Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen In vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität einzelner Neuronen in vivo aus einer identifizierten neuronalen Population in einem nicht-genetischen Modellsystem aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kraniotomie durchgeführt wird, um die gewünschte Hirnregion freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, mittels Wolframdrähten einen fluoreszierenden Farbstoff in die Region einzubringen, in die die Zielneurone projizieren.

Anschließend wird der Farbstoff retrograd transportiert, was zu einer selektiven Markierung der Projektionsneurone führt. Im letzten Schritt erfolgt die Ableitung von dem markierten Axon des einzelnen Projektionsneurons. Letztendlich werden extrazelluläre Einzelableitungen verwendet, um zu zeigen, wie zentrale sensorische Neurone in einer intakten Verschaltung auf sensorische Reize in vivo reagieren.

Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen darüber zu beantworten, wie neuronale Schaltkreise Unterschiede in der zeitlichen Abfolge synaptischer Eingänge im Submillisekundenbereich wahrnehmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt in der Möglichkeit, gezielt einzelne Neuronen oder sogar Axone sowie nicht-genetisch zugängliche Systeme anzusteuern. Wöchentliche elektrische Fische nutzen elektrische Signale zur Kommunikation und Navigation.

Sie unterscheiden Signale verschiedener Fische anhand von Unterschieden im Bereich von weniger als einer Millisekunde in der zeitlichen Abfolge synaptischer Eingänge. Wir untersuchten, wie die vermuteten Zeitvergleichsneurone in ihrer elektrischen Sinnesbahn derart kleine Zeitunterschiede detektieren können. Doch diese Technik kann auch auf andere Systeme angewandt werden, wie beispielsweise visuelle und auditorische Sinnesbahnen.

Es ist besonders schwierig, Flüssigkeit aus diesen Zellen zu entnehmen, aufgrund ihrer geringen Größe, der dichten Umgebung im umgebenden Gewebe und der präsynaptischen Endigungen, die den größten Teil des Zellkörpers bedecken. Die intrazelluläre Farbstoffinjektion während einer Ganzzell-Aufzeichnung markiert in vitro eine einzelne Zelle, um gezielte Ableitungen von diesem Axon zu führen. Ebenso ermöglicht der retrograde Transport nach extrazellulärer Farbstoffinjektion eine selektive Markierung der Projektionsneurone in oberflächlichen Hirnregionen.

Dies kann zur visuellen Orientierung bei in-vivo-Einzelzellableitungen verwendet werden. Um die mit D codierte Nadel vorzubereiten, elektrolytisch zunächst einen Wolframdraht mit einem Durchmesser von 160 Mikrometern auf einen Nadelspitzenenddurchmesser von fünf bis 50 Mikrometern spitzen. Danach die Nadelspitze am Abend vor dem Experiment mit einer zwei Millimolar Lösung eines 10.000 Molekulargewicht aufweisenden Dextran-konjugierten Alexa-floor-Farbstoffs markieren, um eine Vollnarkose herbeizuführen.

Stellen Sie den Fisch in Beckenwasser mit MS 222-Lösung bei 300 Milligramm pro Liter, um den Fisch zu immobilisieren und elektrisch zu stillen, indem Sie 100 Mikroliter Flail bei drei Milligramm pro Milliliter in die dorsale Körpermuskulatur injizieren. Füllen Sie als Nächstes die Ableitungskammer mit Beckenwasser und legen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten auf die Plattform in der Mitte der Kammer. Leiten Sie dann die belüftete MS 222-Lösung bei 100 Milligramm pro Liter mit einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Milliliter pro Minute zu, indem Sie eine Pipettenspitze in den Mund einführen.

Anschließend stabilisieren Sie den Fisch mithilfe von festen Stäben und Wachs auf beiden Seiten des Körpers. Überwachen Sie den Gesundheitszustand des Fisches, indem Sie den kontinuierlichen Blutfluss in den Augengefäßen sowie eine normale Körperfärbung überprüfen. Drehen Sie anschließend die Plattform entlang der vertikalen Achse.

Stellen Sie ein Ende der Plattform so ein, dass eine Seite der dorsalen Fläche des Fischkopfes über der Wasseroberfläche liegt, während der Rest des Fischkörpers untergetaucht bleibt. Legen Sie ein kleines Stück Kim-Tuch auf jeden nicht untergetauchten Bereich der Haut, um Austrocknung zu verhindern. Tragen Sie in diesem Verfahren 0,4 % Lidocain mit einem Wattestäbchen auf die freiliegende Kopfoberfläche auf.

Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um ein rechteckiges Hautgewebestück von etwa drei Millimetern mal fünf Millimetern bei einem 6,2 Zentimeter langen Fisch zu entnehmen. Die seitliche Kante des Rechtecks sollte mit der Mitte des Auges übereinstimmen. Die vordere Kante des Rechtecks sollte direkt hinter dem Auge liegen, und die mittlere Kante des Rechtecks sollte direkt seitlich zur Mittellinie liegen.

Entfernen Sie anschließend das Rechteck mit einer Pinzette. Schneiden Sie zusätzlich ein 2,5 Millimeter großes Quadrat anterior mely zu, um den Schädel freizulegen. Entfernen Sie durch Abschaben jegliches überschüssige Gewebe mit der Skalpellklinge, um die freigelegte Schädelfläche vollständig zu reinigen.

Anschließend die Oberfläche vollständig mit einem Kim-Tuch und Druckluft trocknen. Danach einen Metallpfosten mit Sekundenkleber auf dem vorderen medialen freigelegten Schädelbereich befestigen. Warten, bis der Kleber vollständig getrocknet ist.

Verwenden Sie einen Zahnarztbohrer mit einer Kugelfräskarbidspitze mit einem Durchmesser von 0,5 Millimeter, um ein Rechteck von etwa zwei Millimetern mal vier Millimetern auf dem Schädel eines 6,2 Zentimeter langen Fisches aufzuzeichnen. Danach schneiden Sie den Umfang des Rechtecks mit dem Skalpell und der Pinzette aus. Anschließend wird der Schädel abgezogen.

Um das Gehirn freizulegen, schneiden Sie sowohl das pigmentierte Dura mater als auch das klare Pia mater mit einer Feder-Schere oder einer Nadel durch. Entfernen Sie anschließend die durchtrennten Anteile mit einer Pinzette, um den anterior extra lateral nucleus und den posterior extra lateral nucleus freizulegen. Positionieren Sie nun einen Manipulator mit einer zuvor präparierten D-beschichteten Nadel über dem Zielbereich, der die Axone von Interesse enthält.

Das hintere extra-laterale Nukleus wird in unserem Fall schnell die Nadel etwa 25 Mikrometer in das Gewebe eingeführt. Nachdem sich der Farbstoff 15 bis 30 Sekunden lang ausgebreitet hat, ziehen Sie die Nadel zurück. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf mit zusätzlichen frischen Nadeln.

Platzieren Sie jede Probe an einer unterschiedlichen Stelle, sodass sich der Farbstoff im Zielbereich verteilt. Spülen Sie anschließend den überschüssigen Farbstoff mit Hickman-Ringer-Lösung aus der Kammer und warten Sie mindestens zwei Stunden, um die Aufnahme und den Transport des Farbstoffs abzuwarten. Um die gewünschten Axone sichtbar zu machen, stellen Sie die Aufnahmekammer mit dem Fisch unter das Objektiv eines aufrechten Epi-Fluoreszenzmikroskops mit feststehendem Objekttisch.

Wechseln Sie die Atmungslösung zu frischem Beckenwasser und halten Sie die gleiche Durchflussrate aufrecht. Anschließend platzieren Sie ein Ende des Erdungsdrahts in der exponierten Gehirnhöhle und verbinden das andere Ende mit der Masse der Aufzeichnungskopfstufe. Danach platzieren Sie ein Paar Ableitelektroden neben der Basis des Schwanzes.

Verbinden Sie dann die Elektroden mit einem Differenzverstärker und einer Aufnahmeeinrichtung. Um den Befehl für die elektrische Organausschüttung (EODC) zu überwachen, fertigen Sie eine maßstabsgetreue Skizze des Gehirnareals an, die bei geringer Vergrößerung unter Einbeziehung großer Blutgefäße als Orientierungspunkte betrachtet wird, um die genaue Lage markierter Axone zu bestimmen. Um die Platzierung von D zunächst zu bestätigen, betrachten Sie das gesamte Gewebe zur Orientierung mit Hellfeldbeleuchtung.

Danach unter fluoreszierender Beleuchtung betrachten. Der hintere laterale Zusatzkern sollte eine diffuse Markierung aufweisen. Anschließend unter hoher Vergrößerung den vorderen lateralen Zusatzkern mit den Gefäßen als Orientierungspunkte lokalisieren.

Beleuchten Sie es mit fluoreszierendem Licht, während Sie mit einer Kapillarglasmikroelektrode aus Borosilikatglas mit Filament und einem Außendurchmesser von einem Millimeter sowie einem Innendurchmesser von 0,58 Millimeter an der Oberfläche nach einem markierten Axon suchen. Ziehen Sie eine Ableitelektrode mit einem fünf Millimeter langen, schmalen Schaft und einer Spitzenöffnung von etwa ein bis 2,4 Mikrometer Durchmesser.

Füllen Sie die Elektrode mit filtrierter Hickman-Ringer-Lösung. Der endgültige Elektrodenwiderstand sollte zwischen 16 und 155 Megaohm liegen. Setzen Sie die Elektrode in einen Elektrodenhalter mit Druckanschluss.

Verbinden Sie es mit der auf einem Manipulator montierten Kopfstufe. Anschließend verbinden Sie die Kopfstufe mit einem Verstärker. Eine analoge Digital-Aufnahmeeinheit, die nicht dargestellt ist, verbindet den Verstärker mit dem Computer.

Anschließend 30 Millibar positiven Druck auf die Elektrodenleitung ausüben. Die Elektrode langsam von der Gewebeoberfläche aus in Richtung des Axons vorrücken lassen. Wenn die Elektrode sich nahe am Axon befindet, sollte der positive Druck eine leichte, aber deutlich wahrnehmbare Bewegung des Axons verursachen, während die Elektrode neben dem Axon liegt.

Notieren Sie die Aktivität während der Präsentation der Testreize. Obwohl ein elektrisches Artefakt die korrekte Aufnahme und Stimulation bestätigt, sollten keine Aktionspotentiale auftreten. Lösen Sie den äußeren Druck in der Elektrode und wiederholen Sie die Stimulation und Aufnahme.

Üben Sie dann leichtes Absaugen aus, wodurch das Axon in die Elektrode hineinbewegt wird. Wiederholen Sie die Stimulation und die Aufzeichnung erneut. Nun sollten Sie einige Aktionspotentiale als Reaktion auf die Stimuli beobachten können.

Sobald Aktionspotentiale sichtbar sind, schließen Sie die Druckleitung. Wenn alle gewünschten Ableitungen abgeschlossen sind, wechseln Sie das Beckenwasser zurück zur Atemlösung mit MS 2 22 bei hundert Milligramm pro Liter, um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig anästhesiert ist. Es sollte mindestens 10 Minuten lang kein EODC nachweisbar sein, bevor der Fisch euthanasiert wird.

Hier sind fünf Beispieltracings, die die Aktionspotentiale zeigen, die durch einen 0,1 Millisekunden langen, sechs Millivolt pro Zentimeter betragenden, monophasischen, kontralateral positiven, transversalen Rechteckimpuls hervorgerufen wurden, sowie ein Rasterplot, der die Spiketimes während von 20 Wiederholungen eines 75 Millisekunden langen Aufnahmezeitfensters für dieselbe Einheit darstellt, die zum Zeitpunkt null mit sechs Millivolt pro Zentimeter gereizt wurde. Die Dauerbereiche sind rechts aufgeführt. Dargestellt ist hier eine Reizdauertuning-Kurve, die die Antworten als Spikes pro Reizwiederholung quantifiziert.

Wenn die chirurgische Technik und die Farbstoffinjektion beherrscht sind, können sie bei korrekter Durchführung innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, und die Ableitungen können zwei bis drei Stunden nach der Farbstoffinjektion begonnen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Gesundheit des Versuchstieres im Anschluss sorgfältig zu überwachen. Weitere Methoden wie die Zweiphotonen-Bildgebung können durchgeführt werden, um Aufzeichnungen von Neuronen in noch tiefer liegenden Hirnstrukturen zu erhalten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelzellantworten einer identifizierten Neuronenpopulation markiert und aufzeichnet.