Name: Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Lernen Sie die Isolierung myeloider Suppressorzellen aus Mäusemilzen mittels Durchflusszytometrie und AutoMACS-Zellsortierung. Diese Methode ermöglicht die Anreicherung lebensfähiger Gr-1-positiver Leukozyten für in-vivo- und in-vitro-Studien.

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Wir erkennen die USF Durchflusszytometrie Core Facility. Wir möchten Dr. Denise Cooper für den Austausch von Ressourcen zu danken. Wir möchten auch Maya Cohen, Laura Pendleton und Diana Latour für ihre Unterstützung danken, bei der Einrichtung und der Dreharbeiten zu diesem Film. NN von der NSF FG-LSAMP Brücke zur Promotion Fellowship HRD # 0929435 unterstützt. Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society Institutional Research Grant # 93-032-13/Moffitt Cancer Center ausgezeichnet zu TG finanziert.

Vor dem Start, bereiten Sie die folgenden Lösungen: 3% Färbung Media (SM): -3% Fötalem Rinderserum (FBS) in 1X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) MACS-Puffer (MB): - 0,5% Albumin aus Rinderserum (BSA) in 1XPBS 1. Ernte Milz von Mäusen <ol><li> Subkutan injizieren 6-8 Wochen im Alter von C57BL / 6 Mäuse (Harlan) mit 1,5 x 10 5 Panc02 murinen Zellen in 100 ul 1x PBS suspendiert (tumortragenden; TB). Kontrollmäusen (Naive) erhalten 100 ul 1XPBS. </li><li> Etwa 4 Wochen nach der Injektion, einschläfern Mäusen durch Kohlendioxid erstickend wirken. </li><li> Ernte Milz von Mäusen durch stumpfe Dissektion mit einer Pinzette und Schere dann wiegen mit einer Waage. Ort Milz in separaten, etikettiert 50 ml konischen Röhrchen mit 1 x PBS. </li></ol> 2. Generieren Sie ein Einzel-Zell-Federgabeln von Leukozyten aus Milz Alle Verfahren sollten in einer sterilen Umgebung unter einem Biologische Sicherheit Hood und Zellen und Antikörper auf Eis gehalten durchgeführt werden. <ol><li> Montieren Zellabtrennungssiebes durch Einsetzen des Mesh-Sieb in die Öffnung des Bechers nach unten. Dann legen Sie den Sicherungsring in das Gewinde mit der geschlitzten Seite nach oben und mit dem Ring-Taste, um den Haltering ziehen und hält so den Bildschirm an Ort und Stelle. Setzen Sie den montierten Sieb in eine Petrischale mit 10 ml 1 x PBS. </li><li> Pool Milz und Formate Glas Pistill zu Milz gegen die Mesh-Sieb des Zellabtrennungssiebes und in die Petrischale zu schleifen. Wiederholen für jede Behandlung von Mäusen. </li><li> Filter Zellsuspension in einem 50 ml konischen Röhrchen mit einer 70 um Zellsieb und eine 5 ml serologische Pipette. Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. </li><li> Überstand abnehmen und Pellet in 5 ml 1 x RBC Lysispuffer pro Milz. Jeweils oben und unten kräftig. Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Die Reaktion durch Zugabe von 20 ml 1 x PBS. Jeweils oben und unten kräftig. Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. </li><li> Überstand abnehmen und Pellet in 20 ml sterilem 1 x PBS. Jeweils oben und unten kräftig. </li><li> Zählen von Zellen unter Verwendung von Trypanblau und eines Hämozytometers und resuspendieren in gewünschten Konzentration in 3%, so dass SM 50 ul entspricht 5x10 5-1x10 6 Zellen (1x10 7 Zellen / ml - 2x10 7 Zellen / ml). </li></ol> 3. Zelloberflächen-Bemalen / Immunphänotypisierung von MDSC mittels Durchflusszytometrie <ol><li> Beschriften Sie die Vertiefungen einer 96-Well-V Bodenplatte für die Steuerung und experimentellen Proben und einzelne Flecken auf Ersatz Kontrollen (keine Flecken, NS, Mac-1-FITC; Gr-1-APC und DAPI). </li><li> In 5x10 5-1x10 6 Zellen in Höhe von 50 ul / Vertiefung von Splenozyten ihren jeweiligen Vertiefungen in der 96-Well-V-Bodenplatte. ZentrifugierenPlatte bei 12.000 rpm (250-300 × g) für 5 min. </li><li> Bereiten Sie &quot;Master Mix&quot; (MM) der Maus BD FC-Baustein (Ratte anti-Maus-CD16/32 monoklonaler Antikörper) in 3% SM verdünnt, in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Als Ausgangspunkt verwenden 1 pg FC-Baustein in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul, pro Vertiefung. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand aus jeder Vertiefung der 96-Loch-V-Bodenplatte durch schnelles Umdrehen der Platte über und zurück, über einen Abfallbehälter oder ein Waschbecken ohne Störung der Zell-Pellets. </li><li> Vortex, kurz zentrifugieren FC-Baustein MM für 5 Sekunden und 50 ul zu allen Pellets im 96-Well-V-Bodenplatte. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren, so dass Proben in ihre Brunnen. Inkubieren Platte für 15 min im Dunkeln auf Eis. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. </li><li> Bereiten Sie &quot;Master Mix&quot; (MM) von Fluorochrom-konjugierte Antikörper in 3% SM in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis verdünnt, während Proben mit FC-Baustein inkubieren. Antikörper sollten titriert werdenum optimale Verdünnung für Färbeverfahren zu bestimmen. Als Ausgangspunkt, kombinieren eine Verdünnung von 1.25 Mac-1-FITC und 1:20 Verdünnung von Gr-1-APC in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul, pro Probe gut. </li><li> Vorsichtig Überstand zu entfernen aus jeder Vertiefung der 96-Well-V-Boden, wie zuvor beschrieben. </li><li> Vortex, kurz zentrifugieren MM von fluoreszierenden-konjugierte Antikörper-Färbung für 5 Sekunden und 50 ul, die Kontrolle und experimentelle Pellets. Gut mischen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Für Single-Fleck Kompensationen, fügen Sie eine Verdünnung von 1.25 Mac-1-FITC, 1:20 Verdünnung von Gr-1-APC und 75 ng / ml DAPI, in 3% SM für ein Endvolumen von 50 ul pro Well an ihre jeweiligen Brunnen. Dann werden 50 ul 3% auf gut SM ungefärbt (keine Flecken). Gut mischen und inkubieren Zellen in 96-Well-V-Bodenplatte für 30 min im Dunkeln auf Eis. </li><li> Label-FACS-Röhrchen (5 ml, 12 mm x 75 mm Polystyrol Rundbodengefäße) zu jeder Vertiefung in der 96-Well-V-Bodenplatte entsprechen. Geben Sie 200 ul 3% SM zu jedem FACSRohr. </li><li> Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstände entfernen. Waschen Sie Pellets durch Zugabe von 100 ul 3% SM zu jedem Pellet und mischen Sie gut durch leichtes Auf-und Abpipettieren. Zentrifugenplatte bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. Wiederholen Sie Schritt noch einmal zu waschen. </li><li> Vorsichtig Überstand zu entfernen aus jeder Vertiefung der 96-Well-V-Boden, wie zuvor beschrieben. Resuspendieren jedes Pellet in 100 ul 3% SM und gut mischen. </li><li> Übertragen Sie 100 ul resuspendierten Pellets aus jedem Well der 96-Loch-V-Bodenplatte, um ihre jeweils beschriftet FACS-Röhrchen. </li><li> Vor-Zytometrie-Analyse fließen, fügen 75 ng / ml DAPI zu steuern und zu experimentellen Proben und DAPI einzigen Fleck-Kompensation. </li><li> Führen Sie die durchflusszytometrische Erfassung von MDSC Prozentsätze. Führen Ausgleich mit dem negativen (keine Flecken Kontrolle) und die einzige positive Kontrollen. Richten Sie eine Dot-Plot, der die nach vorn (FSC) gegen seitliche Streulicht (SSC) in Log-Skala zeigt, so dass Leukozyten-Populationen vonInteresse identifiziert werden kann. Zeichnen Sie ein großes Tor auf allen Leukozyten, ohne Schmutz und Klümpchen mit niedrigsten Vorwärts-und Seitwärts-Streulicht. Von diesem übergeordneten Tor, erstellen Sie einen neuen Dot-Plot, der SSC gegen DAPI und Tor zeigt auf DAPI-(Live-) Zellen. Wählen Sie diese neu gated Bevölkerung und schaffen eine Dot-Plot, der Mac-1 gegen Gr-1 und Tor zeigt auf Ihrem doppelt positiven (Mac-1 + Gr-1 +) MDSC. </li></ol> 4. Magnetischen Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten <ol><li> Aliquotieren 1x10 7 verbleibenden ungefärbten Leukozyten in entsprechend beschriftete FACS-Röhrchen und zentrifugieren bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min. </li><li> Planen MM von Gr-1-PE-Antikörper in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für bis zu 10 7 Zellen, verwenden Sie eine 1:10 Verdünnung von Gr-1-PE-Antikörper in 50 l MB, pro Probe. Für größere Zellzahlen, bis Volumina entsprechend zu skalieren. Kurz für 5 Sekunden zentrifugiert, in den Leukozyten in FACS-Röhrchen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li&gt; <li> 2 ml MB auf FACS-Röhrchen, Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstand verwerfen. </li><li> Bereiten MM von Anti-PE MicroBeads in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Für bis zu 10 7 Zellen, verwenden Sie ein 1:4-Verdünnung des Anti-PE MicroBeads in 200 ul MB, pro Probe. Für größere Zellzahlen, bis Volumina entsprechend zu skalieren. Kurz für 5 Sekunden zentrifugiert, in den Leukozyten in FACS-Röhrchen und Inkubation für 15 min bei 4 ° C im Dunkeln. </li><li> 2 ml MB auf FACS-Röhrchen, Zentrifuge bei 12.000 rpm (250-300 xg) für 5 min und Überstand verwerfen. Pellet in 3 ml SB. Anschließend wird durch ein 70 um Sieb in eine neue, markierte 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Vorbereiten und grundieren Auto MACS Separator Pro. Refill alle Flaschen mit den entsprechenden Lösungen und leeren die Abfallbehälter, falls erforderlich. Gerät einschalten und prüfen Status der Flüssigkeitsbehälter und Spalte (n) nach der Initialisierung. Alle Symbole sollte grün leuchten. Auf dem Menü wählen Sie &quot;Trennung&quot; von der oberenMenüleiste gefolgt von &quot;Jetzt waschen&quot; aus der unteren Menüleiste. Wählen Sie &quot;Spülen&quot; aus dem Pop-up-Option von &quot;Run&quot;, um die Grundierung zu starten gefolgt. Sobald die Grundierung Prozess erfolgreich abgeschlossen ist, wird das Instrument zeigt dann, dass es &quot;Ready for Separation&quot; unter dem Status-Menü. </li><li> Wählen Sie die passende gekühlt Tube-Rack für Rohrdurchmesser und Platz 50 ml konischen Röhrchen mit magnetisch markierte Zellen in Reihe A, 50 ml konischen Röhrchen für die negative Fraktion Sammlung in Zeile B und 15 ml konischen Röhrchen für die positive Fraktion Sammlung in der Reihe C </li><li> Wählen Sie &quot;POSSEL_S&quot; Zellseparation Programm für die positive Selektion von markierten Zielzellen in sensiblen Modus von Proben. Die magnetisch markierte Zielzellen auf der Säule zurückgehalten Automaten; unmarkierten Zellen in der negativen Fraktion Sammelrohr in der Zeile B. über automatisierte Zurückziehen des Magneten losgelassen wird, die markierten Zielzellen, in die positive Sammelrohr in Reihe C des Rohrs freigegeben Rack. </li></ol>+ Enriched Leukozyten <ol><li> Recount Gr-1 + und Gr-1 - Fraktionen unter Verwendung von Trypanblau und eine Hämazytometer. Die Zellen in der gewünschten Konzentration in 3% Färbung Medium, so daß 50 ul entspricht 5x10 5-1x10 6 Zellen (1x10 7 Zellen / ml - 2x10 7 Zellen / ml) zugefügt und 50 ul entsprechend markierten FACS-Röhrchen. </li><li> Vorbereiten einer MM von Mac-1 nur bei 1:25 Verdünnung in 3% SM auf ein Endvolumen von 50 ul pro Probe. Stain Zellen und bereiten einzigen Fleck Kompensationen von Gr-PE, Mac-1 FITC und DAPI für die Durchflusszytometrie-Analyse. Geben Sie 200 ul 3% SM und DAPI Lebensfähigkeit Farbstoff wie zuvor beschrieben. </li><li> Führen durchflusszytometrische Datenerfassung bis Gr-1 + und Gr-1 zu bestimmen - und Prozentsätze zu vergleiche auch MDSC Prozentsätze Pre-und Post-autoMACS Bereicherung. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Hier zeigen wir r<html> epräsentativer Ergebnisse für autoMACS Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten aus gepoolten, naiv Milz für die anschließende FACS-Sortierung von MDSC (Abbildung 1). 1x10 6 naiv Leukozyten wurden mit Mac-1-FITC und Gr-1-APC-Antikörpern gefärbt, um MDSC Prozentsätze mit einem BD LSRII Instrument zu identifizieren, vor autoMACS Sortierung. 1x10 7 naiven Leukozyten wurden dann mit Anti-Gr-1-PE und PE-Antikörper MicroBeads zur Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten unter Verwendung eines autoMACS Pro Separator gefärbt. Post-autoMACS Bereicherung, Gr-1 Prozentsätze in Gr-1 + und Gr-1 - gesammelten Fraktionen wurden mittels Durchflusszytometrie. 1x10 6 Gr-1 + Leukozyten wurden entfernt und mit Mac-1-FITC-Antikörper zu analysieren und zu vergleichen, MDSC Prozentsätze von angereichertem, vereinigt naiven Leukozyten an nicht-angereicherten, Tumor-tragenden vereinigt Leukozyten mittels Durchflußzytometrie gefärbt. fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1. AutoMACS Anreicherung von Naive Gr-1 + Leukozyten für MDSC FACS-Sorting. Die Milz wurde von Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen und naiv geerntet und verarbeitet in den Single-Zellsuspensionen. Durchflusszytometrie-Analyse von naiven Leukozyten Oberfläche mit Mac-1 und Gr-1 Fluoreszenz-konjugierte Antikörper gefärbt, vor autoMACS Bereicherung (A). Durchflusszytometrie-Analyse von Gr-1 + (B) und Gr-1 - (C) Fraktionen post-autoMACS Anreicherung von Gr-1 + Zellen aus gepoolten naiv leuckocytes mit Gr-1-PE-Antikörper und anti-PE MicroBeads gefärbt. Durchflusszytometrie-Analyse der MDSC und Gr-1 + Prozentsätze nach autoMACS Anreicherung von Gr-1 +-Zellen aus naiven vereinigt Leukozyten (D) im Vergleich zu nicht-angereicherte vereinigt Leukozyten aus Tumor-tragenden Mäusen (E) (naive Mäuse, n = 5 , Tumor-tragenden Mäusen, n = 3). MDSC und Gr-1 Prozentsätze sind gated in den repräsentativen Konturdiagramme und Histogramme.

<ol><li>Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+during+acute+Trypanosoma+cruzi+infection%3A+involvement+of+Ly6G+%28Gr1%28%2B%29%29CD11b%28%2B%29+immature+myeloid+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells.</a> Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).</li>
<li>Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy-6C%28hi%29+suppressive+monocytes+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).</li>
<li>Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2B%2FGr-1%2B+myeloid+suppressor+cells+cause+T+cell+dysfunction+after+traumatic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress.</a> J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).</li>
<li>Ghansah, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+myeloid+suppressor+cells+in+SHIP-deficient+mice+represses+allogeneic+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses.</a> J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).</li>
<li>Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+SHIP+deficiency+expands+myeloid+regulatory+cells+and+abrogates+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease.</a> J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).</li>
<li>Yin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+prevent+type+1+diabetes+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models.</a> J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).</li>
<li>Gallina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).</li>
<li>Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+frequency+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+mice+with+spontaneous+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma.</a> Immunology. 128, 141-149 (2009).</li>
<li>Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+derived+suppressor+cells+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Myeloid derived suppressor cells in human diseases.</a> Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets%2C+expansion+and+activation+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells.</a> Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).</li>
<li>Pilon-Thomas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Adenocarcinoma+Dampens+SHIP-1+Expression+and+Alters+MDSC+Homeostasis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Panopoulos, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+governs+distinct+pathways+in+emergency+granulopoiesis+and+mature+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils.</a> Blood. 108, 3682-3690 (2006).</li>
<li>Preynat-Seauve, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralymphatic+tumors+prepare+draining+lymph+nodes+to+invasion+via+a+T-cell+cross-tolerance+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process.</a> Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).</li>
<li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separations+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cell separations by flow cytometry.</a> Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).</li>
<li>Maecker, H., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+reagents+for+multicolor+BD+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry.</a> Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).</li>
<li>Bagwell, C. B., Adams, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Spectral+Overlap+Compensation+for+Any+Number+of+Flow+Cytometry+Parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
<li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).</li>
<li>Collazo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP+limits+immunoregulatory+capacity+in+the+T-cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment.</a> Blood. 113, 2934-2944 (2009).</li>
<li>Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+yield+from+small+cell+populations+sorted+by+flow+cytometry+applying+different+isolation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures.</a> Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).</li>
<li>Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+human+regulatory+T+cells+%28Treg%29+and+effector+T+cells+to+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin.</a> PLoS One. 4, e5994(2009).</li>
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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dies ist eine detaillierte Verfahren zum Verarbeiten und immunophentyping MDSC Populationen, die für verschiedenen lymphoiden Geweben von verschiedenen Tiermodellen ist. Insbesondere kann autoMACS Anreicherung für die Isolierung von verschiedenen Leukozytenpopulationen einschließlich Gr-1 Depletion von Splenozyten 4, Reinigung von myeloiden Teilmengen aus Milzzellen und Lymphknoten 5, Isolierung von Knochenmark Neutrophilen 14 und Reinigung von CD8 + T-Zellen aus der Milz verw...

<table border="1"><tbody><tr><td> REAGENZ </td><td> UNTERNEHMEN </td><td> Katalog # </td><td> KOMMENTARE </td></tr><tr><td> 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SH30028.02 </td><td> Ca 2 + / Mg 2 + / Phenolrot-freiem </td></tr><tr><td> Albumin aus Rinderserum (BSA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A7906 </td><td> Lassen Sie ungestört auflösen BSA in PBS; sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum (FBS) </td><td> Thermo Scientific Hyclone </td><td> SV3001403HI </td><td> Hitze inaktiviert; sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Ratte anti-Maus-CD16/32 monoklonalen Antikörper (Fc-Block) </td><td> BD Biosciences </td><td> 553142 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Anti-Maus-CD11b (Mac-1) FITC </td><td> eBiosciences </td><td> 11-0112 </td><td> SterilUmwelt </td></tr><tr><td> Anti-Maus Ly6G (Gr-1) APC </td><td> eBiosciences </td><td> 17-5931 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Anti-Maus Ly6G (Gr-1) PE </td><td> eBiosciences </td><td> 12-5931 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Invitrogen </td><td> D1306 </td><td> Verdünnungsreihe sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Zellabtrennungssiebes </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> CD1-1KT </td><td> Autoklav vor der Verwendung </td></tr><tr><td> Um 70-Sieb </td><td> BD Biosciences </td><td> 352350 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> 1X RBC Lysis Buffer </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td> Warm auf Raumtemperatur vor Gebrauch; sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Petrischalen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-757-12 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> 50ml coniCal-Rohre </td><td> Thermo Scientific </td><td> 339652 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> 5ml 12X75mm Polystyrol Röhrchen mit rundem Boden </td><td> BD Biosciences </td><td> 352054 </td><td> Bekannt als FACS-Röhrchen, sterile Umgebung </td></tr><tr><td> 96-Well-Platten mit V-Boden </td><td> Corning </td><td> 3897 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> Trypanblau </td><td> Cellgro </td><td> 25-900-CI </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> PE MicroBeads </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-048-801 </td><td> Sterilen Umgebung </td></tr><tr><td> AutoMACS Pro Separator </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-092-545 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS Spalten </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-021-101 </td><td></td></tr><tr><td> AutoMACS Laufpuffer </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 130-091-221 </td><td&gt; </td></tr></tbody></table>

vorbereitung der myeloide suppressorzellen (mdsc) von naive und pankreas-tumor-tragenden mäusen mittels durchflusszytometrie und automated magnetic activated cell sorting (automacs)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC sind eine heterogene Population von unreifen Makrophagen, dendritischen Zellen und Granulozyten, die in lymphatischen Organen bei pathologischen Zuständen einschließlich parasitäre Infektionen, Entzündungen, traumatischen Stress, Graft-versus-host-Krankheit, Diabetes und Krebs 7.1 ansammeln. Bei Mäusen, MDSC ausdrückliche Mac-1 (CD11b) und Gr-1 (Ly6G und Ly6C) Oberflächenantigene 7. Es ist wichtig zu beachten, dass MDSC auch in verschiedenen Tumor-tragenden Hosts, wo sie deutlich erweitert werden untersucht und zu unterdrücken Anti-Tumor-Immunantwort gegenüber naiven Kollegen 7-10. In Abhängigkeit von den pathologischen Zustand, gibt es verschiedene Subpopulationen von MDSC mit unterschiedlichen Mechanismen und Ziele der Unterdrückung 11,12. Daher sind wirksame Mittel zur lebensfähigen MDSC Populationen zu isolieren, die Aufklärung ihrer verschiedenen molekularen Mechanismen der Unterdrückung in vitro und in vivo. Vor kurzem hat die Ghansah Gruppe hat den Ausbau MDSC in einem murinen Pankreaskarzinom-Modell berichtet. Unsere tumortragenden MDSC zeigen ein Verlust der Homöostase und erhöht suppressive Funktion im Vergleich zu naiven MDSC 13. MDSC Prozentangaben sind deutlich weniger in lymphoiden Kompartimente von naiven vs Tumor-tragenden Mäusen. Dies ist eine große Einschränkung, die oft behindert genaue vergleichende Untersuchungen dieser MDSC. Deshalb bereichern Gr-1 + Leukozyten aus naiven Mäusen vor Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) erhöht Reinheit, Viabilität und reduziert Art Zeit. Allerdings ist die Anreicherung von Gr-1 + Leukozyten aus tumortragenden Mäusen optional, da diese in Hülle und Fülle für die schnelle FACS-Sortierung sind. Daher wird in diesem Protokoll beschreiben wir eine hocheffiziente Methode der Immunphänotypisierung MDSC und bereichernde Gr-1 + Leukozyten aus Milzen von naiven Mäusen für die Sortierung MDSC in einer fristgerechten Weise. Immunkompetenten C57BL / 6 Mäusen mit murinem Panc02 ce inokuliertlls subkutan während naive Mäuse erhalten 1XPBS. Etwa 30 Tage nach der Inokulation, Milzen entnommen und in den Single-Zellsuspensionen mit einem Zellabtrennungssiebes verarbeitet. Milzzellen werden dann Rote Blutkörperchen (RBC) lysiert und ein Aliquot dieser Leukozyten angefärbt mit Fluorochrom-konjugierten Antikörper gegen Mac-1 und Gr-1 zu Immunphänotyp MDSC Prozentsätze mittels Durchflusszytometrie. In einem parallelen Experiment, werden ganze Leukozyten aus naiven Mäusen mit fluoreszierenden konjugierten Gr-1-Antikörper, mit PE-Microbeads inkubiert und positiv selektiert mit Hilfe eines automatisierten Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) Pro Separator gefärbt. Als nächstes wird ein Aliquot der Gr-1 + Leukozyten mit Mac-1-Antikörper gefärbt, um die Erhöhung der MDSC Prozentwert mit Durchflusszytometrie zu identifizieren. Nun sind diese Gr1 + angereicherten Leukozyten bereit für FACS-Sortierung von MDSC in vergleichenden Analysen verwendet werden (naiv vs tumortragenden) in in vivo und in vitro </em&gt;-Assays.

Dies ist eine schnelle und umfassende Methode der Immunphänotypisierung Myeloide Suppressorzellen (MDSC) und bereichernde Gr-1<sup&gt; +</sup&gt; Leukozyten aus Maus-Milz. Diese Methode verwendet Durchflusszytometrie und autoMACS Zellsortier für tragfähige Gr-1 bereichern<sup&gt; +</sup&gt; Leukozyten vor der FACS-Sortierung MDSC zur Verwendung<em&gt; In-vivo-</em&gt; Und<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assays.

Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

MDSC sind eine heterogene Population unreifer Makrophagen, dendritischer Zellen und Granulozyten, die sich in lymphoiden Organen bei pathologischen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, schnell eine Population von GR1-positiv angereicherten Leukozyten zu erzeugen, die lebensfähige, myeloide suppressorische Zellen oder MDSCs aus Mausmilzen enthalten, die für in-vivo- und in-vitro-Assays verwendet werden können. Zunächst werden Milzen mehrerer Mäuse gesammelt und verarbeitet, um eine Einzelzell-Suspension zu erzeugen. Um den Anteil der MDSCs vor der Anreicherung zu quantifizieren, wird eine kleine Aliquotprobe der gesammelten Zellen in eine 96-Well-V-Boden-Platte überführt.Die Oberflächenantigene MAC eins und GR eins werden markiert, und die markierten Zellen werden in FACS-Röhrchen zur Durchflusszytometrie überführt. Die verbleibenden gepoolten Leukozyten werden mit einem fluorochromkonjugierten Antikörper gegen GR eins gefärbt und anschließend mit magnetischen Mikroperlen inkubiert, die an das Fluorochrom auf dem Anti-GR-eins-Antikörper binden. Die GR-eins-positiven und GR-eins-negativen Populationen werden dann mithilfe eines AutoMax-pro-Separators getrennt, um den Erfolg der GR-eins-Anreicherung der Population zu überprüfen.Ein kleiner Aliquot wird entnommen und auf die Expression von GR1 und MAC1 a

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In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll zur Isolierung von hochreinem Populationen von Leukozyten, die Tumore infiltrieren. Dieses Protokoll wird aus der Miltenyi Biotech-Protokoll geeignet ist, Ausbeute und Reinheit zur Isolierung von Zellen aus komplexen Tumorgewebe zu verbessern.

Isolierung von Immunzellen aus Primärtumoren

Unterschiedliche dendritische Zelluntergruppen existieren als seltene Populationen in lymphatischen Organen und sind daher für immunologische Experimente schwierig in ausreichender Anzahl und Reinheit zu isolieren. Hier beschreiben wir eine hocheffiziente Methode mit hoher Ausbeute zur Isolierung aller derzeit bekannten Hauptuntergruppen von dendritischen Milzzellen der Maus.

Eine effiziente und High-Yield-Methode zur Isolierung von Maus über dendritische Zellen Subsets

Wir berichten unter Verwendung eines Protokolls fluoreszenzaktivierte Zell plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDC) mit hoher Reinheit aus dem Knochenmark von Lupus-Mäusen anfällig für funktionelle Studien von pDC zu isolieren Sortierung.

Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung zur Reinigung von Plasmazytoide dendritischer Zellen aus dem Knochenmark der Maus

Wir zeigen, wie zu identifizieren und zu isolieren 6 Teilmengen der myeloischen Vorläuferzellen aus murinen Knochenmark mit einer Kombination von magnetischen und Fluoreszenz (MACS und FACS) sortieren. Dieses Protokoll kann für in-vitro- Kultur-Assays (Methylcellulose oder Flüssigkeit Kulturen), in Vivo Adoptiv Transfer Experimente und RNS/Protein-Analysen verwendet werden.

Identifizierung und Isolierung von Oligopotent und Lineage-committed myeloischen Vorläuferzellen aus Maus Knochenmark

Wir beschreiben die Verwendung von hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) Das maligne Potential der gentechnisch veränderten blutbildenden Zellen zu beurteilen. HSCT ist nützlich für die Bewertung der verschiedenen malignen hämatopoetischen Zellen in Vivo sowie die Generierung einer großen Kohorte von Mäusen mit myelodysplastischen Syndromen (MDS) oder Leukämie um neue Therapien zu bewerten.

Einsatz von hämatopoetischen Stammzelltransplantation zu beurteilen, den Ursprung des myelodysplastischen Syndroms

Wir beschreiben hier ein Protokoll zur Zytotoxizität von pre-activated CD8 untersuchen+ T-Zellen gegen Krebszellen durch das Erkennen von apoptotischen Krebs Zellen über Echtzeit-Mikroskopie. Dieses Protokoll kann Mechanismen hinter myeloische Zellen-induzierte T-Zell-Unterdrückung untersuchen und zu bewerten Verbindungen auffüllen T Zellen durch Blockade von Immunzellen suppressive myeloische abzielen.

Echtzeit-Erkennung von In Vitro Tumor Zelle Apoptose induziert durch CD8+ T-Zellen, unterdrückende Immunfunktionen Tumor infiltrieren myeloische Zellen zu studieren

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung und Reinigung primärer Mikroglia in Tiermodellen demyelinisierender Krankheiten unter Verwendung der säulenförmigen magnetisch aktivierten Zellsortierung.

Isolierung von primären Mausmikroglia durch magnetisch aktivierte Zellsortierung in Tiermodellen der Demyelinisierung

Wir beschreiben eine Methode, um tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) von Mäusen mittels Durchflusszytometrie für den adoptiven Zelltransfer zu nutzen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die spezifische Zytotoxizität von TILs gegen Tumore in einem syngenen Pankreaskarzinom-Mausmodell zu verifizieren und Einblicke in die Entwicklung adoptiver Zelltherapien für Bauchspeicheldrüsenkrebs zu geben.

Durchflusszytometrie-basierte Isolierung und therapeutische Bewertung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Eine genaue und praktische Methode, um Parameter wie Spannung im Herzmuskelgewebe Maßnahme ist von großem klinischen Nutzen, da es sich gezeigt hat, dass der Stamm eine sensiblere und früher Marker für kontraktile Dysfunktion als die häufig verwendete Parameter EF ist.

Magnetic Resonance Derived Myocardial Dehnungs-Beurteilung anhand von Feature-Tracking-

Die Identifizierung von Gehirntumor initiierende Zellen (BTICs), die seltenen Zellen innerhalb einer heterogenen Tumor besitzt Stammzell-Eigenschaften, liefert neue Einblicke in das menschliche Gehirn Tumor Pathogenese. Wir haben spezifische Kulturbedingungen verfeinert für BTICs bereichern, und wir routinemäßig Durchflusszytometrie weiter bereichern diese Populationen. Selbsterneuerung Assays und Transkript Analyse durch einzelne Zelle RT-PCR kann anschließend auf diesen isolierten Zellen...

Verarbeitung von primären Hirntumoren Tissue für Stem Cell Assays und Flow Sortierung

Lernen Sie die Isolierung myeloider Suppressorzellen aus Mäusemilzen mittels Durchflusszytometrie und AutoMACS-Zellsortierung. Diese Methode ermöglicht die Anreicherung lebensfähiger Gr-1-positiver Leukozyten für in-vivo- und in-vitro-Studien.

Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS) (Video) | JoVE Journal

Vorbereitung der Myeloide Suppressorzellen (MDSC) von Naive und Pankreas-Tumor-tragenden Mäusen mittels Durchflusszytometrie und Automated Magnetic Activated Cell Sorting (autoMACS)

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