Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, schnell eine Population von GR1-positiv angereicherten Leukozyten zu erzeugen, die lebensfähige, myeloide suppressorische Zellen oder MDSCs aus Mausmilzen enthalten, die für in-vivo- und in-vitro-Assays verwendet werden können. Zunächst werden Milzen mehrerer Mäuse gesammelt und verarbeitet, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen. Um den Anteil der MDSCs vor der Anreicherung zu quantifizieren, wird eine kleine Aliquotprobe der gesammelten Zellen in eine 96-Well-V-Boden-Platte überführt.

Die Oberflächenantigene MAC eins und GR eins werden markiert, und die markierten Zellen werden in FACS-Röhrchen zur Durchflusszytometrie überführt. Die verbleibenden gepoolten Leukozyten werden mit einem fluorochromkonjugierten Antikörper gegen GR eins gefärbt und anschließend mit magnetischen Mikroperlen inkubiert, die an das Fluorochrom auf dem Anti-GR-eins-Antikörper binden. Die GR-eins-positiven und GR-eins-negativen Populationen werden dann mithilfe eines AutoMax-pro-Separators getrennt, um den Erfolg der GR-eins-Anreicherung der Population zu überprüfen.

Ein kleiner Aliquot wird entnommen und auf die Expression von GR1 und MAC1 analysiert, um die Prozentsätze von MDSCs zu bewerten. Der Vergleich der resultierenden Immunphänotypisierungsdaten zeigt eine Zunahme der MDSC-Prozentsätze in der GR1-angereicherten Leukozytenpopulation im Vergleich zur nicht angereicherten Population. Zusätzlich ergibt sich eine Zunahme an naiven MDSCs, wodurch eine Population entsteht, die den MDSCs aus tumortragenden Organismen vergleichbar ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der konventionellen Durchflussfärbung und der auf Hochgeschwindigkeits-Durchflusszytometrie basierenden Sortierung von m DSCs aus lymphatischen Geweben liegt darin, dass unsere Master-Mix-Technik signifikante Variationen in unseren Ergebnissen verhindert, indem sie eine gleichmäßige Oberflächenfärbung der Pool-Leukozyten sowie die Vortypisierung und die AutoMax-Sortierung von m DSCs bzw. GR-1-positiven Zellen sicherstellt. Die Verfahren werden Nadine Nelson, eine Doktorandin aus unserem Labor, und Dr. Haw sra, Leiterin der USF-Durchflusszytometrie-Einrichtung, demonstrieren. Das folgende Verfahren sollte unter sterilen Bedingungen in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, wobei Zellen und Antikörper auf Eis gehalten werden müssen.

Montieren Sie das Zelldissoziationssieb nach Möglichkeit, indem Sie den Netzfilter in die Öffnung des Bechers in Richtung Boden einsetzen. Setzen Sie dann den Sicherungsring in den Gewindebereich mit der geschlitzten Seite nach oben ein und verwenden Sie den Ringschlüssel, um den Sicherungsring festzuziehen und den Filter zu befestigen. Stellen Sie das montierte Sieb in eine Petrischale, die 10 Milliliter einer XPBS-Pool-Lösung enthält.

Milzen, die von sechs bis acht Wochen alten tumortragenden oder naiven Kontrollmäusen der C57BL/6-Zuchtlinie entnommen wurden, auf das Siebraster des Zelldissoziationsiebs geben. Anschließend die Milzen mit einem Glasstößel durch das Siebraster in die Petrischale zerreiben. Diesen Vorgang für jede Behandlungsgruppe von Mäusen wiederholen.

Als Nächstes wird die Zellsuspension mit einer fünf Milliliter umfassenden serologischen Pipette auf einen 70-Mikrometer-Zellsieb aufgetragen und in ein 50-Milliliter-Konischgefäß filtrieren gelassen. Anschließend wird fünf Minuten bei 250 bis 300 × g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt, und das Pellet wird durch Zugabe von fünf Milliliter RBC-Lysepuffer pro Milz und mehrmaliges Auf- und Abpipettieren resuspendiert. Die Probe wird fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wird die Reaktion durch Zugabe von 20 Milliliter PBS und mehrmaliges kräftiges Auf- und Abpipettieren gestoppt.

Anschließend nach Entfernung des Überstandes bei 250 bis 300 × g für fünf Minuten zentrifugieren, das Pellet in 20 Milliliter steriler PBS resuspendieren und die Zellen zählen. Die Zellen mit Trypanblau und einem Hämozytometer zählen und in 3 %iger Färbelösung auf eine Konzentration von 1 × 10⁷ bis 2 × 10⁷ Zellen pro Milliliter resuspendieren. Die Erzielung einer optimalen Färbung ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens.

Dies kann erfolgreich durchgeführt werden, indem Antikörper vorab titriert werden. Verwenden Sie vorbereitete Master-Mischungen und Oberflächenfärbungen in kleinen Volumina, wie in diesem Protokoll beschrieben. Um die Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse zu färben, beschriften Sie die Vertiefungen einer 96-Well-VBO-Platte für Kontroll- und Experimentalsproben sowie Einzelfärbungen.

Fügen Sie für die Kompensationskontrollen fünf mal 10 hoch 5 bis eine mal 10 hoch 6 Zellen in 50 Mikrolitern in jede der markierten Vertiefungen hinzu. Zentrifugieren Sie danach die Platte bei 250 bis 300 × g für fünf Minuten nach der Zentrifugation. Betrachten Sie die Platte von unten.

Blicken Sie nach oben, um sicherzustellen, dass sich Pellets in den Vertiefungen befinden, und bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung aus der Maus-BDFC-Blocklösung vor, die aus monoklonalem Ratten-Anti-Maus-CD16/32-Antikörper, verdünnt in 3 % Färbe-Medium, in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis durch Vortexen besteht. Zentrifugieren Sie dann kurz für fünf Sekunden, wobei Sie die 96-Loch-V-Boden-Platte über einem Abfallbehälter oder Waschbecken halten. Drehen Sie die Platte anschließend schnell auf die Rückseite und wieder zurück, um den Überstand zu entfernen, ohne die Zellpellets zu stören.

Anschließend 50 Mikroliter der FC-Block-Master-Mix zu allen Pellets in der 96-Well-V-Boden-Platte hinzufügen und vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mischen. Die Platte auf Eis stellen und 15 Minuten im Dunkeln inkubieren, dann die Platte bei 250 bis 300 × g für fünf Minuten zentrifugieren. Eine Master-Mix-Lösung aus Mac-1-Fitzy- und GR-1-A-PC-Antikörpern, verdünnt in 3 % Staining Medium, in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis vorbereiten.

Vortexen Sie kurz und zentrifugieren Sie fünf Sekunden lang. Nach dem Zentrifugieren drehen Sie die Platte um, um das Überstandsvolumen aus jedem Well zu entfernen, und geben Sie dann 50 µL der Antikörpermischung zu den Kontroll- oder Experimentalkügelchen hinzu. Mischen Sie gründlich, indem Sie vorsichtig mehrmals auf- und abpipettieren. Für einfache Färbungen zur Kompensation geben Sie 50 µL verdünntes MAC-1-FcγRI-A-PC oder DAPI in 3 % Färbe-Medium in die entsprechenden Wells. Für die unbehandelte Kontrolle geben Sie 50 µL 3 % Färbe-Medium in das entsprechende Well und mischen Sie es gut.

Anschließend die Platte 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubieren. Während der Inkubation FACS-Röhrchen entsprechend den Vertiefungen der Platte beschriften und 200 µL 3 %iges Färbemittel in jedes FACS-Röhrchen geben. Nach Ablauf der 30-minütigen Inkubationszeit die Platte fünf Minuten bei 250 bis 300 ×g zentrifugieren.

Nach dem Zentrifugieren die Überstände wie zuvor entfernen. Anschließend die Pellets waschen, indem 100 Mikroliter 3 %iger Färbelösung zu jedem Pellet gegeben werden. Gut durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mischen.

Zentrifugieren Sie die Platte erneut fünf Minuten lang. Wiederholen Sie den Waschschritt nach dem Zentrifugieren einmal mehr, entfernen Sie das Überstand wie zuvor und resuspendieren Sie jedes Pellet in 100 Mikrolitern 3 %iger Färbelösung und mischen Sie gründlich. Überführen Sie anschließend 100 Mikroliter der resuspendierten Zellen aus jedem Wells der Platte in die jeweils beschrifteten FACS-Röhrchen.

Fügen Sie anschließend 75 Nanogramm pro Milliliter DPI zu den Kontroll- und Versuchsproben sowie zur DPI-Einzelmarkierungskompensationskontrolle hinzu. Nehmen Sie die zytometrischen Daten auf, um die MDSC-Prozentsätze zu bestimmen, wie in dem begleitenden Dokument beschrieben. Im Anschluss bereichern Sie GR-1-positive Leukozyten, indem Sie eine Portion von 1 × 10⁷ der verbleibenden unmarkierten Leukozyten in angemessen beschriftete FACS-Röhrchen geben und fünf Minuten bei 250 bis 300 × g zentrifugieren. Geben Sie 50 Mikroliter einer 1:10-Verdünnung des GR-1-PE-Antikörpers in Max-Puffer hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.

Nach der Inkubation zwei Milliliter Max-Puffer zu jedem FAX-Röhrchen hinzufügen und fünf Minuten bei 250 bis 300 × g zentrifugieren. Nach dem Zentrifugieren das Überstand entfernen. Anschließend 200 Mikroliter einer 1:4-Verdünnung von Anti-PE-Mikroperlen im Max-Puffer zu jedem Röhrchen geben und 15 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln inkubieren.

Geben Sie zwei Milliliter Max-Puffer zu den Fax-Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten bei 250 bis 300 ×g. Resuspendieren Sie dann das Pellet in drei Milliliter Färbe-Puffer und filtrieren Sie es durch einen 70 µm-Filter in ein neues beschriftetes 50-Milliliter-Konischrohr. Bei diesem Protokoll verwenden wir die automatische magnetische Trennung.

Die magnetische Trennung ist eine hervorragende Methode. Wenn Sie eine große Anzahl von Zellen schnell und kostengünstig sowie basierend auf einem Oberflächenmarker trennen müssen, stellen Sie sicher, dass Sie Ihre Ergebnisse am Ende mittels Durchflusszytometrie überprüfen. Um den AutoMax pro Separator vorzubereiten und einzurichten, vergewissern Sie sich, dass alle Flaschen mit den entsprechenden Lösungen gefüllt sind.

Schalten Sie das Gerät ein. Überprüfen Sie danach nach der Initialisierung den Status der Flüssigkeitsbehälter und Säulen. Alle Symbole sollten grün sein.

Wählen Sie als Nächstes im Menü die Option „Separation“ aus der oberen Menüleiste und danach „Wash“. Wählen Sie anschließend in der unteren Menüleiste die Option „Rinse“ aus dem Popup-Menü und danach „Run“, um den Spülvorgang zu starten. Sobald der Spülvorgang erfolgreich abgeschlossen ist, zeigt das Gerät an, dass es bereit für die Separation ist.

Unter dem Statusmenü stellen Sie den 50-Milliliter-Konikalzylinder mit magnetisch markierten Zellen in Reihe A eines entsprechend dimensionierten gekühlten Zylinderschranks. Danach stellen Sie einen 50-Milliliter-Konikalzylinder zur Sammlung der negativen Fraktion in Reihe B und einen 15-Milliliter-Konikalzylinder zur Sammlung der positiven Fraktion in Reihe C. Wählen Sie das POS-Zell-S-Zellseparationsprogramm für die positive Selektion markierter Zielzellen im empfindlichen Modus aus Proben. Sobald das Programm beginnt, werden die magnetisch markierten Zielzellen in der AutoMax-Säule zurückgehalten, während die unmarkierten Zellen in den Sammelzylinder für die negative Fraktion in Reihe B abgegeben werden. Anschließend wird der Magnet zurückgezogen, und die markierten Zielzellen werden in den Sammelzylinder für die positive Fraktion in Reihe C des Zylinderschranks freigesetzt.

Nach der Anreicherung verwenden Sie Trypanblau und ein Hämozytometer, um die GR1-positiven und GR1-negativen Fraktionen erneut zu zählen. Resuspendieren Sie die Zellen dann in einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen pro Milliliter bis 2 × 10⁷ Zellen pro Milliliter in 3 % Anfärbmedium und überführen Sie 50 µL in entsprechend beschriftete FACS-Röhrchen. Färben Sie die Zellen mit MAC1 und der DPI-Vitalitätsfärbung für die Durchflusszytometrie sowie für Einzelfärbungskompensationen.

Führen Sie die datenmäßige Erfassung per Durchflusszytometrie durch, um die Anteile der GR1-positiven und GR1-negativen Zellen zu bestimmen und außerdem die Anteile der MDSCs vor und nach der AutoMax-Anreicherung zu vergleichen. Milzen wurden von Mäusen mit Pankreastumor und von naiven Mäusen entnommen und wie in diesem Videoartikel beschrieben zu Einzelzell-Suspensionen verarbeitet. Die Durchflusszytometrie wurde durchgeführt, um naive Leukozyten zu untersuchen, die mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper gegen MAC1 und GR1 an der Oberfläche gefärbt wurden, wie hier gezeigt. Vor der AutoMax-Anreicherung ist nur ein sehr geringer Anteil – 1,19 % – der naiven, MAC1- und GR1-positiven MDSCs sichtbar. Nach der Anreicherung der GR1-positiven Population ist dieser Zellsubpopulation jedoch deutlich größer – 10,5 % von naiven Tieren – und nun vergleichbar mit 25,3 % von tumortragenden Mäusen.

Mit dieser Methode können weitere Verfahren wie die beschleunigte MDSC-Analyse, die auf Durchflusszytometrie basierende Sortierung in vivo, Adoptivtransferexperimente, quantitative Echtzeit-PCR und Western Blotting durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den molekularen Mechanismen, die für die Expansion, Migration, Differenzierung von MDSCs sowie deren Hemmung der Immunantworten verantwortlich sind, zu beantworten.