Odorant-induzierten Reaktionen aus olfaktorischen Rezeptor-Neuronen mit der Saugpipette Technik aufgenommen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, geruchsstoffinduzierte Antworten von olfaktorischen Rezeptorneuronen der Maus aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst das olfaktorische Epithel präpariert und die olfaktorischen Rezeptorneuronen der Maus isoliert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die isolierten olfaktorischen Rezeptorneuronen in eine Ableitkammer zu geben, die auf einem inversen Mikroskop montiert ist.

Mikromanipulatoren halten die Ableitelektrode und einen Lösungsumschalter. Saugen Sie anschließend ein identifiziertes olfaktorisches Rezeptorneuron in die Spitze einer Saugpipettenelektrode. Der letzte Schritt besteht darin, die Pipette mit dem angesaugten Zell in ihrer Spitze vor dem Lösungsumschalter zu platzieren, um das Neuron Geruchsstoffen auszusetzen.

Schließlich wird die Saugpipetten-Aufzeichnungsmethode verwendet, um die Funktion olfaktorischer Rezeptorneuronen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Ganzzell-Spannungsclamp-Technik besteht darin, dass sie lange Aufzeichnungsdauern mit schnellen und präzisen Lösungswechseln ermöglicht. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Form der Aufzeichnungspipette wichtig ist und das stabile Platzieren der Sinneszellen in der Pipettenspitze schwer zu erlernen ist.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Mikropipette aus einer UNFI-Glaskapillare aus borosilikatischem Glas in einer Mikropipettenziehvorrichtung mit langem Übergang ziehen. Übertragen Sie anschließend die Pipette in einen speziell angefertigten Mikropipettenhalter, der auf einem aufrechten Mikroskop montiert ist. Das Mikroskop verfügt über ein Fadenkreuz im Okular und ein bewegliches Diamantmesser, das am Objekttisch befestigt ist.

Als Nächstes beobachten Sie die Pipettenspitze unter dem 20×-Objektiv. Verwenden Sie das Rotlicht als Leitfaden. Ritzen Sie die Pipette vorsichtig im 90-Grad-Winkel mit dem speziell angefertigten Diamantmesser am Außendurchmesser der Pipette von 10 Mikrometern ein.

Bewegen Sie das Diamantmesser weiter in Richtung der Spitze. Üben Sie allmählich Druck darauf aus. Die Pipettenspitze sollte sauber an der Stelle abbrechen, an der sie eingeritzt wurde.

Danach unter einem 40x-Objektiv die Pipettenspitze mit einem elektrisch beheizten Heizfaden auf einen Innendurchmesser von fünf Mikrometern anspitzen. Sobald dies abgeschlossen ist, ist die Mikropipette bereit, um Ströme aus den Maus-ORNs aufzuzeichnen. Im nächsten Schritt wird eine Maus getötet und ihr Kopf entfernt.

Danach die Haut über dem Schädel ablösen und anschließend den Kopf entlang der Mittellinie teilen. Danach die beiden Hemi-Köpfe auf ein Stereomikroskop für die Dissektion übertragen. Das Nasenseptum entfernen und die Riechmuscheln herausnehmen.

Legen Sie das Gewebe in eine Petrischale mit Glukose enthaltender Ringer-Lösung für Säugetiere. Danach wird das Riechepithel von dem zugrundeliegenden Knorpel zweier Conchae abgeschält. Überführen Sie das Gewebe in ein Eppendorf-Röhrchen, das 250 Mikroliter Ringer-Lösung enthält.

Danach das verbleibende Gewebe für später bei vier Grad Celsius lagern. Vortexen Sie das EOR-Röhrchen, das das Riechepithel enthält, zweimal kurz für jeweils eine Sekunde bei mittlerer Geschwindigkeit. Dieser Schritt führt zur mechanischen Dissoziation der NS aus dem Epithel.

Als Nächstes die Ringlösung, die die dissoziierten ORNs enthalten, in die Aufzeichnungskammer geben, die am Mikroskop befestigt ist, und mithilfe einer feinen Pinzette die großen Gewebestücke in der Suspension entfernen. Die ORNs 20 Minuten lang sedimentieren lassen, bevor die kontinuierliche Perfusionszufuhr mit Ringlösung begonnen wird und die Aufzeichnungen in diesem Verfahren durchgeführt werden; füllen Sie in der Zwischenzeit die Pipette mit Ringlösung. Setzen Sie die Pipette in den Pipettenhalter ein und befestigen Sie den Halter am Kopfstückverstärker des Patch-Clamp-Verstärkers.

Verbinden Sie als Nächstes die Ölleitung mit dem Seitenanschluss des Pipettenhalters. Senken Sie anschließend die Pipette in die Aufzeichnungskammer ab. Regulieren Sie die Höhe des Ölreservoirs, um einen leicht positiven Druck an der Pipettenspitze einzustellen.

Dies kann beobachtet werden, indem man verfolgt, wie sich Zelltrümmer vom Pipettenspitze weg oder in Richtung Pipettenspitze bewegen. Vermeiden Sie es, die Pipettenspitze mit Zelltrümmern zu kontaminieren. Danach durchsuchen Sie die Aufnahmekammer nach einer isolierten olfaktorischen Rezeptorneuron (ORN), die an ihrer typischen bipolaren Morphologie bei einer Vergrößerung von 20 bis 40 x erkannt werden kann.

Bewegen Sie dann die Ableitelektrode in unmittelbare Nähe des Zellkörpers der Riechsinnesneuronen (ORN). Saugen Sie vorsichtig an der mit dem Öltank verbundenen Luftleitung, sodass der Zellkörper in die Pipettenspitze eindringt. Setzen Sie das Absaugen vorsichtig und langsam fort, bis der gesamte Zellkörper in die Spitze der Saugpipette gezogen ist und Dendrit sowie Zilien der Badlösung ausgesetzt bleiben.

Bewegen Sie die Saugpipette von dem Abschnitt mit den sedimentierten ORNs zum Aufzeichnungsabschnitt der Kammer. Platzieren Sie die Saugpipette vorsichtig vor dem dreilumigen Rohr für den Lösungsaustausch. Die Saugpipette sollte nahe genug an der Öffnung des dreilumigen Rohrs positioniert werden, sodass der ORN eine laminare Strömung ausgesetzt ist und somit Mischungsturbulenz vermieden wird. Um den Lösungsaustausch durchzuführen, bewegen Sie die Grenzfläche zwischen den parallelen Strömungssträngen aus dem dreilumigen Rohr des Lösungswechslers über die Spitze der Saugpipette, um die Qualität und Zuverlässigkeit des Lösungsaustauschs zu überwachen.

Der Stromfluss an der Übergangsstelle, der durch das Bewegen der Zelle zwischen Lösungen unterschiedlicher Ionenzusammensetzung hervorgerufen wird, kann gemessen werden. Der zeitliche Verlauf des Lösungsaustauschs liegt typischerweise bei etwa 20 Millisekunden. Wenn das olfaktorische Rezeptorneuron in eine Duftstofflösung überführt wird, kann hier eine Duftstoff-antwort ausgelöst werden.

Eine ORN wurde wie durch den Balken über der Aufzeichnung angegeben für eine Sekunde einer Konzentration von hundert Mikromolar Eugenol ausgesetzt. Im oberen Panel wurde der Rezeptorstrom mit einer Bandbreite von null bis 50 Hertz gefiltert, um ausschließlich den Rezeptorstrom darzustellen. Im unteren Panel zeigt dieselbe Aufzeichnung, gefiltert mit einer breiten Bandbreite von null bis 5.000 Hertz, zusätzlich die Aktionspotentiale. Hier sind die Dosis-Wirkungs-Kurven einer auf Eugenol reagierenden ORN. Eugenol wurde in Konzentrationen von 0,3 Mikromolar bis hundert Mikromolar verwendet.

Die Reizdauer betrug eine Sekunde, und die Aufzeichnungen wurden von null bis 50 Hertz gefiltert. Eine schrittweise Erhöhung der Duftstoffkonzentration führte zu einer stärkeren und schneller ansteigenden Antwort, die zudem langsamer endete. Sobald die Duftstoffexposition beendet war, können ORNs bei langen Stimulationsphasen mit mittleren Duftstoffkonzentrationen ein oszillatorisches Antwortmuster zeigen.

Hier wurde ein auf Acetophenon ansprechendes olfaktorisches Rezeptorneuron acht Sekunden lang stimuliert. Nach einem schnellen und vorübergehenden Aktivitätsmaximum zu Beginn der Stimulation sind eine Reihe kleinerer, wiederkehrender Antworten zu beobachten. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die olfaktorischen Rezeptorneuronen sorgfältig zu behandeln und sehr geduldig zu sein.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.