Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Dieses Video beschreibt ein Verfahren zur Verfolgung von T-Zell-Rezeptor-Signalereignissen mit Hilfe der gleichzeitigen Zweikanalerfassung. Die ersten T-Zellen der Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie oder der Rasenmikroskopie werden mit einem Plasmid transfiziert, das für GFP kodiert, markiert ZAP 70, eine glasgestützte Lipiddoppelschicht, die ein lipidverankertes Peptid enthält. MHC-Komplexe, Adhäsionsmoleküle und co-stimulatorische Moleküle werden hergestellt.

Die transfizierten T-Zellen von ZAP 70 werden der Doppelschicht hinzugefügt, wenn die T-Zell-Rezeptoren von Peptid-MHC-Komplexen aktiviert werden. Die T-Zell-Rezeptor-assoziierten CD-Drei-Ketten werden durch die SARC-Familie Kinase LCK phosphoryliert, und die Kinase zap 70 wird aus dem Zytoplasma rekrutiert. Der T-Zell-Rezeptor wird dann fluoreszenzmarkiert und es wird eine Bildgebung durchgeführt, bei der die Zellen in ein Medium mit niedrigerem Brechungsindex als das Deckglas getaucht und von einem Laserstrahl in einem Winkel beleuchtet werden, der einer Totalreflexion unterzogen wird.

Dabei wird an der Grenzfläche des Glaswassers eine evaneszente Welle erzeugt, die exponentiell in das Medium zerfällt und eine Eindringtiefe von 100 bis 200 Nanometern ermöglicht. So werden nur Fluor-Viere in der Plasmamembran oder in unmittelbarer Nähe davon angeregt. Die Analyse der resultierenden Bilder zeigt, dass die Signalübertragung in T-Zell-Rezeptor-Mikroclustern stattfindet.

Der Hauptvorteil der Rasenmikroskopie oder der konventionellen konfokalen Mikroskopie besteht darin, dass Sie eine bessere Auflösung erhalten, so dass Signalcluster oder Signalkomplexe wie TCR-Mikrocluster leicht sichtbar gemacht werden können. Travis Crites und Chen. Beide Postdocs in meinem Labor werden zeigen, wie man primäre T-Zellen der Maus mit der Maxi-Nucleo-Affection-Technologie transfiziert und sie dann mit Hilfe der Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie abbildet oder Torf M mit Glas aus einer antigenhaltigen Vogellipid-Gallenschicht stimuliert.

Diese Methode wurde ausgiebig eingesetzt, um die Signalübertragung in verschiedenen Immunzellen zu untersuchen, darunter T-Zellen, B-Zellen, natürliche Killer- und Masterzellen. Die Methode ist breit anwendbar und kann zur Untersuchung der meisten Rezeptorsysteme in Säugetierzellen verwendet werden, insbesondere wenn die Signalübertragung in Clustern erfolgt. Personen, die neu in der Methode sind, können anfangs Schwierigkeiten haben, da T-Zellen sehr schwer zu transfizieren sind.

Darüber hinaus ist eine präzise Abstimmung erforderlich, damit die T-Zell-Viabilität und Transfektionseffizienz, die bilare Qualität sowie die Mikroskopausrichtung auf dem neuesten Stand sind. Der erste Schritt dieses Verfahrens besteht darin, entweder naive oder in vitro aktivierte primäre T-Zellen mit Expressionsplasmiden und kodierenden Signalmolekülen, die mit GFP markiert sind, unter Verwendung eines AM maxa-Maus-T-Zell-Nukleo-Effektor-Kits zu transfizieren. Alle in dieser Studie verwendeten T-Zellen exprimierten das A-N-D-T-C-R, das das MCC-Peptid erkennt, das im MHC-Molekül IE von K gefunden wurde. Das hier gezeigte Transfektionsverfahren wird gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt.

Es werden jedoch einige Tipps vorgestellt, die die Lebensfähigkeit der T-Zellen nach der Transfektion fördern. Sowohl die Lebensfähigkeit als auch die Transfektionseffizienz sind in in vitro aktivierten T-Zellen höher als in naiven Zellen, weshalb dieses Protokoll in vitro aktivierte T-Zellen verwendet, bevor begonnen wird. Bereiten Sie zwei Milliliter supplementiertes T-Zell-Medium für jede Transfektion vor, indem Sie 1,9 Milliliter des im Kit enthaltenen Mediums, 20 Mikroliter Komponente, A 20 Mikroliter Komponente B und 100 Mikroliter fötales Rinderserum in einem Zwei-Milliliter-Röhrchen kombinieren.

Übertragen Sie zwei Milliliter Medium in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte. Stellen Sie die Platte mindestens eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einen befeuchteten Inkubator, damit das Medium den Zelltod ausgleichen kann. Die Resus-Suspension der transfizierten Zellen in einem Medium, das kalt ist oder keinen pH-Wert von 7,2 hat. Zur Herstellung des Transfektionsgemisches werden 82 Mikroliter Maus-T-Zell-Nukleoeffektorlösung mit 18 Mikrolitern Zusatz zwei und fünf Mikrogramm endotoxinfreier Plasmid-DNA in einer Konzentration von nicht weniger als 0,5 Mikrogramm pro Mikroliter kombiniert, die durch Klopfen gründlich gemischt werden.

Übertragen Sie fünf bis 10 Millionen Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie nach dem Schleudern fünf Minuten lang bei 75-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur. Verwenden Sie einen Vakuumsauger, um so viel Überstand wie möglich zu entfernen, um das Zellpellet in der Transfektionsmischung wieder zu suspendieren, saugen Sie das Zellpellet vorsichtig und langsam drei- bis viermal an, bis keine großen Zellklumpen mehr übrig sind. Die Suspension wird mit einer Pipette vorsichtig in eine zertifizierte Amaxa Vete überführt, wobei darauf geachtet wird, dass keine Blasen vorhanden sind.

Befestigen Sie das qve select nukleare Effektorprogramm X 0 0 1 auf dem Nukleoeffektor. Setzen Sie den Vete in den Q vete Halter ein und drücken Sie die Taste, um das ausgewählte Programm anzuwenden. Übertragen Sie dann sofort das vete und das voräquilibrierte Nährmedium in die Haube.

Geben Sie mit der mitgelieferten Kunststoffpipette ca. 500 Mikroliter des voräquilibrierten Mediums in die Vete. Geben Sie dann die Zellsuspension zum Medium in der Platte. Tropfen für Tropfen.

Inkubieren Sie die Zellen vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um eine geringe Expression der GFP-markierten Proteine zu ermöglichen und das Auftreten von Artefakten durch Überexpression zu minimieren. In diesem Abschnitt wird ein Verfahren zum Ausrichten des Mikroskops für die simultane Zweikanal-Bildgebung beschrieben, bevor alle Komponenten des Mikroskops eingeschaltet werden. Starten Sie den Computer und die Software.

Stellen Sie dann sicher, dass alle Hardwarekomponenten von der Software erkannt werden. Da die Software ohne Fehlermeldungen startet, wurden alle Komponenten erkannt. Verdünnen Sie einen Mikroliter der Unterauflösung.

Die Flores hellen Multi-Fluoreszenz-Mikrosphären werden in zwei Milliliter PBS umgewandelt, um sie als Kolokalisationsstandard zu verwenden. Geben Sie dann 0,25 Milliliter der Mikrosphärensuspension in jede Vertiefung eines Lab Tech Acht-Well-Deckglassystems. Platzieren Sie das Kammerschiebesystem auf der Plattform über dem Objektiv.

Bringen Sie dann die auf das Glas absorbierten Kügelchen in der Live-Vorschau in den Fokus. Der linke Bereich ist der Kanal, in dem GFP-transfizierte Zellen sichtbar sein werden. Im rechten Bereich wird während der Bildgebungsexperimente mit lebenden Zellen der beschriftete TCR angezeigt.

Passen Sie mit der Y-Ausrichtung des XY- und Z-Faserstarts die Position des Laserstrahls so an, dass der Strahl aus dem Objektiv austritt und an die Decke projiziert wird. Es ist wichtig, dies zu tun, wenn sich das Objektiv in der Position befindet, in der die Glasfläche scharf ist. Wenn der Balken an der Decke diffus ist, wird der Balken nicht sortiert.

Stellen Sie das Z-Mikrometer so ein, dass für jede der im Experiment zu verwendenden Laserlinien eine vollständige Sortierung des Sortierungstests erreicht wird. Stellen Sie dann mit einem Laserleistungsmesser die Laserleistung auf 20 bis 30 Mikrowatt für jeden Kanal ein. T-Zellen sind extrem empfindlich gegenüber Laserstrahlung und die Beleuchtung ist auf insgesamt 50 Mikrowatt begrenzt.

Weiter, um den Winkel für den Rasen festzulegen. Drehen Sie das Y-Ausrichtungsmikrometer an den Faserstart, um den Strahl bis zu seinem Winkel von der Decke weg zu bewegen. In Bezug auf die Objektive nähert sich die optische Achse 90 Grad.

Sobald der kritische Winkel für die interne Totalreflexion erreicht ist, verlässt das Laserlicht das Objektiv nicht mehr. Um zu beurteilen, ob die Ausrichtung des Rasens erreicht ist, fokussieren Sie durch die Ebene des Deckglases nach oben und unten. Beachten Sie hier, dass, wenn die Kügelchen an der Oberfläche absorbiert werden, unscharf gebracht werden, viele Kügelchen in Lösung schwimmen. Um eine gute Ausrichtung des Rasens zu erreichen, ist es notwendig, den Winkel des Balkens in Bezug auf das Objektiv zu vergrößern.

Wenn der Winkel des Strahls vergrößert wird, beginnen die Kügelchen, die in der Nähe der Oberfläche schweben, zu verschwinden und die an der Grenzfläche absorbierten Kügelchen nehmen an Intensität zu. Wenn nun die an der Grenzfläche absorbierten Kügelchen aus dem Fokus gebracht werden, bleiben keine in Lösung schwimmenden Kügelchen sichtbar. Zu diesem Zeitpunkt ist der Rasen richtig ausgerichtet, da nur die Sicken, die vom Deckglas absorbiert werden, hinein gelangen können. Brennpunkt.

Um als Nächstes die roten und grünen fluoreszierenden Kanäle zueinander auszurichten, konzentrieren Sie sich auf die Kügelchen und vergleichen Sie die Position identifizierbarer Merkmale in den Bildern, die in beiden Kanälen erzeugt wurden. Bringen Sie mit den X- und Y-Mikrometerschrauben an einem Kamerastativ die relative Position der Perlen so nah wie möglich zusammen. Hier. Beachten Sie die helle Perle im unteren linken Quadranten beider Bilder, um die räumliche Ausrichtung zwischen den beiden Kanälen sicherzustellen.

Diese Funktion wird in beiden Bildern auf die gleiche relative Position gebracht. Erfassen und speichern Sie das Bild von beiden Kanälen. Diese Bilder werden als Kolokalisierungsstandard verwendet, um die beiden Kanäle auszurichten.

Ein Beispiel für diese Ausrichtung ist hier vor der Ausrichtung zu sehen. Einer der Kanäle ist in Bezug auf den anderen gedreht, wie in diesem Bild gezeigt, in dem Bilder aus den beiden Kanälen der Unterauflösungsperlen überlagert sind. Nach den Anpassungen werden die Bilder wie hier gezeigt ausgerichtet.

Die Qualität des Alignments kann durch den Vergleich von Bildern von GFP-transfizierten lebenden Zellen weiter untersucht werden. Beachten Sie, wie das Laila-Podium aus den beiden Kanälen perfekt ausgerichtet ist. Nach dem Ausrichten der beiden Bilder mit der Kalibrierung, die mit den fluoreszierenden Mikrokügelchen vorgenommen wurde.

Sobald das Mikroskop eingerichtet ist, werden Durchflusskammern mit glasgestützten Lipiddoppelschichten vorbereitet, die Antigen präsentieren, und Turf M wird durchgeführt, um zuerst TRANSFIZIERTE T-Zellen zu visualisieren, die mit dem Substrat interagieren. Gemäß dem von Ana und Dustin beschriebenen Protokoll wird eine Strömungskammer mit planaren Lipiddoppelschichten zusammengebaut, die auf einem Glasdeckglas gebildet sind und NI NTA-Lipide, das Adhäsionsmolekül ICAM one und Peptid-MHC-Komplexe enthalten. MCC-geladene IEFK werden über Histidin-Tags in die Doppelschicht eingebaut.

Das co-stimulatorische Molekül CD 80 ist eingebaut. Platzieren Sie die Durchflusszelle mit einem GPI-Anker auf dem Tisch des Mikroskops und stabilisieren Sie sie, indem Sie die Kammer mit einer Zugstange an einer Adapterplatte auf dem Mikroskoptisch befestigen, um sie zu fixieren. Befestigen Sie anschließend das vom Hersteller bereitgestellte Heizelement an der Durchflusszelle, um die Temperatur zu regeln.

Positionieren Sie das Objektiv auf einer Doppelschicht und bringen Sie die Doppelschichtebene in den Fokus, um die Erwärmung des Objektivs zu ermöglichen, und schalten Sie die Durchflusszelle und die Objektivheizungen ein, um die Temperatur der Kammer auf 37 Grad Celsius zu bringen. Nach vierstündiger Inkubation werden die durchtrennten T-Zellen in ein 15-Milliliter-Röhrchen überführt und bei einer Geschwindigkeit von 80 G zentrifugiert. Die Zellen werden in 300 Mikrolitern H-B-S-B-S-A-Puffer resuspendiert. Fügen Sie dann H 57 FAB oder H 57 einkettiges variables Fragment hinzu, um den TCR auf eine Endkonzentration von 10 Mikrogramm pro Milliliter für fab oder 20 Mikrogramm pro Milliliter für das einkettige variable Fragment zu markieren.

Übertragen Sie die Zellen auf ein Fünf-Milliliter-Faxrohr. Als nächstes injizieren Sie die Zellen mit einer Ein-Milliliter-Slip-Tip-Spritze über ein Dreiwegeventil in die Durchflusskammer. Richten Sie die Bildgebungsbedingungen so ein, dass die Zweikanal-Live-Erfassung eine Live-Vorschau der TCR- und GFP-Kanäle zeigt und ein Feld mit transfizierten Zellen gefunden wird.

Aufgrund von Intensitätsunterschieden zwischen TCR und GFP muss die Skalierung der Bilder möglicherweise in Echtzeit angepasst werden, damit Zellen in beiden Kanälen sichtbar gemacht werden können. Bestätigen Sie, wie hier, die Rasenbeleuchtung, indem Sie die Glasebene nach oben fokussieren, um seitliche Membranflecken zu erkennen. Wenn die seitlichen Membranen nicht scharf sind, ist die Ausrichtung des Rasens gut.

In dieser Live-Vorschau ist die Verfärbung der lateralen Membran sowohl in der Ebene des Deckglases als auch dann sichtbar, wenn das Deckglas unscharf gebracht wird, um das Mikroskop in eine gute Rasenausrichtung zu bringen. Der Winkel des Lasers in Bezug auf das Objektiv wird vergrößert und die laterale Membran wird unscharf. Beginnen Sie mit der Aufnahme von Einzelbildern und Zeitraffersequenzen im Abstand von 10 Sekunden.

Fünf Minuten lang wurden die Zellen auf glasgestützten und INTA-Doppelschichten mit sechs Molekülen pro Quadrat inkubiert. Mikrometer des Peptids, hist-markiert, IEFK, 100 Moleküle pro Quadratmeter, Mikrometer von Alexa, 6, 4, 7, konjugiert, hist-markiert, ICAM, eins und 100 Moleküle pro Quadrat. Mikrometer der GPI-verankerten CD 80 Zweikanal-Simultanerfassung Rasenmikroskopie wurde in ständiger Anwesenheit von Alexa 5 46 konjugiertem H fünf sieben FAB-Fragment durchgeführt.

Um die TCR-Zellen zu färben, wurden sie bis zu einer Stunde nach dem ersten Kontakt mit der Doppelschicht abgebildet. Die Anzahl der ZAP 70 Cluster pro Zelle wurde mit einer automatisierten Cluster-Zählsoftware analysiert. Es wurden jeweils mindestens 40 Zellen analysiert.

Die geladenen Peptide sind im Einschub angegeben. ICAM eins bezieht sich auf Zellen auf Doppelschichten, die 100 Moleküle pro Quadratmikrometer von Alexa 6, 4, 7 konjugiert enthalten. Seine markierte ICAM eins, wie in der Abbildung zap 70 gezeigt, abhängige Signalübertragung tritt in TCR-Mikroclustern auf und nur als Reaktion auf agonistische Liganden, wie in diesem Film zu sehen ist, aufgenommen mit 10 Sekunden pro Frame.

Die TCR-Signalübertragung als Reaktion auf Agonistenpeptide wird durch die kontinuierliche Erzeugung von TCR-Mikroclustern in der Peripherie der Kontaktfläche aufrechterhalten, die ZAP 70 rekrutieren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man primäre T-Zellen mit einer maxa Nuclear Affection-Technologie transfiziert und die Rekrutierung von GFPT-Signalmolekülen zu TCR-Mikroclustern mithilfe der Turfmikroskopie richtig abbildet. Sobald Sie diese Technik beherrschen, kann sie in sieben Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, sehr schonend mit Ihren Primärzellen umzugehen. Je gesund die Zellen bei jedem Schritt des Experiments sind, desto höher ist Ihre Transfektionseffizienz und desto mehr Zellen erfassen Sie in Ihrer Bildgebung. T-Zellen sind hochgradig mt, was dazu führt, dass die sequentielle Bildgebung des TCR- und GFP-Kanals dazu führt, dass die beiden Bilder aufgrund der Bewegung von TCR-Mikroclustern und -Zellen nicht perfekt ausgerichtet sind.

Um dieses Problem zu lösen, haben wir das Zweikanal-Rasenmikroskop mit simultaner Erfassung entwickelt.