MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Expressionsmengen von Mikro-RNA-Molekülen in Prostatakarzinom- und normalem Prostatagewebe mittels quantitativer Echtzeit-PCR zu bestimmen. Dazu wird zunächst Gesamt-RNA aus Prostatageweben extrahiert. Diese enthält Mr NA Mikro-RNA sowie andere kleine RNAs.

Anschließend wird die RNA revers transkribiert, um cDNA zu erzeugen. Danach wird eine mit Cyber Green basierte Echtzeit-PCR unter Verwendung der cDNA als Vorlage durchgeführt, um die Amplifikation und Quantifizierung der Mikro-RNA-Expression in Echtzeit zu ermöglichen. Es werden Ergebnisse erhalten, die die relative Expression von Mikro-RNAs in verschiedenen Prostatabproben basierend auf der quantitativen Echtzeit-PCR zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden liegt in ihrer hohen Empfindlichkeit, Genauigkeit, Reproduzierbarkeit sowie in ihrer Schnelligkeit und Kosteneffizienz. Diese Methode kann verwendet werden, um zentrale Fragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, da die Expression von microRNAs oft mit Genen korreliert, die maßgeblich am Krebsprozess beteiligt sind. Daher können wir mittels QPCR die Expression von microRNAs bestimmen und untersuchen, wie diese mit klinischen Variablen zusammenhängt.

Diese Biomarker könnten möglicherweise sowohl als diagnostische als auch als prognostische Werkzeuge eingesetzt werden. Sie könnten uns helfen, Prostatakrebs zu diagnostizieren, und uns dabei unterstützen, welche Prostatakarzinome aggressiv sind. Darüber hinaus besteht das Potenzial, dass diese Biomarker therapeutische Wirkstoffe darstellen könnten.

Diese Methode kann nicht nur Einblicke in die Entstehung von Prostatatumoren liefern, sondern auch auf andere Krebserkrankungen und Krankheiten angewendet werden. Sammeln Sie Proben der Prostata zum Zeitpunkt der Exstirpation und orientieren Sie die Probe mithilfe anatomischer Orientierungspunkte. Färben Sie die Prostata und die Samenbläschen wie folgt: rechte Seite grün, linke Seite blau.

Entnehmen Sie einen zufälligen Querschnitt in der Mitte des Gewebes senkrecht zur Rektaloberfläche, frieren Sie die Probe ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Machen Sie eine Kopie und orientieren Sie die Schnitte der Proben, um sie anschließend in vier gleiche Teile zu teilen. Konsultieren Sie einen Pathologen, um Tumor- und Normalbereiche auf dem entsprechenden Bild zu unterscheiden.

Verwenden Sie die markierten Bereiche als Leitfaden, um Tumorgewebe zur RNA-Extraktion zur Isolierung von RNA zu identifizieren. Legen Sie gefrorene Prostataproben auf Trockeneis und orientieren Sie sich an der markierten Kopie. Schneiden Sie einen kleinen Teil des Prostatatumors aus.

Homogenisieren Sie das Prostatatumorgewebe in einem Milliliter Triol-Reagenz. Inkubieren Sie die homogenisierten Proben fünf Minuten lang. Geben Sie bei Raumtemperatur 0,2 Milliliter Chloroform zu den Proben hinzu und schütteln Sie sie 15 Sekunden lang kräftig.

Inkubieren Sie die Proben drei Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann 15 Minuten bei 12.000 × g und vier Grad Celsius. Überführen Sie die farblose obere wässrige Phase in frische Röhrchen und geben Sie 0,5 Milliliter Isopropanol hinzu. Inkubieren Sie die Proben 10 Minuten bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie dann 10 Minuten bei 12.000 × g und vier Grad Celsius.

Den Überstand vorsichtig abpipettieren, ohne den Pellet mit der RNA zu stören. Einen Milliliter 75 %iges Ethanol zum RNA-Pellet geben, die Probe vortexen und durch Zentrifugation fünf Minuten bei 7.500 × g und 4 °C pelletieren. Den Überstand erneut abpipettieren und den RNA-Pellet fünf bis zehn Minuten trocknen, wobei darauf zu achten ist, dass er nicht vollständig austrocknet.

Rötlich, lösen Sie das Pellet in nukleasefreiem Wasser auf und verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Konzentration der RNA zu messen. Überprüfen Sie die Qualität und Integrität der RNA-Proben mithilfe eines Bioanalyzer. Transkribieren Sie die RNA mittels eines Reverse-Transkriptionskits gemäß den Herstelleranweisungen in cDNA um.

Um eine Standardkurve zu erzeugen, bereiten Sie eine Reihe von Verdünnungen der ursprünglichen CD-NA aus einer Probe vor, von der bekannt ist, dass sie eine starke Expression des Gens von Interesse aufweist. Führen Sie die Echtzeit-PCR durch, indem Sie einen Master-Mix basierend auf einem Reaktionsvolumen von 20 Mikroliter mit zwei x quant herstellen. Detektieren Sie den Cyber-Green-PCR-Master-Mix 10 x Microscript-Universalprimer, 10 x Microscript-Primer-Assay und RNase-freies Wasser.

Verwenden Sie zwei Primer-Sets, eines für das Zielgen und ein weiteres für das Referenzgen, in diesem Fall RNU six B. Pipettieren Sie zwei Mikroliter jeder cDNA-Verdünnung in einzelne Kapillarröhrchen für den Light Cycler und geben Sie 18 Mikroliter der Master-Mix-Lösung hinzu. Zentrifugieren Sie mithilfe eines Kapillaradapters. Platzieren Sie die Kapillaren in einen kapillarbasierenden Echtzeit-Cycler und führen Sie das PCR-Programm wie folgt durch: 95 Grad Celsius für 15 Minuten, gefolgt von 50 Zyklen mit 94 Grad Celsius für 15 Sekunden.

55 Grad Celsius für 30 Sekunden und 70 Grad Celsius. Wählen Sie für 30 Sekunden eine Probe als Kalibrator aus und setzen Sie deren normalisierte Zielmenge auf eins. Vergleichen Sie die relative Expression der Mikro-RNA in allen anderen Proben mit der des Kalibrators, um Amplifikationskurven zu erzeugen.

Verwenden Sie für die PCR-Reaktionen die molekularbiologische Software LightCycler, Version 3.5, im Quantifizierungs-Tab. Quantifizieren Sie die Reaktionen und exportieren Sie die Daten in eine Textdatei. Importieren Sie die Daten in die REL-Quant-Analyse-Software, um die Quantifizierungsergebnisse zu generieren.

Importieren Sie separate Dateien für das Zielgen, das Referenzgen und die Standardkurvendaten. Geben Sie die Position des Kalibrators für sowohl das Zielgen als auch das Referenzgen sowie die Positionen der Proben an. Die Daten werden als Verhältnis des Zielgens zum Referenzgen verschiedener Proben, dividiert durch das Verhältnis des Zielgens zum Referenzgen des Kalibrators, ausgedrückt.

Verwenden Sie die zuvor für ein bestimmtes mikro-RNA- und Housekeeping-Gen erstellte Standardkurve als Referenzstandard zur Extrapolation quantitativer Daten für mikro-RNA-Zielstrukturen mit unbekannten Konzentrationen. Analysieren Sie drei Proben als Gruppe und berechnen Sie die mittleren Konzentrationen sowie die Standardabweichungen der Triplicate.

Falls eine der Triplikate nicht mit dem Rest der Serie übereinstimmt, schließt das Programm diese aus. Gezeigt ist hier ein Beispiel einer A-Q-P-C-R-Analyse von Proben der Prostata. Die Graphen zeigen, dass die Expression des Referenzgens U sechs beginnend exponentielle Verstärkung bei etwa Zyklus 20 aufweist, während die Expression des Zielgens MIR 98 eine verzögerte Verstärkung um Zyklus 25 zeigt.

Die Daten dieses Experiments wurden als Textdatei exportiert und mit Requ-Analysesoftware analysiert, wobei die Positionen der Kapillaren, die den Kalibrator und die Proben enthalten, angegeben wurden. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie bei ordnungsgemäßer Durchführung an einem Tag durchgeführt werden. Die Zuverlässigkeit dieser Technik hängt von der Qualität der RNA ab.

Daher ist es wichtig, bei der Handhabung von RNA besondere Vorsicht walten zu lassen, da sie sehr leicht abbauen kann.