Avidität-basierte extrazelluläre Wechselwirkung Screening (AVEXIS) für die Erkennung von Scalable Low-Affinität extrazellulären Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neue extrazelluläre Proteininteraktionen zu entdecken, die an zellulären Erkennungsprozessen beteiligt sind, insbesondere membraneingebettete Rezeptorproteine. Der AveXis-Ansatz ist darauf ausgelegt, die sehr schwachen Interaktionsaffinitäten, die für diese Klasse von Proteininteraktionen typisch sind, und die Tatsache zu umgehen, dass Membranproteine biochemisch schwer zu manipulieren sind. Dies wird erreicht, indem zunächst eine rekombinante Proteinbibliothek der extrazellulären Regionen der Zelloberflächenrezeptoren zusammengestellt wird.

Dies wird durch das Design von Expressionsplasmiden erreicht, die die Ektodomänenregionen der Rezeptoren als lösliche Fragmente sowohl als monomere biotinylierte Köder als auch als Pentamer-Enzym produzieren. Der zweite Schritt besteht darin, die Proteine zu exprimieren und zu normalisieren, um für das Interaktionsscreening bereit zu sein. Alle Proteine werden in Säugetierzellen produziert, um sicherzustellen, dass posttranslationale Modifikationen wie Diss, Sulfid, Bindungen und Glykosylierung hinzugefügt werden.

Ein entscheidender Schritt im Protokoll besteht darin, sicherzustellen, dass die Köder- und Beuteproteine innerhalb der Bibliothek alle auf Schwellenwerte normalisiert werden. Als nächstes kommt der spannende Teil, das Screening auf neuartige Wechselwirkungen. Die Bates werden in einzelnen Vertiefungen einer Mikrot-Platte angeordnet und dann mit dem Lob auf Wechselwirkungen untersucht.

Anschließend wird ein Waschschritt durchgeführt. Der letzte Schritt besteht darin, das Substrat für das Enzym hinzuzufügen, um eingefangenes Lob auf den Arrays von Köderproteinen zu erkennen. Letztlich können die Ergebnisse eines VEX-Screenings zeigen, welche Zellsurfer-Rezeptoren in der Lage sind, Bindungspartner zu bilden und damit an den Erkennungs- und Kommunikationsprozessen zwischen Zellen beteiligt sein könnten.

Der Hauptvorteil dieser Technik einer beliebten Proteinextraktionsmethode, wie z. B. der Hefe-Zwei-Hybrid- oder biochemischen Reinigung, besteht darin, dass sie speziell für den Nachweis extrazellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen entwickelt wurde. Es eignet sich besonders gut, um neue Wechselwirkungen zwischen membrangebundenen Rezeptorproteinen zu entdecken. Diese Wechselwirkungen sind mit anderen Techniken schwer nachzuweisen, da Membranproteine biochemisch schwer zu manipulieren sind und ihre Gegenrezeptor-Wechselwirkungen typischerweise extrem schwach sind.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, die sich darauf beziehen, wie Zellen einander erkennen und miteinander kommunizieren. Auf molekularer Ebene können damit Fragen zu grundlegenden biologischen Prozessen beantwortet werden, z. B. welche Rezeptorproteine auf der Oberfläche von Eizellen und Spermien sich miteinander verbinden oder welche Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen für zelluläre Verhaltensweisen wie die Myozytenfusion oder die Bildung von Neuralleisten verantwortlich sind. Die größte Herausforderung bei diesem Ansatz besteht darin, die Bait-and-Pray-Proteinbibliotheken zusammenzustellen, in denen nach Wechselwirkungen gesucht werden kann.

Es ist auch sehr wichtig sicherzustellen, dass die Köder- und Beuteproteine innerhalb der für den Assay erforderlichen Schwellenwerte normalisiert sind. Dadurch wird die Falsch-Negativ- und die Falsch-Positiv-Häufigkeit reduziert. Die Idee zu dieser Methode kam mir erstmals während meiner Doktorarbeit, als ich versuchte, einen Bindungspartner für das Zelloberflächenprotein CD 200 zu identifizieren.

Im Wesentlichen stellte ich die Frage, was das Bindungsmuster für diesen speziellen Zelloberflächenrezeptor ist. Auch heute? Diese Frage war zu dieser Zeit technisch schwer zu beantworten, aber das menschliche Genom war kurz vor der Fertigstellung und mir wurde klar, dass wir, da wir jetzt eine vollständige Liste aller Zelloberflächenrezeptoren im Genom hatten, nun stattdessen innerhalb dieses Satzes von Rezeptorproteinen fragen konnten, die technisch interagieren können.

Diese Frage ist viel einfacher zu beantworten, und AveXis war die Methode, die wir entwickelt haben, um sie zu beantworten. Sobald eine Bibliothek von Köder- und Präexpressionsvektoren etabliert wurde, bereiten Sie sich auf die Transfektion in HEC 2 9 3 E-Zellen vor und beginnen Sie mit der Aussaat der Zellen am Tag vor der Transfektion bei einer Dichte von 250.000 Zellen pro Milliliter in 50 Millilitern Freestyle 2 9 3-Medien, um eine effiziente Biotin-Hochstimmung zu gewährleisten. Ergänzen Sie das Medium, das zur Herstellung von Köderproteinen, nicht von Beuteproteinen, verwendet wird, mit d Biotin mit allen vorbereiteten Platten, inkubieren Sie die Zellen über Nacht unter Standardbedingungen.

Da Biotin eine geringe Löslichkeit und genaue Lösung hat, ziehen wir es vor, das zusätzliche Biotin abzuwiegen und dann in das Medium zu geben und am nächsten Tag kräftig zu schütteln. 50 Milliliter kultivierter Zellen mit 25 Mikrogramm des Köder- oder Beuteplasmids werden unter Verwendung eines geeigneten Transfektionsreagenzes transfiziert, um biotinylierte Köder herzustellen. Die Köder bestehen in einem Verhältnis von 10 zu eins mit Plasmiden, die für eine sezernierte Form des ELI-Proteins Biotin Ligase pro Ernte kodieren.

Die Kulturen werden fünf Tage nach der Transfektion durchgeführt, indem die Zellen zunächst durch Zentrifugation bei 3000-facher Schwerkraft für 20 Minuten blassen und dann der S-Überstand durch einen 0,22-Mikron-Filter filtriert wird. Eines der Hauptmerkmale von AveXis ist, dass rekombinante Proteine sezerniert werden und so verdünnt oder konzentriert werden können, dass sie innerhalb der Schwellenwertaktivitäten liegen. Wir fanden heraus, dass rekombinante Proteine eine variable Expression von bis zu vier Größenordnungen aufweisen, so dass der Normalisierungsschritt das Auftreten von falsch positiven Ergebnissen während der Screening-Schritte reduziert.

Um mit der Normalisierung des Köders zu beginnen, muss unkonjugiertes de Biotin durch Dialyse aus dem Medium entfernt werden, da es mit dem biotinylierten Köderprotein für die Bindung an die Bindungsstellen konkurriert. Um eine effektive Dialyse der rekombinanten Proteine zu gewährleisten, haben wir festgestellt, dass es wichtig ist, dem Dialyseschlauch eine überschüssige Oberfläche zur Verfügung zu stellen. In der Regel stellen wir zwei- bis dreimal mehr Schläuche zur Verfügung, als für das zu dialysierende Volumen tatsächlich erforderlich sind.

Über einen Zeitraum von 24 Stunden dialysierte der Köder ausgiebig gegen einen geeigneten Puffer wie z. B. PBS nach der Dialyse. Ein ELIZA beginnt damit, die Vertiefungen einer Streptokokken-kodierten Mikrot-Platte mit PBST, das BSA enthält, für 15 Minuten zu blockieren. In der Zwischenzeit auf einer sauberen Platte eine Reihe von vier ein- bis drei Verdünnungen der Köderproteine in PBST mit 2% BSA durchführen.

Nach der 15-minütigen Inkubation übertragen Sie die Verdünnung auf die Streptokokken-TTR-kodierte Platte und inkubieren Sie die Platte nach einer Stunde eine Stunde lang bei Raumtemperatur, waschen Sie die Vertiefungen und fügen Sie dann in jede Vertiefung 100 Mikroliter von zwei Mikrogramm pro Milliliter OX 68 hinzu. Inkubieren Sie die Platte eine weitere Stunde bei Raumtemperatur. Führen Sie nach der zweiten Inkubation eine weitere Waschserie durch und beladen Sie die Platte mit anti-US-alkalischer Phosphatase.

Inkubieren Sie die Platte für eine dritte Stunde bei Raumtemperatur. Waschen Sie nun den Teller dreimal in PBST und waschen Sie ihn abschließend PBS. Um alle Reinigungsmittelreste zu entfernen, fügen Sie nach einer Stunde 100 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Substrat 1 0 4 in Diethanolaminpuffer hinzu.

Bei Raumtemperatur wurde eine Absorption von 4 0 5 Nanometern gemessen, Eine Verdünnungsreihe von vier verschiedenen dialysierten Ködersupinaten wurde von Eliza unter Verwendung eines monoklonalen Anti-CD-Antikörpers mit vier Tags nachgewiesen. Wenn die unverdünnten Express-Köderproteine nicht ausreichen, um alle Biotin-Bindungsstellen einer Streptokokken-Avid-ENC-beschichteten Platte zu sättigen, konzentrieren Sie das Protein mit einem Viva-Spin-Konzentrator. Andernfalls verwenden Sie das Köderprotein in einer verdünnten Konzentration in PBST mit 2%BSA.

Das reicht gerade aus, um die Biotin-Bindungsstelle des Assays zu sättigen. Quantifizieren Sie die relativen Niveaus, in denen die Präproteine exprimiert werden, unter Verwendung der Beta-Lactamase-Enzymaktivität. Beginnen Sie mit der Erstellung einer Verdünnungsreihe des Supinats, das die Paraproteine in PBST 2%BSA-Puffer enthält.

Geben Sie dann 20 Mikroliter der Verdünnung zu 60 Mikrolitern einer salpetrigen Stepinlösung, die in eine Platte geladen wird. Übertragen Sie die Platte sofort in ein Plattenlesegerät und messen Sie die Absorption von 4 85 Nanometern einmal pro Minute für die nächsten 20 Minuten mit Zentrifugalkonzentratoren oder Verdünnungs-PBST mit 2 % BSA. Stellen Sie die Endkonzentration der Proben so ein, dass alle Nitros im Assay in etwa sieben Minuten hydrolysiert werden, was einem Umsatz von etwa zwei ol Nitros pro Minute entspricht.

Beginnen Sie mit dem AveXis-Sieb, indem Sie eine mit Streptokokken TAVR ENC beschichtete Platte in PBST waschen und die Platte trocken gegen ein Papiertuch klopfen. Geben Sie dann PBST mit BSA in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 30 Minuten lang. Dadurch wird eine unechte Proteinbindungsstelle blockiert.

Entfernen Sie in jeder Vertiefung die blockierende Lösung mit einer geschickten Bewegung der Platte über einer Senke und geben Sie 100 Mikroliter normalisierte biotinylierte monomere Köder in die entsprechenden Vertiefungen. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Dann nehmen Sie die Köderproben mit einem weiteren Schnippen von der Platte und waschen Sie sie dreimal mit PBST ab.

Nach der dritten Wäsche dann mit dem Klopfen trocken klopfen. Geben Sie nun 100 Mikroliter des normalisierten Pentamer-Beutekonstrukts in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Geben Sie der Platte nach einer Stunde drei weitere Wäschen mit PBST und eine letzte Wäsche nur mit PBS.

Zum Schluss fügen Sie 60 Mikroliter Nitro-Sieben-Lösung in jede Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Platte zwei Stunden lang bei Raumtemperatur, oder inkubieren Sie die Platten vorzugsweise 16 Stunden lang bei vier Grad SIUs. Am nächsten Tag sind die positiven Interaktionen rot geworden. Machen Sie ein Foto der Platte für eine visuelle Aufzeichnung und quantifizieren Sie dann die Reaktionen bei einer Absorption von 4 85 Nanometern mit einem Plattenlesegerät.

Etwa 10 Minuten nach Beginn der AveXis-Screening-Reaktion wurden Gelb- zu Rot-Farbveränderungen sowohl bei der Antikörper-vermittelten Beutefangkontrolle als auch bei der positiven Kontrollinteraktion beobachtet. Diese Farbänderung deutet auf eine Hydrolyse des Lachstoffs im Substrat hin. Einige positive Wechselwirkungen sind auf dieser Zeitskala zu beobachten, aber die meisten brauchten einige Stunden, um zu erscheinen.

In der Regel wurde eine Trefferquote von etwa 0,4 bis 0,6 % positiver Ergebnisse beobachtet. Sobald die Proteinbibliotheken vorbereitet sind, kann der Screening-Teil dieser Technik schnell durchgeführt werden. Es ist durchaus möglich, bis zu 12 Platten an einem Tag zu screenen, nachdem eine Wechselwirkung festgestellt wurde.

Der wichtigste nächste Schritt besteht darin, zunächst zu zeigen, dass die Interaktion mit frischen, unabhängigen Proteinpräparaten wiederholt werden kann. Zweitens bestimmen wir immer, ob die Interaktion unabhängig von der Ausrichtung der Köderbeute ist, d.h. ob sie erwidert werden kann. Dabei werden die Ködervektordomänen in den Beutevektor geklont und umgekehrt.

Interaktionen, die wiederholt und erwidert werden können, gelten als hoch zuverlässig und haben sich immer als positiv erwiesen. Mit anderen Techniken wie der Oberflächenplasmaresonanz verwenden wir gerne Oberflächenplasma in Resonanz, um zusätzlich Wechselwirkungen zu validieren, die wir neu identifizieren. Wichtig ist, dass dies einen Beweis dafür liefert, dass die beiden gereinigten Komponenten direkt interagieren können und auch verwendet werden kann, um zu zeigen, dass die Bindung sat und daher spezifisch ist.