonzentration mindestens vierfache Wiederholungen eingerichtet werden, und belassen Sie vier Vertiefungen mit Biofilmen unbehandelt, sodass sie als negative Kontrollen dienen können.

Anschließend die Platten nach der Inkubation mit Antibiotika weitere 24 Stunden vorinkubieren. Zur Auflösung der Biofilme jeweils 100 Mikroliter pro Vertiefung Cellulase verwenden, das in Citratpuffer auf eine Konzentration von 100 Milligramm pro Milliliter verdünnt wurde. Die Platten eine Stunde lang auf einem Schüttler bei 150 U/min unter aeroben Bedingungen bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dieser Inkubation kann manuelles Pipettieren eingesetzt werden, um die Biofilme weiter aufzulösen, falls Zellklumpen im Medium sichtbar sind.

Fügen Sie anschließend 100 µL Rezin pro Vertiefung hinzu, um die Vitalität der aus den Biofilmen freigesetzten Zellen zu quantifizieren, und inkubieren Sie die Zellen eine bis zwei Stunden lang. Bei 37 °C sind nur lebensfähige Zellen in der Lage, den blauen Zarin-Farbstoff in seine rosa fluoreszierende Form zu metabolisieren. Nach der Inkubation überführen Sie die Proben in eine 96-Vertiefungs-Platte und messen die Fluoreszenz der Vertiefungen mit einer Anregungswellenlänge von 540 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm.

Um die bakterielle Vitalität und Arzneimittelanfälligkeit zu quantifizieren, subtrahieren Sie zunächst die Hintergrundfluoreszenz der Leerprobe von den anderen Vertiefungen. Berechnen Sie anschließend die prozentuale Hemmung, indem Sie die mittlere Fluoreszenz jeder Konzentration durch die mittlere Fluoreszenz der unbehandelten Kontrollen dividieren und mit 100 multiplizieren. Die B-S-M-Y-C ist als die Antibiotikakonzentration definiert, die eine 90 %ige Hemmung der metabolischen Aktivität bewirkt, wie in diesen Elektronenmikrografien gezeigt; Zellen, die in Biofilmen wachsen, unterscheiden sich erheblich von Bakterien, die in planktischen Kulturen gezüchtet werden.

Insbesondere umgeben große Mengen an extrazellulärer Matrix, dargestellt in Gelb, die Zellen im Biofilm in Grün, jedoch nicht in planktonischen Kolonien. Außerdem sind Bakterien in Biofilmen in diesem Experiment typischerweise resistenter gegenüber Antibiotika. Die minimale Hemmkonzentration von Tobramycin für die planktonische Kultur von Pseudomonas aeruginosa in Blau betrug etwa vier Mikrogramm pro Milliliter.

Im Gegensatz dazu, wie rot dargestellt, überlebten 100 % der Bakterien in Biofilmen bis zu einer Konzentration von 512 Mikrogramm pro Milliliter Antibiotikum. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Bakterien in einem definierten, künstlichen Sputum-Medium kultiviert. Außerdem sollten Sie in der Lage sein, einen Antibiotikaresistenztest durchzuführen, um die minimale Hemmkonzentration zu bestimmen, die erforderlich ist, um das Bakterienwachstum unter Bedingungen zu hemmen, die der Umgebung in der Lunge von Patienten mit Mukoviszidose realistischer ähneln.