Spektrale Karyotypisierung zu Chromosomenanomalien in Menschen und Mäusen mit Kidney Disease Study

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Chromosomen mit Paint-Proben zu markieren, um Chromosomenabweichungen und Segregationsdefekte bei Mäusen und Menschen mit polyzystischer Nierenerkrankung zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Zellen von Menschen oder Mäusen gewonnen und mit Smid behandelt werden, gefolgt von Fixierung und Herstellung von Metaphasenausstrichen auf Objektträgern. Anschließend wird der Objektträger vorbehandelt, um überschüssige RNA und Zytoplasma zu entfernen, die die Hybridisierung stören könnten.

Dies erfolgt durch Verdau mit RNAsen bzw. Pepsin. Anschließend werden Chromosomen- und Sonden-Denaturierung durchgeführt, gefolgt von der Hybridisierung zur Markierung der Chromosomen. Der letzte Schritt ist der Nachweis der Sonde mit fluoreszierenden Farbstoffen.

Letztlich können Ergebnisse erzielt werden, die chromosomale numerische und strukturelle Abnormalitäten mittels Fluoreszenz, Mikroskopie sowie Bildaufnahme und -analyse mit der Skyview-Software zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie den klassischen GIMs-Biegungstechniken liegt darin, dass sie zusätzliche Informationen über komplexe chromosomale Aberrationen liefert, wie z. B. chromosomale Translokationen und komplexe chromosomale Umstellungen, die mit klassischen Biegungstechniken nicht charakterisiert werden können. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der polyzystischen Nierenerkrankung zu beantworten, beispielsweise den Mechanismus der zystischen Nierenbildung.

Dr. Wiam Abu wird das Verfahren demonstrieren und einem talentierten erfahrenen Postdoktoranden aus unserem Labor ermöglichen, mit der Kultivierung von endothelialen Zellen in DMEM, das 10 bis 15 % fetalen Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin enthält, bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid zu beginnen, bis die Zellen eine Konfluenz von 70 bis 80 % erreichen. Behandeln Sie die Zellen anschließend mit Cole-Lösung in einer Endkonzentration von 0,05 Milligramm pro Milliliter für 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius, bevor die Zellen geerntet werden. Sammeln Sie zunächst das Medium, das eventuell schwebende Zellen enthält, in 50-Milliliter-Sterilzentrifugenröhrchen.

Spülen Sie die Zellen auf der Platte nach der Inkubation mit sterilen Trips für eine bis zwei Minuten mit steriler PBS einmal aus, ernten Sie die verbleibenden Zellen und sammeln Sie sie in demselben Gefäß. Nachdem die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten pelletiert wurden, aspirieren Sie den größten Teil der Flüssigkeit aus dem Gefäß, wobei etwa 0,5 Milliliter über dem Pellet verbleiben. Lösen Sie den Zellenpellet durch vorsichtiges Anschlagen des Gefäßes.

Danach je nach Größe des Pellets fünf bis 10 Milliliter einer hypertonischen Lösung aus 0,56 % Kaliumchlorid in destilliertem Wasser zugeben und die Suspension 30 bis 45 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation mit einer kleinen Ein-Milliliter-Pipette einen Tropfen einer eiskalten Fixierungslösung pro Milliliter der hypertonischen Zellsuspension hinzufügen. Anschließend das Gefäß vorsichtig umstülpen, um die Probe nach einer Zentrifugation der Zellen fünf Minuten lang bei einer Geschwindigkeit von 1.200 Umdrehungen pro Minute zu mischen.

Aspirieren Sie das Überstandsgemisch wie zuvor. Fügen Sie anschließend langsam ein Milliliter frische Fixierungslösung hinzu, während Sie den Pellet vorsichtig anstupsen. Geben Sie dann vorsichtig weitere vier Milliliter Fixierungslösung an die Wand des Reaktionsgefäßes.

Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Metaphasepräparate nicht in Zellklumpen eingeschlossen bleiben. Nach Wiederholung des Zentrifugationsschritts und Absaugen des Überstandes werden fünf bis 10 Milliliter Fixansatz ersetzt, indem der Fixansatz langsam die Wand des Röhrchens entlang pipettiert wird. Zu diesem Zeitpunkt können die Zellen in einem verschlossenen und dicht verschraubten Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius für die kurzfristige oder bei minus 80 Grad Celsius für die langfristige Lagerung aufbewahrt werden, bis die Weiterverarbeitung erfolgt.

Wenn Sie fortfahren möchten, überprüfen Sie die Anzahl der Metaphase-Chromosomen in der Zellpräparation. Reinigen Sie den Objektträger mit absolutem Ethanol. Tauchen Sie den Objektträger anschließend etwa 10-mal in destilliertes Wasser, um einen Wasserfilm auf der Oberfläche des Objektträgers zu bilden. Stellen Sie den Objektträger auf eine Glasplatte und geben Sie 15 bis 20 Mikroliter Zellsuspension aus einer Höhe von 25 cm über dem Objektträger tropfenweise darauf.

Legen Sie den Objektträger für ein bis zwei Minuten in ein Wasserbad, das auf 65 bis 70 Grad Celsius eingestellt ist, und lassen Sie ihn trocknen. Überprüfen Sie den Objektträger unter dem Lichtmikroskop mit den 10-fachen und 40-fachen Trockenobjektiven. Stellen Sie sicher, dass Metaphasechromosomen vorhanden sind und die Ausstriche gleichmäßig verteilt sind. Untersuchen Sie das Cytoplasma, das die Chromosomen umgibt.

Wenn wie hier sichtbar Zytoplasma vorhanden ist, fahren Sie mit der Objektträgervorbehandlung fort. Wenn kein Zytoplasma vorhanden ist und die Chromosomen eine gute Morphologie aufweisen, ist keine Objektträgervorbehandlung erforderlich bei 120 Mikrolitern einer frisch zubereiteten 1:200-Lösung von 20 Milligramm pro Milliliter. RNA-Lösung, gelöst in zweifach SSC, auf ein 24 Millimeter mal 60 Millimeter großes Deckglas.

Drehen Sie die Metaphase-Objektträger vorsichtig mit der Oberseite nach unten auf das Deckglas. Drehen Sie dann den Metaphase-Objektträger vorsichtig wieder mit der Oberseite nach oben. Stellen Sie den Objektträger in eine befeuchtete Kammer und inkubieren Sie ihn 45 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Nach Ablauf der Inkubationszeit die Deckglas vorsichtig entfernen, ohne den Objektträger zu zerkratzen, und zweimal mit SSC-Puffer in einem Kopplungsgefäß je dreimal fünf Minuten lang unter Schütteln waschen. In der Zwischenzeit fünf bis 15 Mikroliter von 100 Milligramm pro Milliliter Pepin in destilliertem Wasser einem sauberen Becher hinzufügen und anschließend 100 Milliliter 0,01 molarer Salzsäure, vorgewärmt auf 37 Grad Celsius, zugeben. Es ist wichtig, die Pepins zuerst in den sauberen Becher zu geben, da sie sonst nicht auflösen würden.

Überführen Sie diese Lösung in ein Coplan-Gefäß. Inkubieren Sie den Waschpräparat im Kopplungsgefäß nach der Verdauung bei 37 Grad Celsius nicht länger als drei bis fünf Minuten. Waschen Sie das Präparat zweimal in einem Copin-Gefäß, das jeweils ein XPBS enthält, fünf Minuten lang unter Schütteln.

Danach erfolgt eine fünfminütige Wäsche in einem Copin-Gefäß, das PBS mit zugesetztem Magnesiumchlorid enthält. Anschließend eine 10-minütige Inkubation in einem Copin-Gefäß mit 1 % Formaldehyd, gefolgt von einer abschließenden Wäsche in einem Cochins-Gefäß mit 1× PBS für fünf Minuten. Danach die Cochins-Gefäße entwässern, die eine Reihe von Ethanol in 70 %, 80 % und 100 % enthalten, jeweils zwei Minuten lang, und anschließend lufttrocknen.

Untersuchen Sie das Präparat unter einem Lichtmikroskop mit einem 40-fachen Trockenobjektiv, um sicherzustellen, dass die Schnitte ordnungsgemäß verdaut sind, kein Zytoplasma vorhanden ist und die Chromosomenmorphologie erhalten geblieben ist. Wählen Sie abschließend einen Bereich für die Hybridisierung mit einem Diamantschreiber aus. Nachdem die Denaturierungslösung frisch hergestellt wurde, geben Sie sie in ein Coplin-Gefäß und erwärmen Sie sie in einem Wasserbad auf 70 Grad Celsius vor.

Danach die Objektträger in das Cochin-Gefäß mit der vorgewärmten Denaturierungslösung geben und 30 Sekunden bis eine Minute im Wasserbad bei 70 Grad Celsius inkubieren. Anschließend die Objektträger unverzüglich für drei Minuten in eiskaltes 70 %iges Ethanol, danach jeweils drei Minuten in 80 %igem und 100 %igem Ethanol überführen und anschließend lufttrocknen. Die Objektträger auf Chromosomenmorphismus untersuchen, wobei dunkle Chromosomen sichtbar sein sollten, die nicht hell oder glänzend erscheinen.

Kennzeichnet gute Chromosomen oder Morphologie. Erwärmen Sie die Sky-Paint. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius mit Schütteln für 20 Minuten.

Danach kurz vortexen und 1000 Umdrehungen pro Minute zentrifugieren. Denaturieren Sie die Sonde für fünf Minuten im Thermocycler bei 85 Grad Celsius, gefolgt von einer Inkubation bei 37 Grad Celsius für einige Sekunden. Geben Sie 10 µL der denaturierten Sonde für eine Stunde auf den Hybridisierungsbereich und bedecken Sie diesen mit einem 22 mm × 40 mm großen Deckglas.

Die Kanten des Deckgläschens unter Vermeidung von eingeschlossenen Luftblasen mit Gummilack verschließen und anschließend im feuchten Inkubator bei 37 Grad Celsius 48 bis 72 Stunden inkubieren. Das Deckglas vorsichtig entfernen und den Objektträger in ein Koppelglas mit frisch zubereiteter Waschlösung geben, die auf 45 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Dreimal je fünf Minuten bei 45 Grad Celsius in einer schüttelnden Wasserbadapparatur mit 45 Umdrehungen pro Minute waschen.

Anschließend die Objektträger jeweils zweimal fünf Minuten unter Rühren in Waschlösung zwei bei 45 Grad Celsius waschen, gefolgt von fünf Minuten in Waschlösung drei bei 45 Grad Celsius mit Schütteln. Danach 80 Mikroliter Blockierreagenz zugeben. Anschließend ein Deckglas aufsetzen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Entfernen Sie die Deckglas und lassen Sie die Flüssigkeit ablaufen. Geben Sie 80 µL des Sci-Fi-Färbe-Reagenz hinzu. Legen Sie ein Deckglas auf und inkubieren Sie bei 37 °C für 40 Minuten. Nach der Inkubation waschen Sie den Objektträger dreimal mit Waschlösung bei 45 °C je fünf Minuten unter Schütteln.

Als Nächstes 80 Mikroliter PS-5,5-Färbelösung auftragen. Ein Deckglas aufsetzen und 40 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, nachdem die Probe wie zuvor dreimal mit Waschlösung drei gewaschen wurde. Zum Schluss die Objektträgerkappe ankippen und die Flüssigkeit ablaufen lassen.

Tragen Sie 20 Mikroliter des Antifa-dappy-Reagenz auf und platzieren Sie ein 24 Millimeter mal 60 Millimeter großes Mikroskop-Deckglas. Entfernen Sie vorsichtig Luftblasen. Die Präparate können sofort abgebildet oder bis zu einer Woche lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln aufbewahrt werden. Diese Himmelsaufnahme eines normalen Metaphasenpräparats von einer Wildtyp-Maus wurde mit einem Olympus-Mikroskop, das mit einer 60-fachen Öl-Immersionsoptik ausgestattet war, aufgenommen.

Ein speziell entwickelter Dreifachbandpassfilter, bekannt als spektrales Würfelprinzip, ein Dappy-Filter und ein SAC-Interferometermodul mit einer CCD-Kamera. Spektrale Karyotypen wurden mit der SkyView-Software durchgeführt. Das obere linke Panel zeigt die markierte Metaphaseausstrahlung, das obere rechte Panel ein Hellfeldbild der Ausstrahlung.

Das untere Panel zeigt das Chromosom, das mit der Skyview-Software in aufsteigender Reihenfolge sortiert wurde. Dieses Himmelsansichtsbild eines Metaphasenausstrichs von einer pkd1-homozygoten Knockout-Maus zeigt eine abnormale Chromosomenzahl, bei der 68 Chromosomen statt der üblichen 40 vorhanden sind. Sichtbar sind außerdem Chromosomenabweichungen wie die Deletion des Chromosoms acht sowie Translokationen, beispielsweise zwischen den Chromosomen fünf und 16 sowie zwischen den Chromosomen 11 und 19.

Dieses Himmelsbild einer Metaphase-Aufspaltung menschlicher Chromosomen aus dem Gefäßgewebe eines nicht an A-D-P-K-D erkrankten Patienten zeigt den normalen weiblichen Karyotyp mit 44 Autosomen und zwei XXX-Chromosomen. Dieses endgültige Himmelsbild zeigt eine Metaphase-Aufspaltung aus dem Gefäßgewebe eines A-D-P-K-D-Patienten mit einem abnormalen Karyotyp von 88 Autosomen und vier XXXX-Geschlechtschromosomen. Ein Meister.

Diese Technik kann innerhalb von fünf Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.