Name: Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 10 s
Description: Erfahren Sie eine TIRF-Mikroskopie-Methode zur Echtzeit-Visualisierung von T-Zell-Rezeptor-Signalwegen in primären Maus-T-Zellen. Diese Technik ermöglicht die hochauflösende Analyse von Protein-Interaktionen in TCR-Mikroclustern.

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Diese Arbeit wurde von der Abteilung für Interne Forschung des National Institute for Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health unterstützt. Wir danken Johannes Huppa und Mark Davis, der uns mit dem scFv von H57 in diesen Studien verwendet. RV möchte Keir Neumann für hilfreiche Diskussionen bedanken bei der Entwicklung dieser Technik.

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</ol>

Alle Tiere in diesen Experimenten verwendet wurden in einem spezifischen Pathogen-freien Umgebung gehalten, und die Experimente wurden von den National Institutes of Health Animal Care und Use Committee gebilligt.

Wir beschreiben hier ein System zu studieren Signalisierung in Antigen-spezifischen T-Zellen, primäre Maustaste mit TIRFM und Glas unterstützten Lipiddoppelschichten als künstliche APCs. Die Technik beruht auf erfolgreich exprimieren GFP-markierten Proteine ​​in diesen Zellen. Transfektion von T-Zellen ist immer eine anspruchsvolle Aufgabe. Typischerweise werden Elektroporation oder Gentransfer mit Retroviren oder Lentiviren verwendet. Eine Technik ist nicht überlegen über das andere, beide haben ihre Grenzen und Vorteile. Wir finden, dass die Elektroporation hat folgende Vorteile: 1) Es ist nicht erforderlich, dass die Zellen aktiv werden Unterteilen wie Retroviren, aber nicht Lentiviren erforderlich ist, und 2) Die Expression kann durch Variieren der Zeit wurden die Zellen vor der Bebilderung inkubiert werden, gesteuert werden. Der größte Nachteil ist, dass wir es sehr schwierig, Proteine, die große Abmessungen in primären Zellen auszudrücken. Wir haben eine Methode, die uns sehr gut die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Elektroporation vorgestellt. Als ein Ergebnis ist es geltenden Gesundheitsschutzmaßnahmenle zu benutzen, um siRNA-vermittelten Gen-Silencing zu erreichen. Wir beschreiben hier eine maßgeschneiderte Zwei-Kanal gleichzeitige Erfassung TIRF Mikroskop, das chromatisch korrigiert wird, und erfordert keine separate Ausrichtung für verschiedene Wellenlängen. Diese Funktionen, jedoch sind im Handel erhältlich. Unser System basiert auf den Prinzipien der TIRF-Mikroskopie veröffentlicht von Experten auf diesem Gebiet und ist billiger als kommerzielle Alternativen basieren. Eine mögliche Kritik an unserem Design ist, dass wir mit dem gleichen Einfallswinkel für die verschiedenen Anregungswellenlängen. Dies würde in einer anderen TIRF Eindringtiefe für verschiedene Anregungswellenlängen führen. Wir glauben, dass diese Effekte gering sind, da die evaneszente Welle ist eine exponentiell abklingende Feld und die Tiefe der TIRF Feld ist eine lineare Funktion der Wellenlänge. Fluorophore nahe der Glasoberfläche erleben keinen Unterschied in der Intensitäten zwischen den beiden Wellenlängen. Für Fluorophore in der Nähe des PEnetration Tiefe wird die Intensitätsunterscheidung 1,3-fachen für die beiden Wellenlängen 488 und 640 nm und 1,15-fachen für die beiden Wellenlängen 488 und 561 nm sein. Das gleiche System kann in Verbindung mit Super-Resolution-Techniken, die Verwendung von TIRF-Beleuchtung machen eingesetzt werden. Wir haben auch ein zwei Kamera-System, das speziell angefertigten ist beschrieben. Wie die TIRF-System, sind ähnliche Apparate auch kommerziell erhältlich. Unser System bietet Flexibilität, um die Filter und dichroics zu ändern, was ihre Anwendung bei verschiedenen Kombinationen von Wellenlängen. Der Nachteil des eigenen Systems ist der Grad der Drehung um die beiden Bilder auszurichten. Dieses Problem kann durch die Verwendung Kamera steht, die Piezo angetrieben werden und bieten rotatorischen Ausrichtung gelöst werden. Wir haben auch erfolgreich ein Zwei-Kamera-System auf diesem Mikroskop durchgeführt, in dem die Kameras verschieden sind und unterschiedliche Punktgrößen. Ein solches System wäre nützlich, wenn man brauchte Empfindlichkeit in einen Kanal und einen großen dyDynamikbereich in einem anderen, sind die beide nur selten in der gleichen Kamera zur Verfügung. Wir nutzten die Photometrics HQ-2-Kamera bei 2x2 Binning gibt uns eine effektive Pixelgröße von 12,9 um mit dem Photometrics Quant-EM-Kamera, die eine Pixelgröße von 16 mu m aufweist. Ein 180 mm Brennweite Tubuslinse wurde für die Quant-EM eingesetzt und ein 145 mm Brennweite Tubuslinse wurde für die HQ-2-Kamera verwendet. Der HQ-2 wurde unter Verwendung Metamorph-Software und die Quant-EM wurde über Mikro-Manager-Software auf einem separaten Computer in externe Trigger-Modus gesteuert. Der externe Trigger wurde der Quant-EM-Kamera mit einem digitalen Ausgang des DAC Messung Computing Platine, die als zusätzliche Blende in der configure Beleuchtungseinstellungen Metamorph umgesetzt wurde bereitgestellt. Das Verhältnis der Brennweiten der Tubuslinsen entspricht dem Verhältnis der effektiven Pixelgrößen. Eine repräsentative Ausrichtung in 5 gezeigt.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector Kit für Maus-T-Zellen </td><td> Lonza Inc. </td><td> VPA-1006 </td><td></td></tr><tr><td> PureLink HiPure Plasmid Midiprep Kit </td><td> Life Technologies </td><td> K2100-05 </td><td> Für Endotoxin freie DNA PREPS </td></tr><tr><td> Amaxa Nucleofector- </td><td> Lonza Inc. </td><td> AAD-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Rekombinantes Mäuse-IL-2 </td><td> Peprotech Inc. </td><td> 212-12 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent Microspheres 0.20μm </td><td> Polysciences, Inc. </td><td> 24050-5 </td><td></td></tr><tr><td> Lab-Tek II 8-Well-Kammer-Deckglas </td><td> Thermo Scientific, Nunc </td><td> 155409 </td><td></td></tr></tbody></table>

ein tirf mikroskopie-technik für echtzeit-, einzigartige bilder aus dem tcr und der damit verbundenen signalproteine

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Diese Signalisierung wird durch den T-Zell-Rezeptor (TCR) ausgelöst wird, wenn es durch antigene Peptidfragmente von Haupthistokompatibilitätskomplex (pMHC) Proteine ​​auf der Oberfläche von Antigen präsentierenden Zellen (APC) gebunden zu eingreift. Der TCR-Komplex der Ligandenbindung TCRαβ Heterodimer besteht, das nicht-kovalent assoziierten mit CD3-Dimere (die εδ und εγ Heterodimere und die ζζ Homodimer) 1. Beim Eingriff des Rezeptors, werden die CD3 ζ-Ketten der Src-Familie-Kinase phosphoryliert, Lck. Dies führt zur Rekrutierung der Syk-Familie-Kinase, ZAP70, der dann phosphoryliert wird und durch Lck aktiviert. Danach phosphoryliert ZAP70 den Adapter Proteine ​​LAT und SLP76, initiiert die Bildung des proximalen Signalkomplex, die eine große Anzahl verschiedener Signalmoleküle 2. Die Bildung dieses Komplexes führt schließlich zu Kalzium-und Ras-abhängige transcription Faktor Aktivierung und die daraus folgende Einleitung einer komplexen Reihe von Genexpression, die Anlass zu T-Zell-Differenzierung 2. TCR-Signale (und die daraus resultierende Zustand der Differenzierung) moduliert werden von vielen anderen Faktoren ab, einschließlich Antigen Potenz und Übersprechen mit co-stimulatory/co-inhibitory, Chemokin-und Zytokin-Rezeptoren 3-4. Die Untersuchung der räumlichen und zeitlichen Organisation des proximalen Signalkomplex unter verschiedenen Bedingungen Stimulation ist somit Schlüssel zum Verständnis der TCR-Signalwegs sowie deren Regulation durch andere Signalwege. Ein sehr nützliches Modell zu untersuchenden System Signalisierung von der TCR an der Plasmamembran in T-Zellen initiiert ist Glas-Lipiddoppelschichten, wie zuvor beschrieben 5-6. Sie können verwendet werden, um antigene pMHC Komplexen, Adhäsion und co-stimulatorische Moleküle an T-Zellen-APC, die als künstliche präsentieren. Durch die Abbildung die T-Zellen der Interaktion mit demLipid-Doppelschicht mit innerer Totalreflexion (TIRFM), können wir die Erregung zu beschränken innerhalb von 100 nm von dem Raum zwischen dem Glas und der Zelloberfläche 7-8. Dies erlaubt uns, in erster Linie die Bild Signalisierung Ereignisse an der Plasmamembran. Wie wir in der Abbildung der Einstellung von Signalproteinen an den TCR-Komplex interessiert sind, beschreiben wir ein Zwei-Kamera-TIRF Abbildungssystem, wobei das TCR, mit fluoreszierenden markierten Fab (Fragment antigen-binding) Fragmente des H57-Antikörper (aufgereinigt aus Hybridom H57-597 , ATCC, ATCC Nummer: kann HB-218), die spezifisch für TCRβ ist, und Signalproteine, markiert mit GFP, gleichzeitig und in Echtzeit abgebildet werden. Diese Strategie ist notwendig aufgrund der hohen Dynamik sowohl der T-Zellen und der Signalwege, die an der TCR auftreten werden. Diese bildgebenden Verfahren hat die Forscher einzelne Bild 9-11 Liganden sowie Rekrutierung von Signalmolekülen an aktivierten Rezeptoren und erlaubtist ein ausgezeichnetes System für Biochemie in-situ 12-16 studieren.

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Die Signalkaskade wird über den T-Zell-Rezeptor (TCR) initiiert, wenn dieser durch an den Major-Histocompatibility-Complex (MHC) gebundene antigene Peptidfragmente aktiviert wird ...

In diesem Video wird ein Verfahren zur Verfolgung von T-Zell-Rezeptor-Signalereignissen mithilfe der simultanen Aufnahme in zwei Kanälen beschrieben. Zunächst werden T-Zellen mittels Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie oder TIRF-Mikroskopie mit einem Plasmid transfiziert, das GFP-markiertes ZAP-70 kodiert. Eine glasgestützte Lipiddoppelschicht, die peptidverankerte Lipide enthält, sowie MHC-Komplexe, Adhäsionsmoleküle und kostimulatorische Moleküle werden hergestellt.Die mit ZAP 70 transfizierten T-Zellen werden hinzugefügt, sobald die T-Zell-Rezeptoren durch Peptid-MHC-Komplexe aktiviert werden. Die mit dem T-Zell-Rezeptor assoziierten CD3-Ketten werden durch die SARC-Familienkinase LCK phosphoryliert, und die Kinase ZAP 70 wird aus dem Cytoplasma rekrutiert. Anschließend werden die T-Zell-Rezeptoren fluoreszenzmakiert, und es wird eine Bildgebung durchgeführt, bei der die Zellen in einem Medium mit niedrigerem Brechungsindex als das Deckglas liegen und mit einem Laserstrahl unter einem Winkel beleuchtet werden, der Totalreflexion bewirkt.Dadurch entsteht an der Grenzfläche zwischen Glas und Wasser eine evaneszente Welle, die exponentiell in das Medium eindringt und eine Eindringtiefe von 100 bis 200 Nanometern ermöglicht. Daher werden nur Fluorophore in der Plasmamembran oder in unmittelbarer Nähe dazu angeregt. Die Analyse der entstandenen Bilder zeigt, dass die Signalübertragung in mikroskopischen T-Zell-Rezeptor-Clustern stattfindet.Der Hauptvorteil der Rasenmikroskopie oder der herkömmlichen konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass man eine bessere Auflösung erhält, wodurch Signalkomplexe oder Signalcluster wie TCR-Mikrocluster leicht sichtbar gemacht werden können. Travis Crites und Chen, beide Postdoktoranden in meinem Labor, werden demonstrieren, wie man primäre Maus-T-Zellen mittels der Maxi-Nukleofektions-Technologie transfiziert und anschließend mittels Total-Reflexions-Fluoreszenzmikroskopie oder TURF-M bildet, wobei die Zellen mit einer Glasoberfläche stimuliert werden, die eine Lipid-Doppelschicht mit Antigen enthält.Diese Methode wurde umfassend zur Untersuchung der Signalübertragung in verschiedenen Immunzellen eingesetzt, einschließlich T-Zellen, B-Zellen, natürlichen Killerzellen und Mastzellen. Die Methode ist breit anwendbar und kann zur Untersuchung der meisten Rezeptorsysteme in Säugetierzellen verwendet werden, insbesondere wenn die Signalübertragung in Clustern erfolgt. Personen, die neu in der Methode sind, könnten anfangs Schwierigkeiten haben, da T-Zellen sehr schwer zu transfectieren sind.Zusätzlich ist eine präzise Abstimmung erforderlich, damit die T-Zell-Vitalität und Transfektions-Effizienz, die Qualität der Bilar-Präparate sowie die Ausrichtung des Mikroskops den Anforderungen genügen. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, entweder naive oder in vitro aktivierte primäre T-Zellen mit Expressionsplasmiden zu transfizieren, die kodierende Signalmoleküle enthalten, die mit GFP markiert sind, und zwar unter Verwendung eines AM Maxa Mouse T-Cell Nucleo Effector Kits. Alle in dieser Studie verwendeten T-Zellen exprimierten den A-N-D-T-C-R, der das an das MHC-Molekül IE von K gebundene MCC-Peptid erkennt. Das hier gezeigte Transfektionsverfahren wird gemäß den Herstellerempfehlungen durchgeführt.Es werden jedoch einige Tipps gegeben, die die Vitalität der T-Zellen nach der Transfektion fördern. Sowohl die Vitalität als auch die Transfektionseffizienz sind bei in vitro aktivierten T-Zellen höher als bei naiven Zellen; daher verwendet dieses Protokoll vor Versuchsbeginn in vitro aktivierte T-Zellen. Bereiten Sie für jede Transfektion zwei Milliliter ergänztes T-Zell-Medium vor, indem Sie 1,9 Milliliter des im Kit enthaltenen Mediums, 20 Mikroliter Komponente A, 20 Mikroliter Komponente B und 100 Mikroliter fetalen Kälberserum in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen kombinieren.Übertragen Sie zwei Milliliter Medium in jede Vertiefung einer 12-Loch-Platte. Stellen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C, damit sich das Medium anpassen kann. Zelltod tritt auf, wenn transfizierte Zellen in kaltem Medium oder in Medium mit einem pH-Wert abweichend von 7,2 resuspendiert werden. Um die Transfektionsmischung herzustellen, mischen Sie 82 µL Maus-T-Zell-Nukleo-Effektor-Lösung mit 18 µL Supplement zwei und fünf µg endotoxinfreier Plasmid-DNA mit einer Konzentration von nicht weniger als 0,5 µg/µL durch vorsichtiges Antippen gründlich. Überführen Sie fünf bis zehn Millionen Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 75 × g. Entfernen Sie mithilfe eines Vakuumaspirators so viel wie möglich vom Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig im Transfektionsgemisch, wobei Sie das Zellpellet langsam drei bis vier Mal ansaugen, bis keine größeren Zellklumpen mehr vorhanden sind. Übertragen Sie die Suspension vorsichtig mit einer Pipette in eine zertifizierte Amaxa-Viete, wobei sicherzustellen ist, dass keine Bläschen enthalten sind.Schließen Sie das qve, wählen Sie das nukleäre Effektor-Programm X 0 0 1 am Nukleo-Effektor-Gerät aus. Führen Sie das vete in den Q-vete-Halter ein und drücken Sie die Taste, um das ausgewählte Programm anzuwenden. Überführen Sie anschließend das vete und das vorab äquilibrierte Kulturmedium unverzüglich in den Sicherheitswerkbank.Unter Verwendung der beigefügten Plastikpipette etwa 500 Mikroliter des vorgewässerten Mediums in die Vertiefung geben. Anschließend die Zellsuspension tropfenweise zum Medium in der Platte hinzufügen.Die Zellen für vier Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren, um eine schwache Expression der mit GFP markierten Proteine zu ermöglichen und das Auftreten von Artefakten durch Überexpression zu minimieren. In diesem Abschnitt wird eine Methode zur Justage des Mikroskops für die simultane Zweikanal-Aufnahme beschrieben, bevor alle Komponenten des Mikroskops eingeschaltet werden. Schalten Sie den Computer und die Software ein.Danach sicherstellen, dass alle Hardware-Komponenten von der Software erkannt werden. Da die Software ohne Fehlermeldungen startet, wurden alle Komponenten erkannt. Ein Mikroliter Sub-Resolution verdünnen.Die Flores-Bright-Multi-Fluoreszenz-Mikrokügelchen in zwei Milliliter PBS geben, um sie als Kollokalisierungsstandard zu verwenden. Anschließend 0,25 Milliliter der Mikrokügelchen-Suspension in jede Vertiefung eines achtbrüchigen Lab-Tech-Kammernobjektträgers hinzufügen. Das Kammersystem auf die Plattform über dem Objektiv stellen.Bringen Sie dann die Beads, die das Licht absorbieren, mit dem Glas auf der Live-Vorschau in den Fokus. Im linken Fensterbereich ist der Kanal dargestellt, in dem die GFP-transfizierten Zellen sichtbar sein werden. Im rechten Fensterbereich werden während der Live-Cell-Bildgebungsexperimente markierte TCR sichtbar sein.Stellen Sie mithilfe der Y-Ausrichtung des XY-, Z-Faserankopplungsmoduls die Position des Laserstrahls so ein, dass der Strahl aus dem Objektiv austritt und an die Decke projiziert wird. Dies ist wichtig, wenn sich das Objektiv in der Position befindet, in der die Glasoberfläche scharfgestellt ist. Wenn der Strahl an der Decke gestreut erscheint, ist der Strahl nicht kollimiert.Stellen Sie den Z-Mikrometer ein, um eine vollständige Kollimation für jede der im Experiment verwendeten Laserlinien zu erreichen. Anschließend stellen Sie mithilfe eines Laserleistungsmessgeräts die Laserleistung für jeden Kanal auf 20 bis 30 Mikrowatt ein. T-Zellen sind äußerst empfindlich gegenüber Laserstrahlung, weshalb die Beleuchtung auf insgesamt 50 Mikrowatt begrenzt ist.Als Nächstes den Winkel für das Rasenstück einstellen. Den Y-Ausrichtungsmikrometer am Faseranfang drehen, um den Strahl so lange von der Decke wegzubewegen, bis sein Winkel bezüglich der optischen Achse des Objektivs 90 Grad annähert.Sobald der Grenzwinkel für totale interne Reflexion erreicht ist, verlässt das Laserlicht das Objektiv nicht mehr. Um zu beurteilen, ob eine gute Turf-Ausrichtung erreicht wurde, fokussieren Sie durch die Ebene des Deckglases nach oben und unten. Beachten Sie hierbei, dass beim Aus-dem-Fokus-Bewegen der an die Oberfläche adsorbierten Perlen viele Perlen in Lösung schwebend sichtbar sind. Um eine gute Turf-Ausrichtung zu erreichen, ist es notwendig, den Winkel des Strahls bezüglich des Objektivs zu erhöhen.Wenn der Winkel des Strahls erhöht wird, beginnen die nahe der Oberfläche schwimmenden Kügelchen zu verschwinden, und die an der Grenzfläche adsorbierten Kügelchen nehmen an Intensität zu. Wenn nun die an der Grenzfläche adsorbierten Kügelchen aus dem Fokus gebracht werden, sind keine in der Lösung schwimmenden Kügelchen mehr sichtbar. Zu diesem Zeitpunkt ist der Aufbau korrekt ausgerichtet, da nur die an dem Deckglas adsorbierten Kügelchen im Fokus sein können.Danach, um die roten und grünen fluoreszierenden Kanäle zueinander auszurichten, fokussieren Sie sich auf die Perlen und vergleichen Sie die Position erkennbarer Merkmale in den Bildern beider Kanäle. Mithilfe der X- und Y-Feintriebschrauben an einem der Kamerastative bringen Sie die relative Position der Perlen so nah wie möglich aneinander heran. Achten Sie dabei auf die helle Perle im linken unteren Quadranten beider Bilder, um die räumliche Ausrichtung zwischen den beiden Kanälen sicherzustellen.Dieses Merkmal wird in beiden Bildern an derselben relativen Position dargestellt. Erfassen und speichern Sie das Bild aus beiden Kanälen. Diese Bilder werden als Kollokalisierungsstandard verwendet, um die beiden Kanäle auszurichten.Ein Beispiel dieser Ausrichtung ist hier vor der Ausrichtung zu sehen. Einer der Kanäle ist gegenüber dem anderen gedreht, wie in diesem Bild gezeigt, in dem die Bilder der beiden Kanäle der subauflösenden Perlen überlagert sind. Nach den Anpassungen sind die Bilder wie hier gezeigt ausgerichtet.Die Qualität der Ausrichtung kann weiter überprüft werden, indem Bilder von GFP-transfizierten lebenden Zellen verglichen werden. Achten Sie darauf, wie die Laila-Podiums der beiden Kanäle perfekt übereinanderliegen, nachdem die beiden Bilder mithilfe der Kalibrierung, die mit fluoreszierenden Mikroperlen erstellt wurde, ausgerichtet wurden.Nachdem das Mikroskop eingerichtet ist, werden Flusskammern vorbereitet, die auf Glas unterstützte Lipiddoppelschichten enthalten, auf denen Antigen präsentiert wird, und es wird turf M durchgeführt, um TRANSFEKTIERTE T-Zellen zu visualisieren, die mit dem Substrat interagieren. Gemäß der von Ana und Dustin beschriebenen Anleitung wird eine Flusskammer mit planaren Lipiddoppelschichten auf einem Glasdeckchen, das NI NTA-Lipide, das Adhäsionsmolekül ICAM-1 sowie Peptid-MHC-Komplexe enthält, zusammengestellt. MCC-beladene IEFK werden über Histidin-Tags in die Doppelschicht eingebaut.Das kostimulatorische Molekül CD 80 wird eingebaut. Mithilfe eines GPI-Ankers wird die Flusszelle auf dem Mikroskoptisch positioniert und durch Befestigung der Kammer an einer Adapterplatte auf dem Mikroskoptisch mit einer Spannleiste fixiert, um sie zu stabilisieren. Anschließend wird das vom Hersteller mitgelieferte Heizelement an der Flusszelle angebracht, um deren Temperatur zu regulieren.Positionieren Sie das Objektiv auf einer Doppelschicht und fokussieren Sie die Ebene der Doppelschicht, um das Objektiv und die Durchflusszelle zu erwärmen. Schalten Sie die Heizungen der Durchflusszelle und des Objektivs ein, um die Kammer auf 37 Grad Celsius aufzuheizen. Nach vierstündiger Inkubation überführen Sie die durchtrennten T-Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren mit einer Geschwindigkeit von 80 × g. Resuspendieren Sie die Zellen in 300 µL H-B-S-B-S-A-Puffer. Geben Sie anschließend H 57 FAB oder H 57 single chain variable fragment hinzu, um den TCR zu markieren, und zwar mit einer Endkonzentration von 10 µg/mL für FAB bzw. 20 µg/mL für das single chain variable fragment.Überführen Sie die Zellen in ein fünf Milliliter fassendes FACS-Röhrchen. Danach injizieren Sie die Zellen mithilfe einer Ein-Milliliter-Spritze mit Luer-Anschluss über ein Dreiwegventil in die Durchflusskammer. Richten Sie die Bildgebungsbedingungen so ein, dass die Live-Aufnahme mit zwei Kanälen eine Echtzeitvorschau der TCR- und GFP-Kanäle zeigt, und suchen Sie ein Feld mit transfizierten Zellen.Aufgrund von Intensitätsunterschieden zwischen TCR und GFP muss die Skalierung der Bilder möglicherweise in Echtzeit angepasst werden, damit die Zellen in beiden Kanälen sichtbar sind. Wie hier dargestellt, bestätigen Sie die Beleuchtung des Feldes, indem Sie die Fokusebene auf die Glasoberfläche anheben, um eine seitliche Membranfärbung zu erkennen. Wenn die seitlichen Membranen nicht scharf gestellt werden können, ist die Ausrichtung des Feldes korrekt.In dieser Live-Vorschau ist eine Färbung der lateralen Membran sowohl in der Ebene der Deckglasoberfläche als auch sichtbar, wenn das Deckglas aus dem Fokus bewegt wird, um die Mikroskopeinstellung auf eine optimale Turf-Ausrichtung zu bringen. Der Winkel des Lasers in Bezug auf das Objektiv wird vergrößert und die laterale Membran gerät aus dem Fokus. Beginnen Sie mit der Aufnahme einzelner Bilder und Zeitrafferserien mit einem Intervall von 10 Sekunden.Die Zellen wurden fünf Minuten lang auf Glas geträgerten und INTA-Bilagen inkubiert, die sechs Moleküle pro Quadratmikrometer Peptid-beladenes, histidinmarkiertes IEFK, 100 Moleküle pro Quadratmikrometer mit Alexa 647 konjugiertes, histidinmarkiertes ICAM-1 sowie 100 Moleküle pro Quadratmikrometer GPI-verankertes CD80 enthielten. Die simultane zweikanalige Aufnahme erfolgte mittels TIRF-Mikroskopie unter kontinuierlicher Anwesenheit des mit Alexa 546 konjugierten H57-Fab-Fragments.Zur Färbung der TCR-Zellen wurden diese bis zu einer Stunde nach dem ersten Kontakt mit dem Bilayer abgebildet. Die Anzahl der ZAP-70-Cluster pro Zelle wurde mithilfe einer automatisierten Software zur Clusterzählung analysiert. In jedem Fall wurden mindestens 40 Zellen analysiert.Die beladenen Peptide sind im Einleger angegeben. ICAM-1 bezieht sich auf Zellen auf Doppelschichten, die 100 Moleküle pro Quadratmikrometer von Alexa 647-konjugiertem His-markiertem ICAM-1 enthalten, wie in der Abbildung dargestellt. Eine ZAP-70-abhängige Signalgebung tritt in TCR-Mikroclustern auf und nur als Reaktion auf agonistische Liganden, wie in diesem Film gezeigt, der mit 10 Sekunden pro Einzelbild aufgenommen wurde.Die TCR-Signalübertragung als Reaktion auf agonistische Peptide wird aufrechterhalten durch die kontinuierliche Bildung von TCR-Mikroclustern im peripheren Bereich der Kontaktzone, die ZAP-70 rekrutieren. Nach dem Ansehen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre T-Zellen mittels einer maxa-nuklearen Transfektionstechnologie transfiziert und die Rekrutierung von GFPT-Signalproteinen zu TCR-Mikroclustern mittels Turf-Mikroskopie korrekt abbildet. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von sieben Stunden durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß ausgeführt wird.Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es wichtig, stets sehr vorsichtig mit den primären Zellen umzugehen. Je gesünder die Zellen in jedem Schritt des Experiments sind, desto höher wird die Transfektionseffizienz sein und desto mehr Zellen werden Sie bei der Bildgebung erfassen können. T-Zellen sind stark beweglich, wodurch die aufeinanderfolgende Aufnahme der TCR- und GFP-Kanäle dazu führt, dass die beiden Bilder aufgrund der Bewegung von TCR-Mikroclustern und der Zellen nicht perfekt übereinstimmen.Um dieses Problem zu lösen, haben wir das Dual-Channel-Simultanerfassungs-Turf-Mikroskop entwickelt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)-Mikroskopie ist eine leistungsfähige Methode, um Strukturen in der Nähe der Zelloberfläche bei hohem Kontrast und zeitlicher Auflösung zu beobachten. Wir zeigen, wie TIRF eingesetzt werden können, um Protein-Dynamik in der Rinde der Zellwand-geschlossenen Zellen von Bakterien und Pilzen zu studieren.

Visualisierung von Cortex Organisation und Dynamik in Mikroorganismen, mit Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

Dieses Video beschreibt TIRF, eine auf Totalreflexionsmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der Polymerisationsdynamik von Aktin und Mikrotubuli. Die Methode ermöglicht die hochauflösende Abbildung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in Echtzeit, was für das Verständnis zellulärer Wechselwirkungen unerlässlich ist.

TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Quelle: Daniele, F., et. al TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden zur Bewertung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Zellbildgebung und Datenanalyse. J. Vis. exp. (2015). Dieses Video zeigt die Bildgebung von humanen Neuroblastomzellen mit einem Totalreflexionsfluoreszenzmikroskop (TIRF), um mit Fluorophoren markierte synaptische Vesikel sichtbar zu machen. Die Zellen werden zunächst im Epifluoreszenzmodus fokussiert. Anschließend werden Anpassungen vorgenommen,...

Zellbildgebung mittels Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Clathrin-vermittelte Endozytose, ein schneller und hochdynamischer Prozess, der viele Proteine, einschließlich Signalrezeptoren, internalisiert. Das hier beschriebene Protokoll visualisiert direkt die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse. Dies ist wichtig, um zu verstehen, wie die Kernmitglieder der endozytischen Maschinerie miteinander harmonieren und wie die Proteinfracht diesen Prozess beeinflusst.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Dieses Manuskript beschreibt, wie (Einzelmoleküle) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-basierte Assays durchgeführt werden, um die Bindungsdynamik zwischen T-Zell-Antigenrezeptoren (TCR) und antigenen, peptidbeladenen MHC-Molekülen zu messen, wie sie in der immunologischen Synapse einer T-Zelle in Kontakt mit einer funktionalisierten planar gestützten Lipiddoppelschicht auftreten.

Mess TCR-pMHC Binding<em&gt; In-situ-</em&gt; Mit einem FRET-Mikroskopie Assay

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter  In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Wir stellen ein Protokoll zur Implementierung der Interferenzreflexionsmikroskopie und der Total-Interreflexions-Fluoreszenzmikroskopie für die gleichzeitige Abbildung von dynamischen Mikrotubuli und fluoreszenzmarkierten Mikrotubuli-assoziierten Proteinen vor.

Simultane Interferenzreflexion und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie zur Abbildung dynamischer Mikrotubuli und assoziierter Proteine

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Erfahren Sie eine TIRF-Mikroskopie-Methode zur Echtzeit-Visualisierung von T-Zell-Rezeptor-Signalwegen in primären Maus-T-Zellen. Diese Technik ermöglicht die hochauflösende Analyse von Protein-Interaktionen in TCR-Mikroclustern.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

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