Spektrale Karyotypisierung zu Chromosomenanomalien in Menschen und Mäusen mit Kidney Disease Study

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, Chromosomen mit Farbsonden zu markieren, um Chromosomenanomalien und Segregationsdefekte bei Mäusen und Menschen mit polyzystischer Nierenerkrankung zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zuerst Zellen von Menschen an Mäusen entnommen und mit smid behandelt werden, gefolgt von Fixierung und Herstellung von Metaphasen-Spreads auf Glasscheiben. Als nächstes wird der Schiefer vorbehandelt, um zusätzliche RNA und Zytoplasma zu entfernen, die die Hybridisierung stören könnten.

Dies geschieht durch Verdauung mit RNAs bzw. Pepsin. Dann wird die Chromosom- und Sonden-Denaturierung durchgeführt, gefolgt von der Hybridisierung zur Markierung der Chromosomen. Der letzte Schritt ist die Detektion der Sonde mit fluoreszierenden Farbstoffen.

Letztendlich können Ergebnisse erhalten werden, die chromosomale numerische und strukturelle Anomalien durch Fluoreszenz, Mikroskopie und Bilderfassung und -analyse durch Skyview-Software zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie klassischen GIMs-Biegungstechniken ist, dass sie zusätzliche Informationen über komplexe chromosomale Anomalien wie chromosomale Translokationen und komplexe chromosomale Umlagerungen liefert, die durch klassische Biegungstechniken nicht charakterisiert werden können. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der polyzystischen Nierenerkrankung zu beantworten, wie zum Beispiel den Mechanismus der zystischen Nierenbildung.

Die Durchführung des Verfahrens wird von Dr. Wiam Abu demonstriert, der einen talentierten leitenden Postdoktoranden aus unserem Labor ermöglicht, die endothelialen Zellen in DMEM mit 10 bis 15% fetalem Kälberserum und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bis zum Erreichen von 70 bis 80% Konfluenz zu kultivieren. Behandeln Sie dann die Zellen mit Cole-Lösung bei einer Endkonzentration von 0,05 Milligramm pro Milliliter für 30 bis 60 Minuten bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Zellen entnehmen, um zuerst die Zellen zu ernten, sammeln Sie das Medium mit allen schwimmenden Zellen in 50 Millilitern. Sterile Zentrifugenröhrchen.

Spülen Sie die Zellen auf der Platte mit sterilem Einmal-PBS nach Inkubation mit sterilem Trypsin für ein bis zwei Minuten, entnehmen und sammeln Sie die restlichen Zellen in das gleiche Röhrchen. Nach Zentrifugation der Zellen bei 1000 Umdrehungen pro Minute für fünf Minuten aspirieren Sie die Mehrheit des Sates aus dem Röhrchen und lassen etwa 0,5 Milliliter auf dem Pellet. Lockern Sie das Zellpellet, indem Sie das Röhrchen schwenken.

Fügen Sie je nach Pelletgröße fünf bis 10 Milliliter einer hypertonischen Lösung von 0,56% Kaliumchlorid in destilliertem Wasser hinzu und inkubieren Sie die Suspension bei 37 Grad Celsius für 30 bis 45 Minuten. Nach der Inkubation verwenden Sie eine kleine Ein-Milliliter-Pipette, um einen Tropfen einer eiskalten Fixativlösung pro einem Milliliter hypertoner Zellsuspension hinzuzufügen. Dann invertieren Sie das Röhrchen vorsichtig, um es zu mischen, nachdem die Zellen fünf Minuten lang mit einer Geschwindigkeit von 1.200 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert wurden.

Aspirat das Supinate wie zuvor. Fügen Sie dann langsam ein Milliliter frischer Fixativlösung hinzu, während Sie das Pellet schwenken. Fügen Sie dann vorsichtig weitere vier Milliliter Fixativ zur Wand des Röhrchens hinzu.

Dieses Verfahren ist entscheidend, um sicherzustellen, dass die Metaphasen-Spreads nicht in den Zellklumpen eingeschlossen werden. Nach dem Wiederholen des Zentrifugationsschritts und dem Aspirieren des Überstands ersetzen Sie die fünf bis 10 Milliliter Fixativ durch langsames Pipettieren des Fixativs an den Wänden des Röhrchens. In diesem Stadium können die Zellen in einem verschlossenen und versiegelten Röhrchen bei minus 20 Grad Celsius für kurze Zeit oder minus 80 Grad Celsius für langfristige Lagerung aufbewahrt werden, bis Sie fortfahren können.

Wenn Sie fortfahren möchten, überprüfen Sie die Anzahl der Metaphasen-Chromosomen in der Zellvorbereitung. Reinigen Sie den Schiefer in absolutem Ethanol. Dann tippen Sie den Schiefer etwa 10 Mal in destilliertes Wasser, um eine Wasserhülle auf der Oberfläche des Schiefers zu bilden, legen Sie den Schiefer auf eine Glasplatte und tropfen Sie 15 bis 20 Mikroliter Zellsuspension aus einer Höhe von 10 Zoll über dem Schiefer.

Setzen Sie den Schiefer für ein bis zwei Minuten in ein Wasserbad, das auf 65 bis 70 Grad Celsius eingestellt ist, und lassen Sie ihn trocknen. Überprüfen Sie den Schiefer unter einem Lichtmikroskop mit 10-facher und 40-facher Trockenobjektiven. Stellen Sie sicher, dass sich Metaphasen-Chromosomen befinden und dass die Spreads gleichmäßig verteilt sind. Überprüfen Sie das Zytoplasma, das die Chromosomen umgibt.

Wenn Zytoplasma vorhanden ist, wie hier zu sehen, fahren Sie mit der Schiefervorbehandlung fort. Wenn kein Zytoplasma vorhanden ist und die Chromosomen eine gute Morphologie aufweisen, ist keine Schiefervorbehandlung bei 120 Mikrolitern einer frisch zubereiteten eins bis 200 Lösung von 20 Milligramm pro Milliliter erforderlich. RNA-Lösung gelöst in zweifachem SSC auf einem 24 Millimeter mal 60 Millimeter großen Deckglas.

Drehen Sie den Metaphasen-Schiefer mit der Rückseite nach unten auf das Deckglas um. Dann invertieren Sie den Metaphasen-Schiefer vorsichtig mit der Vorderseite nach oben. Legen Sie den Schiefer in eine befeuchtete Kammer und inkubieren Sie ihn 37 Grad Celsius für 45 Minuten.

Sobald die Inkubationszeit abgelaufen ist, entfernen Sie vorsichtig das Deckglas, ohne den Schiefer zu zerkratzen, und waschen Sie zweimal SSC-Puffer in einem Kopplungsgefäß dreimal für jeweils fünf Minuten mit Schütteln. Fügen Sie in der Zwischenzeit fünf bis 15 Mikroliter 100 Milligramm pro Milliliter Pepin in destilliertem Wasser zu einem sauberen Becher hinzu und fügen Sie dann 100 Milliliter 0,01 molare Salzsäure hinzu, die auf 37 Grad Celsius vorgewärmt ist. Es ist wichtig, die PEPs zuerst in den sauberen Becher zu geben, sonst lösen sie sich nicht auf.

Übertragen Sie diese Lösung in einen Coplan-Behälter. Inkubieren Sie den Waschschieber im Kopplungsbehälter bei 37 Grad Celsius für nicht länger als drei bis fünf Minuten nach der Verdauung. Waschen Sie den Schiefer zweimal in einem Copin-Behälter mit einem XPBS für jeweils fünf Minuten mit Schütteln.

Folgen Sie dem mit einer fünfminütigen Wäsche in einem Copin-Behälter mit PBS, das mit Magnesiumchlorid ergänzt ist. Und dann eine 10-minütige Inkubation in einem Copin-Behälter mit 1% Formaldehyd, gefolgt von einer letzten Wäsche in einem Cochin-Behälter mit einem XPBS für fünf Minuten. Trocknen Sie dann den Schiefer in Cochin-Behältern, die eine Reihe von Ethanol von 70% 80% und 100% für jeweils zwei Minuten enthalten, und lassen Sie sie dann an der Luft trocknen.

Beobachten Sie den Schiefer unter einem Lichtmikroskop mit einer 40-fachen Trockenlinse, um sicherzustellen, dass die Schiefer ordnungsgemäß verdaut sind, dass kein Zytoplasma vorhanden ist und dass die Chromosomenmorphologie erhalten bleibt. Wählen Sie schließlich einen Bereich für die Hybridisierung mit einem Diamantstift aus. Nachdem Sie die Denaturierungslösung frisch zubereitet haben, legen Sie sie in einen Copin-Behälter und erwärmen Sie sie in einem Wasserbad auf 70 Grad Celsius vor.

Legen Sie dann den Schiefer in den Cochin-Behälter mit der vorgewärmten Denaturierungslösung in einem Wasserbad bei 70 Grad Celsius für 30 Sekunden bis zu einer Minute. Platzieren Sie den Schiefer nach der Inkubation sofort für drei Minuten in eiskaltem, 70%igem Ethanol, gefolgt von 80% und 100% Ethanol für jeweils drei Minuten und lassen Sie ihn dann an der Luft trock