Name: Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen In vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Lernen Sie die retrograde Fluoreszenzmarkierung zur gezielten extrazellulären Einzel-Einheit-Aufnahme identifizierter Neuronen in vivo. Diese Methode ermöglicht präzise Ableitungen in nicht-genetischen Modellsystemen.

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Finanzierung bereitgestellt von der National Science Foundation (IOS-1050701 an BAC), die National Institutes of Health (NS54174 auf SM und F30DC0111907 zu AML-W.), Der Uehara Memorial Foundation und dem Japan-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften (G2205 zu TK ). Wir danken Julian Meeks für seine Unterstützung und Beratung zum Thema extrazellulären axonal Aufnahmen. Wir danken Carl Hopkins zur Bereitstellung eines Prototypen Aufnahme Kammer.

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Sobald beherrschen, wird diese Technik erlauben es, identifizierten Neuronen, einschließlich einzelner Axone, für die in vivo-Aufnahmen in vielen Modell Zielsysteme. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik eine zuverlässig aufzeichnen Spike Ausgabe von Neuronen mit einzigartigen anatomischen Merkmale, die traditionell in vivo Aufnahme Methoden schwierig zu machen. Wir haben diese Technik genutzt werden, um aus ELa &quot;kleinen Zellen&quot; in mormyrid schwach elektrischen Fischen aufzunehmen. Frühere Versuche, die Stimmung Eigenschaften der &quot;kleinen Zellen&quot; zu studieren, waren erfolglos durch anspruchsvolle Aufnahmebedingungen 11, 14. Ähnliche anatomische Merkmale schaffen Hindernisse für den Erhalt von Single-Unit-Aufnahmen aus vielen verschiedenen Wirbeltieren auditorischen Neuronen und elektrosensorischen 8-10. Um diese Herausforderungen in unserem System zu überwinden, nutzten wir die Tatsache, dass &quot;kleine Zellen&quot; sind die einzigen Zellen in ELa dass Projekt ELP. Somit begrenzt retrograden Transport des Farbstoffes in ELP platziert Kennzeichnung in ELa zu &quot;kleinencell &quot;somas und Axonen. Fluoreszenzmarkierung der Axone erlaubt präzise Platzierung der Elektroden neben markierten Axone, so dass Single-Unit-Aufnahmen von identifizierten Zellen möglich trotz unzugänglich somas. Wir versuchten somatischen Aufnahmen, waren aber erfolglos, wahrscheinlich aufgrund der umliegenden verschlingenden Synapsen 11 , 17. war jedoch somatische Kennzeichnung deutlich sichtbar darauf hindeutet, dass diese Technik verwendet werden, um somatische Aufnahmen in anderen Zelltypen und andere Schaltungen abzuzielen. Fluoreszenzmarkierung von Neuronen durch retrograden Transport in vivo zur Führung gezielte Aufnahmen in vitro 19-21 verwendet wurde, . Eine ähnliche Technik wurde für die gezielte in vivo Aufnahmen von Motoneuronen im Rückenmark Zebrafisch 22 verwendet. Unsere Arbeit stellt eine neuartige Erweiterung dieses Ansatzes, in dem sowohl die Kennzeichnung und die Aufnahme in vivo im Gehirn sind fertig. Unsere Methode zeigt, dass in vivo Kennzeichnung von CNS Bereiche mit einer retrograden tRennfahrer können auf das Studium der anderen intakten Kreise mit ähnlich selektive Projektion Neuronen erweitert werden. Zum Beispiel in Säugetier-auditiven Verarbeitung dient der Colliculus inferior (IC) als wichtiger Weitergabezentrum für Eingänge von mehreren rhombencephalic Strukturen 23. Dye Injektion in den IC würde selektive Markierung der Zellen Vorsprung von jeder dieser Kerne. Der Colliculus superior (SC) bietet eine ähnliche Funktion für Vision 24. Rückenmark Zubereitungen eignen sich besonders gut für diese Technik geeignet, da das Rückenmark leicht zugänglich ist, Farbstoff-Injektion vom Aufnahmeort auftreten, und es kann mit intrazellulären Aufnahme und Füllen von ausgewählten Neuronen zu erwerben genauere anatomische Information 25 kombiniert werden. Schließlich ist Trakt-Tracing eine gut etablierte Technik in der zentralen Nervensystems verwendet werden, um komplexe Schaltung 26 zugeordnet. Unsere Methode kann genutzt werden, um funktionelle Informationen zu diesen Studien hinzufügen, wie hat w getan worden seinit Kalzium-sensitive Indikatoren in cat Sehrinde 27. Die Operation, die gut etabliert ist, zuverlässig und regelmäßig für Blinde in vivo Aufnahmen 16 verwendet wird, muss mit minimalen Blutungen und keine Schäden an der Oberfläche des Gehirns, das Tier und das Gewebe zu überleben erlauben abgeschlossen sein. Mit etwas Übung kann die Chirurgie und Farbauftrag in 30-45 Minuten abgeschlossen sein. Wir haben erfolgreich &quot;kleine Zelle&quot; Axone in 67% der Präparate bezeichnet. Die meisten Präparate haben nur 1 oder 2 sichtbar markierte Axone, aber einige haben so viele wie 8. Von den 119 markierten Einheiten versuchten, erhielten wir Single-Unit-Aufnahmen aus 26 Einheiten über 12 Zubereitungen (Tabelle 2) verteilt. So wurden die Daten von 41% der Präparate mit markierten Axone für eine Erfolgsquote von 28% erhoben. Der kritische Aspekt Farbauftrag wird die Kennzeichnung der Tiefe. Shallow Einsetzen der Wolframdraht in der Farbstoff gewaschen aw führenay. Wenn jedoch die Penetration zu tief, wird markiert Axone nicht sichtbar für das Targeting. Ferner muss eine mechanische Schädigung der Zelle für den Farbstoff ausreichend bis 25, 28 gemacht werden auftreten. Allerdings wird zu viel Schaden töten die Zellen. Wir haben versucht, die Markierung mit anderen Farbstoffen und andere Methoden (Tabelle 2), einschließlich anterograden Kennzeichnung durch Farbstoff Injektion in ELA mit Aufnahme von markierten Axone in ELP (Tabelle 3) gepaart. Wir vermuten, dass anterograden Kennzeichnung nicht erfolgreich war, weil Kennzeichnung wurde, um Zellen mit somatischen Schaden begrenzt, so dass sie nicht mehr reagiert. Zusätzlich kann präsynaptischen Terminals gestört worden. Dagegen minimiert retrograde Markierung beide dieser Probleme. Die Menge und Lage der Farbauftrag kann gemäß der speziellen Schaltung untersucht modifiziert werden. Maximal Kennzeichnung erfolgt mit dem größten Farbstoffkonzentration, die wir durch die Verwendung beschichteter Wolframdrähte. Allerdings, zur Beschriftung von Axonen mit deep Projektionen kann Farbstoff kommen aus einer Wolfram-Nadel, wie es fortgeschritten ist. In diesen Fällen würde Einspritzung besser geeignet. Dye Aufnahme und der Transport sind schnell, mit markierten Axone in unserer Vorbereitung sichtbar bereits 2 Stunden nach der Injektion und zusätzliche markierte Axone erscheinen so spät zu 6 Stunden nach der Injektion. Somit kann die Kennzeichnung und die Aufnahme an einem einzigen Tag durchgeführt werden, die Beseitigung technischer Schwierigkeiten mit dem Überleben Chirurgie. Die Zeitnahme erfolgt für jede Anwendung in Abhängigkeit vom Abstand zur Farbstofftransport erforderlich variieren. Ein weiterer kritischer Aspekt ist die Platzierung der Elektroden. Es ist wichtig, um das Gewebe in der Nähe der Stelle des markierten Axon verhindern das Verstopfen der Spitze ein. Bei dichtem Gewebe wie in ELa minimiert ein langer, dünner Schaft auf der Aufzeichnungselektrode über Bewegung des umgebenden Gewebes. Wenn eine erfolgreiche Aufnahme nicht beim ersten Versuch wiederholen mit frischen Elektroden erreicht, bis eine Aufnahme erhalten oder die tissUE bis zu dem Punkt, an dem das Axon nicht mehr sichtbar beeinträchtigt. Es ist jedoch auch wichtig, schnell die Elektrode neben dem Axon, die Menge des fluoreszierenden Belichtung, die Phototoxizität verursachen können, zu minimieren und Bleichen können physiologische Eigenschaften der Zelle 29-31 beeinflussen. Sobald ein Segment Axon erfolgreich in die Aufnahme-Elektrode abgesaugt, kann Aufnahmen für mehrere Stunden erhalten werden. Wenn Einheiten konsequent in weniger als 1 Stunde verloren gegangen sind, erwägen, kleinere Elektrode Tipps, um das Axon Herausrutschen zu verhindern. Auf der anderen Seite kann ein zu kleiner Spitze in Verstopfung, niedrigen Signal-zu-Rausch-, oder Schäden an der Axon führen. Ein stetiger Rückgang der Spitze Amplitude und der &quot;Rückkehr&quot; einer Einheit mit zusätzlicher Ansaug ist ein Indiz dafür, dass die Spitze zu groß ist. Zu viel Saug kann zu irreparablen Schäden an der Axon. Eine Lösung ist, ein kleines Leck in der Luftleitung ermöglicht so der Druck langsam auf Null zurück. Schnell Ausgleich the Druck wird in einem Übergangszustand relativ-außen &quot;Push&quot;, die das Axon zu vertreiben führen kann. Obwohl diese Technik, ein großer Vorteil für den Erhalt gezielte Aufnahmen von Projektion Neuronen identifiziert, wird es nicht zur Unterscheidung Interneuronen nützlich, als Farbstoff würde von allen Zelltypen an der Injektionsstelle entnommen werden. Theoretisch kann die Verwendung von mehreren Fluorophoren mit getrennten Injektionsstellen ermöglichen diese Verfahren erweitert werden. Zum Beispiel könnte Vergleich einzelner-versus Doppel-Markierung verwendet, um interneurons von Projektionsneurone nach Dual-Injektionen an zwei Punkten in der Schaltung 32 zu unterscheiden. Ebenso können retrograde Tracer mit anderen fortschrittlichen bildgebenden Verfahren, wie z. B. Zwei-Photonen-Imaging, wie kürzlich in Zebrafinken Hohe Vocal Center (HVC) 32 getan kombiniert werden. Außerdem sind die Aufnahme Regionen jenen nahe der Oberfläche begrenzt, wenn mit Epifluoreszenz Mikroskope, wie wir nur konnten 1 &amp; lösenmu; m Strukturen innerhalb der ersten 30 um von Gewebe. Jedoch könnte diese Tiefe durch die Verwendung von anderen Mikroskopieverfahren wie Zweiphotonenmikroskopie 33 oder Ziel-gekoppelten planaren Beleuchtung Mikroskopie 34 verlängert werden. Insgesamt stellt diese Technik einen wichtigen Fortschritt bei der Untersuchung der neuronalen Schaltkreise in vivo, da sie verwendet werden, um von einzelnen Neuronen in vielen verschiedenen Schaltungen in einer Vielzahl von Modellsystemen aufnehmen - auch diejenigen, die schwer zugänglich sind.

<table><tbody><tr><td>Tricainmethansulfonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>Gallamintrijodid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8134</td><td>Flaxedil</td></tr><tr><td>Lidocainhydrochlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hickman&amp;rsquo;s Ringer-Lösung</td><td>NA</td><td>NA</td><td>NaCl (6,48 g/l), KCl (0,15 g/l), CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O (0,29 g/l), MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,12 g/l), NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0,084 g/l), NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,06 g/l)</td></tr><tr><td>Peristaltikpumpe</td><td>Gilson oder Rainin</td><td>Minipulse 3 Modell 312; RP-1</td><td>10,0 &amp;plusmn; 1,0 U/min; alternativ eine gravimetrisch betriebene Leitung mit Durchflussmessgerät</td></tr><tr><td>Präparationsmikroskop</td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Superkleber</td><td>Super Glue Corporation</td><td>SGH2</td><td>2-g-Röhrchen</td></tr><tr><td>Omni-Bohrer 35</td><td>World Precision Instruments</td><td>503-598</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kugelbohrer aus Hartmetall #1/4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860</td><td>0,19 DIA (Bohrerdurchmesser = 0,48 mm)</td></tr><tr><td>Kältekauter-Set</td><td>World Precision Instruments</td><td>500391</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Manueller Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dextran-konjugiertes Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>D-22912</td><td>2-mM-Konzentration; 10.000 MW. Die Wahl der Farbstoffwellenlänge sollte auf die Filtereinstellungen des Mikroskops abgestimmt sein</td></tr><tr><td>Epifluoreszenzmikroskop</td><td>Nikon</td><td>E600 FN</td><td>Ein Fernfokus-Zubehör ist hilfreich für eine feine Fokussierung; TRITC-Filter oder geeigneter Filter, um Fokusebenen für verschiedene Farbstoffwellenlängen anzupassen</td></tr><tr><td>Niedrigvergrößerungs-Objektiv</td><td>Nikon</td><td>93182</td><td>CFI Plan Achromat Serie, 4X N.A. 0,1, Arbeitsabstand 30 mm</td></tr><tr><td>Hochvergrößerungs-Objektiv</td><td>Nikon</td><td>93148</td><td>CFI Fluor Serie, 40X WI N.A. 0,8, Arbeitsabstand 2,0 mm</td></tr><tr><td>Weißlichtquelle</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Modell 190</td><td>Glasfaser-Beleuchtungsgerät</td></tr><tr><td>Fluoreszenzlichtquelle</td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120Q</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera für schwaches Licht</td><td>Photometrics</td><td>CoolSnap ES</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digitalmanometer</td><td>Omega Engineering</td><td>HHP-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Motorisierter Mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kopfverstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Verstärker</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Isolierter Impulsstimulator</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Flaming/Brown-Mikropipettenzieher</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Programmeinstellungen für unsere Anwendung: Heizung: Ramp + 1, Zug: &amp;rsquo;0&amp;rsquo;, Geschwindigkeit: 60, Zeit: 90; Box-Filament</td></tr><tr><td>Pipettenglas</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Borosilikat-Kapillarglas mit Filament (1 mm Außendurchmesser, 0,58 mm Innendurchmesser)</td></tr></tbody></table>

retrograde fluoreszenzmarkierung ermöglicht gezielte extracellular einzel-einheit aufnahme von identifizierten neuronen<em&gt; in vivo</em

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Single-Unit-Antworten von einem identifizierten Population von Neuronen aufzuzeichnen. In vivo elektrophysiologischen Ableitungen von einzelnen Neuronen sind entscheidend für das Verständnis, wie neuronale Schaltkreise unter natürlichen Bedingungen funktionieren. Traditionell sind diese Aufnahmen durchgeführt &quot;blind&quot;, dh die Identität des aufgenommenen Zelle am Anfang der Aufzeichnung bekannt. Cellular Identität kann nachträglich über intrazelluläre 1, 2 oder juxtacellular loose-Patch 3 Iontophorese des Farbstoffs bestimmt werden, aber diese Aufnahmen können nicht auf bestimmte Neuronen in Regionen mit funktionell heterogenen Zelltypen gezielt vorbehandelt werden. Fluoreszierende Proteine ​​können in einer Zelltyp-spezifischen Weise ermöglicht visuell geführten einzelligen Elektrophysiologie 4-6 ausgedrückt. Es gibt jedoch viele Modellsysteme für die diese genetischen Werkzeuge sind nicht verfügbar. Auch in genetisch zugänglich Modellsysteme, die gewünschte PROmoter unbekannt sein oder genetisch homogenen Neuronen haben unterschiedliche Muster Projektion. In ähnlicher Weise wurden virale Vektoren verwendet, um bestimmte Untergruppen von Projektionsneurone 7 bezeichnen, aber die Verwendung dieses Verfahrens ist durch die Toxizität und das Fehlen von trans-synaptischen Spezifität begrenzt. So werden zusätzliche Techniken, die spezifische Pre-Visualisierung bieten, um von einzelnen Neuronen identifiziert in vivo Aufnahme benötigt. Pre-Visualisierung der Zielneuron ist besonders für anspruchsvolle Aufnahmebedingungen für die klassischen Single-Cell-Aufnahmen sind oft prohibitiv schwierig 8-11. Die neue Technik in dieser Veröffentlichung beschrieben wird, verwendet retrograden Transport von einem fluoreszierenden Farbstoff aufgetragen wurde, mit Wolframnadeln schnell und selektive Markierung eine bestimmte Untergruppe von Zellen in einer bestimmten Region des Gehirns auf ihrer einzigartigen axonalen Prognosen, wodurch ein visueller Hinweis gezielt elektrophysiologischen erhalten von identifizierten Neuronen in einer intakten Schaltkreis withina Wirbeltiere CNS. Der bedeutendste neue Entwicklung unserer Methode ist die Verwendung von Fluoreszenz-Markierung auf bestimmte Zelltypen nicht genetisch zugänglich Modell Zielsystem. Schwach elektrische Fische sind ein hervorragendes Modellsystem für die Untersuchung neuronaler Schaltkreise in wach, sich verhaltenden Tier 12. Wir nutzten diese Technik, um sensorische Verarbeitung von &quot;kleinen Zellen&quot; in der vorderen exterolateral Kern (ELA) von schwach-elektrischen Fischen mormyrid studieren. &quot;Kleine Zellen&quot; sind die Hypothese zu Zeit Komparator Neuronen wichtig zum Erfassen submillisekundenschnelle Unterschiede in den Ankunftszeiten der präsynaptischen Spikes 13 sein. Allerdings haben anatomischen Merkmalen wie dichten Myelin Verschlingen Synapsen und kleine Zellkörper es extrem schwierig, aus diesen Zellen mit Hilfe von herkömmlichen Verfahren 11, 14 aufzunehmen. Hier zeigen wir, dass unser neues Verfahren selektiv markiert diese Zellen in 28% der Vorbereitungen, so dass für eine zuverlässige, robuste und Aufnahmen characterisierung der Antworten auf elektrosensorischen Stimulation.

Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet werden<em&gt; In vivo</em&gt; Und ermöglicht die Aufnahme von extrazellulären identifiziert Axone. Diese Technik ermöglicht die Aufnahme, wenn Neuronen kann nicht durch genetische Manipulation bezeichnet werden oder sind schwer zu isolieren mit &quot;blind&quot;<em&gt; In vivo</em&gt; Ansätze.

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist die Aufzeichnung von Single-Unit-Antworten einer identifizierten Neuronenpopulation. In-vivo-elektrophysiologische Aufzeichnungen von ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Aktivität einzelner Neuronen in vivo von einer identifizierten neuronalen Population in einem nicht-genetischen Modellsystem aufzuzeichnen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Kraniotomie durchgeführt wird, um die gewünschte Hirnregion freizulegen. Im zweiten Schritt werden Wolframdrähte verwendet, um den fluoreszierenden Farbstoff in dem Areal abzugeben, in das die Zielneurone projizieren.Danach wird der Farbstoff retrograd transportiert, was zu einer selektiven Markierung der Projektionsneurone führt. Der letzte Schritt besteht darin, aus dem markierten Axon des einzelnen Projektionsneurons aufzuzeichnen. Letztendlich kommen Einzelzell-Außenelektrodenableitungen zum Einsatz, um zu zeigen, wie zentrale sensorische Neurone in einer intakten Verschaltung auf sensorische Reize in vivo reagieren.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen dazu beantworten, wie neuronale Schaltkreise Unterschiede in der zeitlichen Abfolge synaptischer Eingänge im Submillisekundenbereich wahrnehmen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt in der Möglichkeit, gezielt einzelne Neuronen oder sogar Axone sowie nicht-genetisch zugängliche Systeme anzusteuern. Wöchentliche elektrische Fische verwenden elektrische Signale zur Kommunikation und Navigation.Sie unterscheiden Signale verschiedener Fische anhand von Unterschieden im Bereich von Submillisekunden in der zeitlichen Abfolge synaptischer Eingänge. Wir untersuchten, wie die vermuteten Zeitvergleichsneuronen in ihrer elektrischen Sinnesbahn derart kleine Zeitunterschiede detektieren können. Diese Technik kann jedoch auch auf andere Systeme wie visuelle und auditorische Sinnesbahnen angewendet werden.Es ist besonders schwierig, Flüssigkeit aus diesen Zellen zu entnehmen, aufgrund der geringen Größe, der dichten Umhüllung im umgebenden Gewebe und der präsynaptischen Endigungen, die den größten Teil des Zellleibes bedecken. Die intrazelluläre Farbstoffinjektion während einer Ganzzellableitung markiert in vitro eine einzelne Zelle, um gezielte Ableitungen von diesem Axon zu leiten. Ebenso ermöglicht der retrograde Transport nach extrazellulärer Farbstoffinjektion eine selektive Markierung der Projektionsneurone in oberflächlichen Hirnregionen.Dies kann zur visuellen Unterstützung bei in vivo-Einzel-Einheits-Ableitungen verwendet werden. Um die D-kodierte Nadel vorzubereiten, elektrolytisch zunächst einen Wolframdraht mit einem Durchmesser von 160 Mikrometern auf einen endgültigen Nadelspitzen-Durchmesser von fünf bis 50 Mikrometern spitzen. Anschließend die Nadelspitze am Abend vor dem Experiment mit einer zwei Millimolar-Lösung eines 10.000 Molekulargewicht aufweisenden Dextran-Alexa-Floor-Farbstoffs markieren, um eine Vollnarkose auszulösen.Stellen Sie den Fisch in Beckenwasser mit MS 222-Lösung bei 300 Milligramm pro Liter, um den Fisch zu immobilisieren und elektrisch zu stillen, indem Sie 100 Mikroliter Flail bei drei Milligramm pro Milliliter in die dorsale Körpermuskulatur injizieren. Füllen Sie als Nächstes die Ableitungskammer mit Beckenwasser und legen Sie den Fisch mit der Bauchseite nach unten auf die Plattform in der Mitte der Kammer. Leiten Sie dann die belüftete MS 222-Lösung bei 100 Milligramm pro Liter mit einer Geschwindigkeit von ein bis zwei Milliliter pro Minute zu, indem Sie eine Pipettenspitze in den Mund einführen.Anschließend stabilisieren Sie den Fisch mit festen Stäben und Wachs auf beiden Seiten des Körpers. Überwachen Sie den Gesundheitszustand des Fisches, indem Sie den kontinuierlichen Blutfluss in den Augengefäßen und eine normale Körperfarbe überprüfen. Drehen Sie dann die Plattform entlang der vertikalen Achse.Stellen Sie ein Ende der Plattform so ein, dass eine Seite der dorsalen Fläche des Fischkopfes über der Wasseroberfläche liegt, während der Rest des Fischkörpers unter Wasser bleibt. Legen Sie ein kleines Stück Kim-Tuch auf jeden nicht untergetauchten Hautbereich, um Austrocknung zu verhindern. Tragen Sie in diesem Verfahren 0,4 % Lidocain auf die freiliegende Kopffläche mit einem Wattestäbchen auf.Verwenden Sie dann eine Skalpellklinge, um ein rechteckiges Stück Hautgewebe von etwa drei Millimetern mal fünf Millimetern für einen 6,2 cm langen Fisch zu schneiden. Die seitliche Kante des Rechtecks sollte mit der Mitte des Auges übereinstimmen. Die vordere Kante des Rechtecks sollte unmittelbar hinter dem Auge liegen, und die mediale Kante des Rechtecks sollte unmittelbar seitlich zur Mittellinie liegen.Entfernen Sie anschließend das Rechteck mit einer Pinzette. Schneiden Sie zusätzlich ein 2,5 Millimeter großes Quadrat anterior mely zu, um den Schädel freizulegen. Entfernen Sie durch Abschaben jegliches überschüssige Gewebe mit der Skalpellklinge, um die freigelegte Schädelfläche vollständig zu reinigen.Trocknen Sie die Oberfläche anschließend vollständig mit einem Kim-Tuch und Druckluft. Kleben Sie danach einen Metallpfosten mit Sekundenkleber auf den vorderen medialen, freiliegenden Schädelpart. Warten Sie, bis der Kleber vollständig getrocknet ist.Verwenden Sie einen Zahnarztbohrer mit einer Kugelbohrer-Karbidspitze mit 0,5 Millimeter Durchmesser, um ein Rechteck von etwa zwei Millimetern mal vier Millimetern auf dem Schädel eines 6,2 Zentimeter langen Fisches aufzuzeichnen. Danach schneiden Sie den Umfang des Rechtecks mit dem Skalpell und der Pinzette aus. Anschließend wird der Schädel abgezogen.Um das Gehirn freizulegen, schneiden Sie sowohl das pigmentierte Dura mater als auch das klare Pia mater mit einer Feder-Schere oder einer Nadel durch. Entfernen Sie anschließend die durchtrennten Anteile mit einer Pinzette, um den anterior extra lateralen Kern und den posterior extra lateralen Kern freizulegen. Positionieren Sie nun einen Manipulator mit einer zuvor präparierten D-beschichteten Nadel über dem Zielbereich, der die interessierenden Axone enthält.Der hintere extra laterale Kern wird in unserem Fall schnell von der Nadel um etwa 25 Mikrometer in das Gewebe eingedrungen. Nachdem sich der Farbstoff 15 bis 30 Sekunden lang ausgebreitet hat, ziehen Sie die Nadel zurück. Wiederholen Sie den Vorgang bei Bedarf mit zusätzlichen frischen Nadeln.Platzieren Sie jeden an einer unterschiedlichen Stelle, sodass sich der Farbstoff im Zielbereich verteilt. Anschließend spülen Sie den überschüssigen Farbstoff mit Hickman-Ringer-Lösung aus der Kammer aus und warten mindestens zwei Stunden, um die Aufnahme und den Transport des Farbstoffs abzuwarten. Um die gewünschten Axone sichtbar zu machen, stellen Sie die Aufnahmekammer mit dem Fisch unter das Objektiv eines aufrechten, feststehenden Epi-Fluoreszenzmikroskops.Wechseln Sie die Atmungslösung zu frischem Beckenwasser und halten Sie die gleiche Flussrate aufrecht. Danach bringen Sie ein Ende des Erdungsdrahts in der freigelegten Gehirnhöhle an und verbinden das andere Ende mit der Masse der Aufzeichnungs-Headstage. Als Nächstes platzieren Sie ein Paar Ableitelektroden neben der Schwanzbasis.Verbinden Sie dann die Elektroden mit einem Differenzverstärker und einer Aufnahmeeinrichtung. Um den Befehl für die elektrische Organausschüttung (EODC) zu überwachen, erstellen Sie eine maßstabsgetreue Skizze des Gehirnareals, die bei geringer Vergrößerung betrachtet wird, und fügen Sie dabei wichtige Blutgefäße als Orientierungspunkte hinzu, um die genaue Lage der markierten Axone zu bestimmen. Um die Platzierung von D zunächst zu bestätigen, betrachten Sie das gesamte Gewebe mit Hellfeldbeleuchtung, um sich zu orientieren.Danach unter fluoreszierender Beleuchtung betrachten. Der hintere laterale Extra-Kern sollte eine diffuse Färbung aufweisen. Anschließend unter hoher Vergrößerung den vorderen lateralen Extra-Kern mit den Gefäßen als Orientierungspunkte lokalisieren.Beleuchten Sie es mit fluoreszierendem Licht, während Sie mit einer Kapillarglaskolbenwandstärke von einem Millimeter Außendurchmesser und 0,58 Millimeter Innendurchmesser aus Borosilikatglas mit Filament in der Nähe der Oberfläche nach einem markierten Axon suchen. Ziehen Sie eine Ableitelektrode mit einem fünf Millimeter langen schmalen Schaft und einem Elektrodenöffnungsdurchmesser von etwa ein bis 2,4 Mikrometer.Füllen Sie die Elektrode mit filtrierter Hickman-Ringer-Lösung. Der endgültige Elektrodenwiderstand sollte im Bereich von 16 bis 155 Megaohm liegen. Setzen Sie die Elektrode in einen Elektrodenhalter mit Druckanschluss.Verbinden Sie es mit der auf einem Manipulator montierten Kopfstufe. Anschließend verbinden Sie die Kopfstufe mit einem Verstärker. Eine analoge Digital-Aufnahmeeinheit, die nicht dargestellt ist, verbindet den Verstärker mit dem Computer.Anschließend 30 Millibar positiven Druck auf die Elektrodenleitung ausüben. Die Elektrode langsam von der Gewebeoberfläche aus in Richtung des Axons voranbewegen. Wenn die Elektrode sich nahe am Axon befindet, sollte der positive Druck eine geringe, aber wahrnehmbare Bewegung des Axons verursachen, während die Elektrode neben dem Axon liegt.Notieren Sie die Aktivität während der Präsentation der Testreize. Obwohl ein elektrisches Artefakt die korrekte Aufnahme und Stimulation bestätigt, sollten keine Aktionspotenziale auftreten. Lösen Sie den äußeren Druck in der Elektrode und wiederholen Sie die Stimulation und Aufnahme.Üben Sie dann leichtes Absaugen aus, wodurch das Axon in die Elektrode hineinbewegt wird. Wiederholen Sie die Stimulations- und Aufnahmeschritte erneut. Nun sollten Sie einige Aktionspotentiale als Reaktion auf die Stimuli sehen.Sobald Aktionspotentiale sichtbar sind, schließen Sie die Druckleitung. Wenn alle gewünschten Ableitungen abgeschlossen sind, wechseln Sie das Beckenwasser zurück zur Atemlösung mit MS 222 in einer Konzentration von hundert Milligramm pro Liter, um sicherzustellen, dass der Fisch vollständig anästhesiert ist. Es sollte mindestens 10 Minuten lang kein EODC nachweisbar sein, bevor der Fisch euthanasiert wird.Hier sind fünf Beispieltracings, die die Aktionspotentiale zeigen, die durch einen 0,1 Millisekunden langen, sechs Millivolt pro Zentimeter starken, monophasischen, kontralateral positiven transversalen Rechteckimpuls hervorgerufen wurden, sowie ein Rasterplot, der die Spiketimepunkte während von 20 Wiederholungen eines 75-Millisekunden-Aufnahmezeitfensters für dieselbe Einheit darstellt, die zum Zeitpunkt null mit sechs Millivolt pro Zentimeter gereizt wurde. Die Dauerstrecke ist rechts aufgeführt. Dargestellt ist hier eine Stimulusdauertuningkurve, die die Antworten als Spikes pro Stimuluswiederholung quantifiziert.Wenn die chirurgische Technik und die Farbstoffinjektion einmal beherrscht sind, können sie bei korrekter Durchführung innerhalb einer Stunde durchgeführt werden, und die Ableitungen können zwei bis drei Stunden nach der Farbstoffinjektion beginnen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die Gesundheit des Versuchstieres im Anschluss sorgfältig zu überwachen. Weitere Methoden wie die Zweiphotonen-Bildgebung können durchgeführt werden, um Aktivitäten von Neuronen in noch tiefer liegenden Hirnstrukturen aufzuzeichnen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Einzelzellantworten aus einer identifizierten neuronalen Zellpopulation markiert und aufzeichnet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen

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