Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen In vivo

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Einzelantworten in vivo einer identifizierten Population von Neuronen in einem nicht-genetischen Modellsystem aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kraniotomie durchgeführt wird, um die interessierende Gehirnregion freizulegen. Der zweite Schritt besteht darin, den Fluoreszenzfarbstoff mit Wolframdrähten in dem Bereich zu platzieren, in den die Zielneuronen projizieren.

Anschließend wird der Farbstoff retrograd transportiert, was zu einer selektiven Markierung der Projektionsneuronen führt. Der letzte Schritt besteht darin, vom markierten Axon des einzelnen Projektionsneurons aufzunehmen. Letztendlich werden extrazelluläre Einzelaufzeichnungen verwendet, um zu zeigen, wie zentrale sensorische Neuronen in einem intakten Schaltkreis auf die sensorische Stimulation in evo reagieren.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie Neuroschaltkreise Unterschiede im Timing von synaptischen Eingaben im Bereich von weniger als einer Millisekunde erkennen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden ist die Möglichkeit, einzelne Neuronen oder sogar Axone und nicht genetisch zugängliche Systeme ins Visier zu nehmen. Wöchentlich verwenden elektrische Fische elektrische Signale für die Kommunikation und Navigation.

Sie unterscheiden Signale von verschiedenen Fischen anhand von Unterschieden von weniger als einer Millisekunde im Timing synaptischer Eingaben. Wir haben gefragt, wie die vermuteten Zeitkomparator-Neuronen in ihrem elektrosensorischen Schaltkreis in der Lage sind, solch kleine Zeitunterschiede zu erkennen. Diese Technik kann aber auch auf andere Systeme wie visuelle und auditive Sinnesbahnen angewendet werden.

Es ist besonders schwierig, aus diesen Zellen zu flüssigen, da das umgebende Gewebe und die präsynaptischen Enden den größten Teil des Zellbauchs bedecken. Intrazelluläre Farbstoffinjektion während einer Ganzzellaufzeichnung. In vitro markiert eine einzelne Zelle, um gezielte Ableitungen von diesem Axon zu steuern. In ähnlicher Weise bietet der retrograde Transport nach extrazellulärer Farbstoffinjektion ein Mittel zur selektiven Markierung der Projektionsneuronen in oberflächlichen Hirnregionen.

Dies kann verwendet werden, um eine visuelle Anleitung für In-vivo-Einzelaufnahmen zu bieten. Um die D-codierte Nadel vorzubereiten, wird zunächst ein Wolframdraht mit einem Durchmesser von 160 Mikrometern elektrolytisch auf den endgültigen Nadelspitzendurchmesser von fünf bis 50 Mikrometern geschärft. In der Nacht vor dem Experiment kodieren Sie dann die Nadelspitze mit einer zwei Millimolaren Lösung von 10.000 Molekulargewicht Dextran-konjugiertem Alexa-Bodenfarbstoff, um eine Vollnarkose einzuleiten.

Setzen Sie den Fisch in Aquarienwasser mit MS 2 22 Lösung bei 300 Milligramm pro Liter, immobilisieren Sie den Fisch und bringen Sie ihn elektrisch zum Schweigen, indem Sie 100 Mikroliter Schlegel zu drei Milligramm pro Milliliter in die Rückenmuskulatur des Körpers injizieren. Füllen Sie als Nächstes die Aufnahmekammer mit Aquarienwasser und legen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten auf die Plattform in der Mitte der Kammer. Geben Sie dann die belüftete MS 2 22-Lösung mit 100 Milligramm pro Liter in ein bis zwei Millilitern pro Minute ab, indem Sie eine Pipettenspitze in den Mund einführen.

Anschließend den Fisch mit festen Stäben und Wachs auf beiden Seiten des Körpers stabilisieren. Überwachen Sie den Gesundheitszustand der Fische, indem Sie den kontinuierlichen Blutfluss in den Augengefäßen und eine normale Körperfarbe überprüfen. Drehen Sie dann die Plattform entlang der vertikalen Achse.

Stellen Sie ein Ende der Plattform so ein, dass eine Seite der Rückenfläche des Fischkopfes über dem Wasser freiliegt, während der Rest des Fischkörpers unter Wasser bleibt. Legen Sie ein kleines Stück Kim-Tuch auf einen nicht untergetauchten Teil der Haut, um ein Austrocknen zu verhindern. Tragen Sie bei diesem Verfahren 0,4 % Lidocain mit einem Wattestäbchen auf die freiliegende Oberfläche des Kopfes auf.

Schneiden Sie dann mit einer Skalpellklinge ein rechteckiges Stück Hautgewebe von etwa drei Millimetern mal fünf Millimetern für einen 6,2 Zentimeter großen Fisch ab. Der seitliche Rand des Rechtecks sollte mit der Mitte des Auges ausgerichtet sein. Der vordere Rand des Rechtecks sollte genau hinter dem Auge liegen, und der mediale Rand des Rechtecks sollte genau lateral zur Mittellinie sein.

Entfernen Sie anschließend das Rechteck mit einer Pinzette. Schneiden Sie zusätzlich 2,5 Millimeter quadratische Vorderseite ab, um den Schädel freizulegen. Reinigen Sie die freiliegende Oberfläche des Schädels vollständig, indem Sie überschüssiges Gewebe mit der Skalpellklinge abkratzen.

Trocknen Sie dann die Oberfläche mit einem Kim-Tuch und Zwangsluft vollständig ab. Kleben Sie als Nächstes einen Metallpfosten mit Sekundenkleber auf die vordere mediale freiliegende Schädelregion. Warten Sie, bis der Kleber vollständig getrocknet ist.

Zeichnen Sie mit einem Zahnbohrer mit einer Kugelfräser-Hartmetallspitze mit einem Durchmesser von 0,5 Millimetern ein Rechteck von etwa zwei mal vier Millimetern auf den Schädel für einen 6,2 Zentimeter großen Fisch. Schneiden Sie danach den Umfang des Rechtecks mit dem Skalpell und der Pinzette ab. Dann schäle den Schädel ab.

Um das Gehirn freizulegen, schneiden Sie sowohl die pigmentierte Dura mater als auch die klare Pia mater mit einer Federschere oder einer Nadel ab. Entfernen Sie dann die abgeschnittenen Teile mit einer Pinzette, um den vorderen extra lateralen Kern und den hinteren extra lateralen Kern freizulegen. Positionieren Sie nun einen Manipulator mit einer zuvor präparierten D-beschichteten Nadel über der Zielregion, die die interessierenden Axone enthält.

Der hintere extra laterale Kern führt in unserem Fall die Nadel schnell etwa 25 Mikrometer in das Gewebe ein. Nachdem der Farbstoff 15 bis 30 Sekunden lang diffundiert ist, ziehen Sie die Nadel zurück. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf mit zusätzlichen frischen Nadeln.

Platzieren Sie jede an einer anderen Stelle, so dass der Farbstoff in der Zielregion verteilt ist. Spülen Sie dann den überschüssigen Farbstoff mit Hickman-Ringerlösung aus dem Hohlraum und warten Sie mindestens zwei Stunden auf die Farbstoffaufnahme und den Transport. Um die interessierenden Axone sichtbar zu machen, platzieren Sie die Aufnahmekammer mit dem Fisch unter dem Objektiv eines aufrechten Epi-Fluoreszenzmikroskops mit festem Tisch.

Schalten Sie die Beatmungslösung auf frisches Aquarienwasser um und halten Sie die gleiche Durchflussmenge aufrecht. Platzieren Sie dann ein Ende des Erdungskabels in der freiliegenden Hirnhöhle und verbinden Sie das andere Ende mit der Masse des Aufnahmekopftisches. Platzieren Sie als Nächstes ein Paar Aufzeichnungselektroden neben der Basis des Schwanzes.

Schließen Sie dann die Elektroden an einen Differenzverstärker und ein Aufnahmegerät an. Um den elektrischen Organentladungsbefehl (EODC) zu überwachen, erstellen Sie eine maßstabsgetreue Skizze der Gehirnregion, die bei geringer Vergrößerung betrachtet wird, einschließlich der wichtigsten Blutgefäße als Orientierungspunkte, um die genaue Position der markierten Axone zu identifizieren. Um die D-Platzierung zu bestätigen, betrachten Sie zuerst das gesamte Gewebe mit Hellfeldbeleuchtung zur Orientierung.

Betrachten Sie es dann mit fluoreszierender Beleuchtung. Der hintere extra laterale Kern sollte eine diffuse Markierung aufweisen. Lokalisieren Sie danach unter starker Vergrößerung den vorderen extralateralen Kern mit den Gefäßen als Orientierungspunkten.

Beleuchten Sie es mit Fluoreszenzlicht, während Sie in der Nähe der Oberfläche nach einem markierten Axon suchen, wobei Sie einen Außendurchmesser von einem Millimeter und einem Innendurchmesser von 0,58 Millimetern verwenden. Bo Silikat-Kapillarglas mit Filament. Ziehen Sie an einer Aufzeichnungselektrode mit einem fünf Millimeter langen, schmalen Schaft und einem Spitzendurchmesser von etwa einem bis 2,4 Mikrometern.

Füllen Sie die Elektrode mit gefilterter Hickman-Ringer-Lösung. Der Endwiderstand der Spitze sollte im Bereich von 16 bis 155 Megaohm liegen. Platzieren Sie die Elektrode in einem Elektrodenhalter mit einem Druckanschluss.

Verbinden Sie es mit dem Kopftisch, der an einem Manipulator montiert ist. Schließen Sie dann die Kopfstufe an einen Verstärker an. Ein nicht abgebildetes Analog-Digital-Erfassungsgerät verbindet den Verstärker mit dem Computer.

Üben Sie danach einen Überdruck von 30 Millibar auf die Elektrodenleitung aus. Schieben Sie die Elektrode langsam von der Gewebeoberfläche in Richtung Axon. Da sich die Elektrode in der Nähe des Axons befindet, sollte der Überdruck eine leichte, aber spürbare Bewegung des Axons verursachen, während sich die Elektrode neben dem Axon befindet.

Zeichnen Sie die Aktivität während der Präsentation der Teststimuli auf. Obwohl ein elektrisches Artefakt die korrekte Aufzeichnung und Stimulation bestätigt, sollte es keine Aktionspotentiale geben. Lassen Sie den nach außen gerichteten Druck in der Elektrode los und wiederholen Sie die Stimulation und Aufnahme.

Üben Sie dann einen leichten Sog aus, wodurch sich das Axon in die Elektrode bewegt. Wiederholen Sie die Stimulation und Aufnahme erneut. Nun sollten Sie einige Aktionspotentiale als Reaktion auf die Stimulationen sehen.

Sobald Aktionspotentiale sichtbar sind, schließen Sie die Druckleitung. Wenn alle gewünschten Aufzeichnungen abgeschlossen sind, schalten Sie das Aquarienwasser wieder auf die Beatmungslösung mit MS 2 22 bei hundert Milligramm pro Liter um, um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig betäubt ist. Mindestens 10 Minuten lang sollte kein EODC nachgewiesen werden, bevor der Fisch eingeschläfert wird.

Hier sind fünf Beispielspuren, die die Aktionspotentiale zeigen, die durch einen monophasischen kontralateralen positiven transversalen Rechteckimpuls-Stimulus von 0,1 Millisekunden und sechs Millivolt pro Zentimeter hervorgerufen werden, und hier ist ein Rasterdiagramm, das die Spike-Zeiten während 20 Wiederholungen eines 75-Millisekunden-Aufnahmefensters für dieselbe Einheit zeigt, die zu Zeiten Null mit sechs Millivolt pro Zentimeter-Stimuli stimuliert wurde. Der Bereich der Dauer ist auf der rechten Seite aufgeführt. Hier ist eine Abstimmungskurve für die Stimulusdauer dargestellt, die die Reaktionen als Spitzen pro Stimuluswiederholung quantifiziert.

Einmal gemeistert, können die Operation und die Farbstoffinjektion, die bei dieser Technik gezeigt werden, in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird, und die Aufzeichnungen können zwei bis drei Stunden nach der Farbinjektion begonnen werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Gesundheit des Versuchstieres nach diesem Verfahren sorgfältig zu überwachen. Andere Methoden wie die Zwei-Photonen-Bildgebung können durchgeführt werden, um von Neuronen in noch tieferen Gehirnstrukturen aufzuzeichnen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Antworten einer einzelnen Einheit von einer identifizierten Population von Neuronen beschriften und aufzeichnen können.