Eine Schritt-für-Schritt-Verfahren zur Rekonstitution eines ABC-Transporter in Nanodisc Lipid Particles

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen A-, B-, C-Transporter einzubauen. In diesem Fall wird der Maltosetransporter malf GK zwei in lösliche Membran-Nanoscheibenpartikel umgewandelt. Dies wird erreicht, indem zunächst das Membrangerüstprotein MSP mit dem Transporter und der richtigen Menge an Lipiden im Detergens mycells gemischt wird.

Der zweite Schritt besteht darin, Styroporkügelchen hinzuzufügen und die Mischung über Nacht sanft zu rocken, wobei das Reinigungsmittel nach und nach von den Kügelchen absorbiert wird, wodurch sich die Nanoscheibenpartikel bilden können. Anschließend werden die Kügelchen durch Sedimentation entfernt. Der letzte Schritt besteht darin, die richtig geformten Scheiben durch Gelfiltrationschromatographie von Aggregaten und unzusammengesetzten Gerüstproteinen zu trennen.

Schließlich wird die Qualität der Scheiben durch native Gelelektrophorese oder Lichtstreuspektroskopie beurteilt. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Methoden wie Liposomen besteht darin, dass Membranproteine und -scheiben in wässriger Lösung perfekt löslich sind. Außerdem sind die Proteindomänen nun von beiden Seiten zugänglich.

Da es jetzt kein Membrankompartiment mehr gibt, konnte ich mit Hilfe von Membrangerüstproteinen die verschiedenen Bandzustände von Membranproteinen einfangen und untersuchen. Vor allem aber kann diese Methode dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Membranproteomik zu beantworten, wie z.B. die Identifizierung neuer Bindungspartner von a-, b- und c-Transportern. Tatsächlich erstrecken sich die Auswirkungen dieser Technik weiter auf die Therapie, da sie bei der Entdeckung von Aktivatoren oder Inhibitoren von Membranproteinen und Rezeptoren helfen kann.

Obwohl diese Methode einfach erscheint, ist bei der Wahl des richtigen Protein-Lipid-Verhältnisses Vorsicht geboten. Im Allgemeinen haben Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten, das richtige Formverhältnis zu berechnen oder die richtige Kontrolle durchzuführen, um die Qualität der Zubereitung sicherzustellen. Daher ist eine visuelle Demonstration dieser Methode für einen neuen Schüler sehr nützlich, um die verschiedenen Schritte und möglichen Schwierigkeiten zu erlernen.

Um mit gro hexa histidin markiertem MSP im e coli Stamm BL 21 DE drei aus dem Plasmid P MSSP 1D eine induzierte Proteinproduktion zu beginnen, wenn die gemessene optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,5 für drei Stunden bei 37 Grad Celsius beträgt, ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 Gs für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Das Pellet wird in einem TSG 10-Puffer, der 100 mikromolare PMSF enthält, erneut suspendiert, und zwar dreimal mit einer französischen Presse bei 8.000 PS. Ich entferne das unlösliche Material durch Zentrifugieren bei 5.000 g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend wird die lösliche Fraktion, die das MSP enthält, durch Ultrazentrifugation bei 125.000 g für 45 Minuten isoliert.

Aufreinigung des MSP durch Nickelchelat-Chromatographie mit ca. 1,5 Millilitern Nickelseros High Performance in TSG 10 Puffer. Waschen Sie die Verunreinigungen mit T SG 10 Puffer mit 50 millimolar ILE-Elut ab. Das MSP mit TSG 10 Puffer mit 600 Millimolar I Midaz nach der Dialysierung.

Das gereinigte Protein in TSG 10 Puffer MSP kann bei minus 70 Grad Celsius und einer Proteinkonzentration von etwa 10 bis 15 Milligramm pro Milliliter gelagert werden. Der MALF GK two-Komplex, der am C-Terminus von MAL K markiert ist, wird aus einem Plasmid exprimiert. PED 22 FG K, gezüchtet im E-Coli-Stamm BL 21 DE, drei induzieren die Proteinproduktion, wenn die gemessene optische Dichte bei 600 Nanometern etwa 0,5 mit 0,2%L Arabern für drei Stunden bei 37 Grad Celsius nach Zelllyse und Zentrifugation beträgt.

Wie zuvor suspendieren wir das Membrangranulat in TSG 20 Puffer auf eine Endkonzentration von fünf Milligramm pro Milliliter. Anschließend wird das Material mit 1 % Gewicht pro Volumen GDM drei Stunden lang bei vier Grad Celsius unter leichtem Schütteln gelöst. Entfernen Sie das unlösliche Material durch Ultrazentrifugation wie bei der Reinigung von MAL FTK two.

Sammeln Sie dann den Überstand, der den löslichen mal-FTK-Zwei-Komplex enthält, und reinigen Sie ihn erneut mit Nickelchelat-Chromatographie. Reinigen Sie den Komplex weiter durch Gelfiltrationschromatographie in TSGD-Puffer auf einer SUEx 200, HR ten threehundred Säule bei einer Flussrate von 0,5 Millilitern pro Minute. Zur Herstellung von Phospholipiden wird ein in Chloroform gelöster E-coli-Gesamtlipidextrakt in Mikrofiche-Röhrchen mit Schraubverschluss in 1000 anomale Aliquote getrennt, das Lösungsmittel unter einem sanften Stickstoffstrom verdampft und über Nacht im Vakuum weiter getrieben.

Als nächstes trocknen Sie, lösen Sie den Lipidfilm in TS-Puffer bei einer Endkonzentration von fünf NMOs auf und wirbeln Sie kräftig vor und pulsieren Sie dann fünfmal für etwa fünf Sekunden. Die gelösten Lipide erscheinen aufgrund ihrer allgemeinen Unlöslichkeit in wässrigem TS-Puffer leicht undurchsichtig, sollten aber in Suspension bleiben. Geben Sie DDM bis zu einer Endkonzentration von 0,5 %An diesem Punkt wird die Lösung klar, geben Sie die Lipidmischung in ein Wasserbad und pulsieren Sie fünfmal für etwa fünf Sekunden.

Das Lipidgemisch kann bei vier Grad Celsius maximal eine Woche gelagert werden. Zur Zubereitung der Bio-Kügelchen ca. 10 bis 15 Milliliter Bio-Kügelchen in ein 50-Milliliter-Röhrchen geben. Waschen Sie die Kügelchen zunächst mit 50 Millilitern 100%Methanol.

Lassen Sie die Kügelchen durch die Schwerkraft absetzen und gießen Sie die Lösung dann vorsichtig ab. Wiederholen Sie den Vorgang einmal für Methanol und dann jeweils zweimal für 95 % Ethanol Milli Q Wasser und schließlich TS-Puffer. Beginnen Sie mit der diskreten Nanokonstitution, indem Sie MSP in TSGD-Puffer auf die Endkonzentration von etwa sieben Milligramm pro Milliliter oder 0,3 Millimolar verdünnen.

Um ein erfolgreiches Experiment zu gewährleisten, ist es wichtig, das richtige Verhältnis von Lipiden und Proteinen zu wählen, die miteinander gemischt werden sollen. Mischen Sie ungefähr zwei M gereinigten Malf GK zwei Komplex bei einem Protein-zu-MS-P-Lipid-Verhältnis von eins zu drei zu 60 in TSGD-Puffer für ein Endvolumen von 300 Mikrolitern, hier wird auch eine Probe des überschüssigen Lipids im Verhältnis von eins zu drei zu 400 wird ebenfalls als Negativkontrolle bei einem 50 Mikroliter Biobead-Suspension in das Röhrchen gegeben und das Gemisch über Nacht auf einem Schaukeltisch bei vier Grad Celsius am nächsten Tag, sedimentieren Sie die Kügelchen durch die Schwerkraft. Sobald sich die Kügelchen abgesetzt haben, spritzen Sie durch eine schmale Spitze auf die Lösung, um so viele Biokügelchen wie möglich zu vermeiden.

Große Ausfällungen werden durch Ultrazentrifugation bei 100.000 GS für 20 Minuten entfernt. Fahren Sie mit der Reinigung der Scheiben durch Gelfiltrationschromatographie fort, wie sie zuvor in TSG 10 Puffer durchgeführt wurde. Injizieren Sie anschließend ein Eloqua auf dieselbe Gelfiltrationssäule, um die Stabilität des Präparats zu testen.

Fassen Sie dann die Fraktionen zusammen, die die Scheiben enthalten. Die Qualität des Präparats wird durch native Gelelektrophorese beurteilt. Analysieren Sie ein Mikromolar von Nanoscheiben, um die Qualität der Rekonstitution zu beurteilen.

Beurteilen Sie auch die Bindung von mal E an den mal ftk, zwei Komplexe, die in Nanoscheiben rekonstituiert sind. Nach der Elektrophorese färben Sie das Gel 10 Minuten lang mit Kumasi-Blau und halten Sie es etwa eine Stunde lang auf. Um eine dynamische Lichtstreuung oder DLS durchzuführen, reinigen Sie zunächst Nanoscheiben wie bisher durch Gelfiltrationschromatographie mit einer SUEx 200 HR Zehn-Dreihunderter-Säule bei einer Flussrate von 0,1 Millilitern pro Minute.

Poolen Sie Fraktionen, die Nanoscheiben enthalten, und konzentrieren Sie sie mit einem AmCon-Zentrifugalfilter auf etwa 10 Milligramm pro Milliliter. Filtern Sie die Probe dann zweimal. Führen Sie die DLS-Analyse mit einem dynapro nano star-Instrument in einem Quarz-Vete-Fit-Daten mit einem Mikroliter-Innenvolumen durch.

Bestimmen Sie mit der dynamischen Software zur Schätzung des Durchmessers und des Molekulargewichts der Partikel die A-TPA-Aktivität von mal FTK zwei rekonstituierten Nanoscheiben mit einem cholemetrischen Assay. Mischen Sie zuerst ein Mikromolar gereinigter Scheiben und ein Millimolar ein TP mit zunehmenden Mengen an mal e. Inkubieren Sie die Proben 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.

Messen Sie dann die Freisetzung von anorganischem Phosphat bei 660 Nanometern. Vergleichen Sie die freigesetzte Phosphatmenge mit einer Standardkurve, die mit einer Phosphor-Standardlösung erzeugt wurde. Die Nanoscheiben werden durch Gelfiltrationschromatographie aufgereinigt.

Das Chromatogramm zeigt, dass die Mehrzahl der rekonstituierten Scheiben als einzelner Peak eluiert, während Scheiben mit überschüssigen Lipiden im Hohlraumvolumen eluieren, und als eine Reihe von breiten Peaks wird die Qualität der Scheibenvorbereitung weiter analysiert, indem native Gelelektrophoresescheiben, die mit einer begrenzten Menge an Lipiden rekonstituiert wurden, als scharfe Bande auf das native Gel wandern. während diejenigen, die in Gegenwart eines Überschusses an Lipiden rekonstituiert werden, als Abstriche wandern. Die Analyse mittels DLS zeigt, dass die Scheibenpopulation mit einem durchschnittlichen Radius von 5,0 Nanometern homogen ist. Basierend auf der DLS-Näherung haben die rekonstituierten Scheiben ein scheinbares Molekulargewicht von 215 Kilodalton. Proben, die in Gegenwart von überschüssigen Lipiden rekonstituiert werden, weisen weit verteilte Radien um 100 Nanometer auf, was für inhomogene Proben typisch ist.

Die Aktivität des MAL FTK two-Komplexes wird durch Messung der Geschwindigkeit einer TP-Hydrolyse und der Affinität zu Interaktionspartnern wie dem Maltose-Bindungsprotein MAL E, dem Maltose-Bindungsprotein, bewertet. MAL E bindet mit einer hohen Affinität zum MAL FTK Zwei-Transporter mittels nicht-denaturierender Gelelektrophorese. Es ist möglich, einen Komplex zwischen MAL E und MAL ftk two nachzuweisen, die Stimulation der MAL KA TPA-Aktivität durch MAL E ist hier in Abhängigkeit von der MAL e-Konzentration dargestellt.

Die Herstellung der Nano-Disc ist relativ einfach, aber kleine Abweichungen von den optimalen Bedingungen können zu einer irreversiblen Proteinaggregation führen: Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als zwei Tagen durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, wie wichtig es ist, ein korrektes Protein-Lipid-Verhältnis zu wählen, da eine übermäßige Menge an Lipiden zur Produktion von großen polydispersen Liposomen-ähnlichen Partikeln führt. Es ist von entscheidender Bedeutung, die Qualität des rekonstituierten Materials mit anderen Techniken als der Gelfiltration sorgfältig zu analysieren, wie z. B. Lichtstreuspektroskopie, analytische Ultrazentrifugation oder einfacher die native Gelelektrophorese.

Denken Sie daran, dass sowohl die Art des Phospholipids, das die Bandscheibe enthält, als auch das des Membrangerüstproteins zur Effizienz der Rekonstitution beitragen können. Wir hoffen, dass Sie nach dem Anschauen dieses Videos ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie lösliche und homogene Nanoscheiben erzeugen können, die das Membranprotein Ihrer Wahl enthalten. Viel Glück bei Ihren Experimenten.