Name: Die Verwendung Tiermodell für Sepsis zu neuartigen Therapien zu beurteilen Herbal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Erstellung eines Sepsis-Mausmodells mittels zäkaler Ligatur und Punktion zur Bewertung therapeutischer Kräuterextrakte. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung systemischer Entzündungsreaktionen und die Entwicklung neuartiger Behandlungsansätze.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health, National Institute of General Medical Science (R01GM063075) und das Nationale Zentrum für Komplementär-und Alternativmedizin (R01AT05076) unterstützt.

1. Gründung Tiermodell der Sepsis <ol><li> Mäuse sind mit Ketamin (75 mg / kg, intramuskulär, im) und Xylazin (10 mg / kg, im), und in Rückenlage. </li><li> Befestigen der Füße der Maus mit Band, um eine stabile Position zu sichern. </li><li> Reinigen Sie den Bauch mit 3 abwechselnd von Scrubs Betadin oder andere Haut Desinfektionsmittel und Alkohol. Dann, mit 15 mm Mittellinienschnitt bis zum Zökum aussetzen. </li><li> Ligieren des Blinddarms mit einem 4-0 Seidenfaden bei ca. 5,0 mm von der Blinddarm-Spitze, und dann Punktion der ligierten cecal Stumpf einmal mit einer 22-Gauge-Nadel zur Extrusion von Stuhl zu ermöglichen. </li><li> Der Blinddarm wird sofort wieder in seine normale Position intraabdominalen ersetzt. </li><li> Schließen Sie die Inzisionsstelle in zwei Schichten, indem Sie zuerst Schließen der Muskulatur des Bauches mit resorbierbaren Fäden und dann Schließen der Haut mit Wundklammern oder nicht resorbierbaren Fäden. </li><li> Resuscitate Maus mit 0,5 ml physiologischer Kochsalzlösung und eine einzelne tunsich von Imipenem (0,5 mg / Maus, subkutan) unmittelbar nach Beendigung des chirurgischen Eingriffs. </li><li> Kehren Sie die Maustaste wieder auf einem sauberen Käfig mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. </li><li> Zu verschiedenen Zeitpunkten nach der CLP wird pflanzliche Extrakt oder eine Komponente intraperitoneal verabreicht. </li><li> Das Überleben der Tiere wird für mehr als zwei Wochen überwacht. Sterbende Tiere ausstellen Schwierigkeiten zu stehen, agonale Atmung, schwere Muskelatrophie und unkontrollierte Blutungen sollten durch Überdosierung Kohlendioxidinhalation eingeschläfert werden. </li><li> Es ist wichtig zu beachten, dass zirkulierende Cytokin Ebenen sind in diesen Studien. Verschiedene Analgetika hat sich gezeigt, Zytokinfreisetzung und Aktivitäten beeinflussen, und deshalb wurden absichtlich in der postoperativen Betreuung vermieden werden. </li></ol> 2. Vorbereitung der Kräuter-Extrakt <ol><li> Auszug Kräuter in heißem Wasser (85 ° C) für 1-4 Std. (1 Std. für Blätter und Wurzeln für 4 Std.). </li><li> Zentrifugieren Sie die Wasser-soUnlöslich Fraktion (3300 g, 20 min, 4 ° C) zur Entfernung unlöslicher Teilchen. </li><li> Filtrat der Überstand Fraktion durch eine 0,2 um-Filter. </li><li> Die klare wasserlösliche Filtratfraktion wird dann fraktioniert durch Ultrafiltration unter Verwendung von Centriprep YM-10 Filterzentrifuge (Katalog-Nr. 4305, Millipore). </li><li> Das führte zu niedrig (&lt;10 kDa) und hoch (&gt; 10 kDa) Molekulargewichtsfraktionen (MWF) für HMGB1-hemmenden Aktivitäten mit Makrophagen-Kulturen gescreent werden. </li><li> Intraperitoneale Gabe von HMGB1-hemmenden Kräuterextrakt oder Komponenten bei 24 Stunden nach CLP zu evaluieren ihre therapeutische Wirksamkeit. </li></ol> 3. Peritonealen Makrophagen Isolierung <ol><li> Thioglycolat-Brühe (4%, 2,0 ml) intraperitoneal in normale Mäuse verabreicht. </li><li> Primäre Peritonealmakrophagen werden zu 3 Tage früher als 10 beschrieben geerntet. </li><li> Makrophagen sind vorkultiviert in DMEM-Medium (Gibco BRL, Grand Island, NY), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mmol / l Glutamin und 1% Penicillin. </li><li> Adhärente Makrophagen vorsichtig mit gewaschen und kultiviert, serumfreien OPTI-MEM I Medium zwei Stunden vor der Stimulation mit bakteriellem Endotoxin (Lipopolysaccharid, LPS, E. coli 0111: B4, Sigma-Aldrich). </li><li> 16 Stunden nach der LPS-Stimulation, die Spiegel des HMGB1 in dem Kulturmedium durch Western-Blot-Analyse 11 bestimmt. </li><li> Die relative Bandenintensität wurde unter Verwendung des NIH-Image-Software 1,59 HMGB1 Ebenen mit Bezug auf Standardkurven mit gereinigtem HMGB1 erzeugt bestimmen quantifiziert. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse 1. CLP induziert systemische und lokale Entzündung. Innerhalb von wenigen Stunden von CLP Chirurgie, zeigen Tiere klinische Symptome einer Sepsis, die Piloerektion, Lethargie, kauern, und die Abnahme der Futter-und Wasseraufnahme sind. Tiere entwickeln eine schwere Bauchfellentzündung mit konsekutiver systemischer96 Stunden - Infektion in der Regel innerhalb von 48 sterben. Allerdings kann auch das Alter, das Geschlecht und genetischen Hintergrund abgestimmt Tieren reagieren Operation in einer unterscheidbaren Weise im Verlauf der experimentellen Sepsis CLP. Zum Beispiel bei 48 Stunden nach der CLP, während einige Tiere dem schlechten Zustand (wie in 1 definiert sind) Ansätze möglich sind, können andere in einem Nicht-moribunde Zustand bleiben. Umfassende Erhebungen über zirkulierende Zytokine zeigten dramatische Unterschiede bei den verschiedenen Zytokinen (zB IL-6, KC, MIP-2, und sTNFR1) zwischen Mäusen in den maroden und nicht-sterbenden Staaten (Abbildung 1) 12. Bemerkenswerterweise haben diese Entzündungsmediatoren als Surrogat-Marker der Sepsis klassifiziert worden, weil ihre Blutspiegel zuverlässige Prädiktoren für tödlichem Ausgang sind in der experimentellen oder klinischen Sepsis 12-14 15. Darüber hinaus CLP auch lokale Freisetzung von verschiedenen pro-und anti-inflammatorische Zytokine und Chemokine induziert. Zum Beispiel bei der48 h nach der CLP, signifikante Mengen von Cytokinen (zB IL-6) und Chemokine (KC und MIP-2) noch nicht nur systemisch im Blut gemessen werden, sondern auch lokal im Peritoneallavage Fluid (2). 2. Screening für HMGB1-hemmenden Kräuterextrakt oder Komponenten. Mit Makrophagen-Kulturen, konnten wir die Kapazitäten der verschiedenen Kräuterextrakt oder Komponenten bei der Hemmung der Endotoxin-induzierten Freisetzung HMGB1 (Abbildung 3) zu bewerten. Angesichts ihrer Kapazität bei der Hemmung der Freisetzung HMGB1 wir weiter erforscht ihre Wirksamkeit in Tiermodellen Sepsis. Einem Zeitpunkt, wenn Mäuse deutliche Anzeichen einer Sepsis entwickelt einschließlich Lethargie, Durchfall und Piloerektion - Angesichts der späten und verlängerte Kinetik der Akkumulation HMGB1 in der experimentellen Sepsis 8, wurde die erste Dosis von HMGB1-Hemmern 24 Stunden nach dem Auftreten der Sepsis gegeben. Wie in 4 gezeigt ist, verzögert und wiederholte Verabreichung einer großen grünen Tee cls Bestandteil, Epigallocatechin-3-Gallat (EGCG), beginnend bei 24 h nach Beginn einer Sepsis, deutlich gerettet Mäuse vor tödlichen Sepsis 12. Selbst wenn es oral verabreicht, EGCG noch zu retten Mäuse vor tödlichen Sepsis, die deutliche Steigerung Tier-Überlebensraten von 16% auf 44% 16. Es wäre wichtig, um festzustellen, ob kombinatorische Therapien mit verschiedenen pflanzlichen Komponenten konnte eine signifikante besseren Schutz im Tiermodell der Sepsis zu erzielen. Zusammengenommen sind diese experimentellen Daten unserer Herangehensweise an Bildschirm neuartigen therapeutischen Wirkstoffen mit einem Tiermodell der CLP-induzierten Sepsis validiert. 5. Repräsentative Ergebnisse <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3926/3926fig1.jpg" /> Abbildung 1. Zirkulierenden Spiegel Surrogatmarker sind dramatisch höher in septischen Tieren nähern moribunden Zustand. Balb / C-Mäuse wurden zu einer Sepsis durch CLP unterworfen und überwacht werden für die Entwicklung von Anzeichen einer Krankheit. An einspäten Stadium der Sepsis (52 Stunden nach der CLP) wurde Blut aus 3 normalen Mäusen (-CLP), 3 septischen Tieren nähert dem schlechten Zustand, und 3 septischen Tiere in der nicht-moribunde Zustand gesammelt. Das Serum wurde aus jeder Gruppe vereinigt, und im Hinblick auf die Zytokin-Profils von Antikörper-Arrays. Notieren Sie sich den dramatischen Unterschied in der relativen Pegel von mehreren Surrogat-Marker zwischen verschiedenen Gruppen. Übernommen aus doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 mit Erlaubnis des Herausgebers. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3926/3926fig2.jpg" /> Abbildung 2. Nachweis von lokalen und systemischen Cytokine und Chemokine bei 48 Stunden nach CLP. Balb / C-Mäuse wurden von Sepsis durch CLP unterzogen, und Blut oder Peritonealflüssigkeit wurden nach 48 h nach CLP geerntet. Relative Ebenen mehrerer Zytokine und Chemokine im gepoolten Serum oder peritoneale Lavage wurden von Zytokin-Antikörper-Arrays gemessen und ausgedrückt in willkürlichen Einheiten (AU). Als Kontrollen, Blut-und Peritonealflüssigkeit SAmples wurden aus normalen gesunden Tieren (-CLP) ohne Laparotomie erhalten. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3926/3926fig3.jpg" /> Abbildung 3. Herbal Komponente dosisabhängig gehemmt Endotoxin-induzierten Freisetzung HMGB1 in primären Makrophagen-Kulturen. Primären murinen peritonealen Makrophagen mit LPS in Abwesenheit oder Anwesenheit von Kräuter-Komponente (zB EGCG, 15 pM) stimuliert wurden. 16 Stunden nach der LPS-Stimulation wurden Ebenen von HMGB1 in dem Kulturmedium durch Western-Blot-Analyse bestimmt. Übernommen aus doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 mit Erlaubnis des Herausgebers. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3926/3926fig4.jpg" /> Abbildung 4. Herbal Komponente gerettet Mäuse aus tödliche Sepsis. Balb / C-Mäuse wurden zu tödlichen Sepsis durch CLP unterzogen und Kräuter-Komponente (EGCG) wurde intraperitoneal bei +24 verabreicht wird, posten 48, 72 Stunden das Auftreten von Sepsis. Einimal Überleben wurde für bis zu zwei Wochen beobachtet. Die Kaplan-Meier-Methode wurde verwendet, um die Unterschiede in der Sterblichkeit zwischen den Gruppen zu vergleichen. *, P &lt;0,05 im Vergleich zu Kochsalzlösung. Übernommen aus doi: 10.1371/journal.pone.0001153.g006 mit Erlaubnis des Herausgebers.

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AES und HW sind Miterfinder der Patentanmeldungen im Zusammenhang mit HMGB1-Inhibitoren (tanshinones) als potenzielle Therapeutika für die Sepsis.

Im Labor wurden verschiedene Tiermodelle der Sepsis eingesetzt worden, um die Pathogenese der Sepsis zu verstehen, um mögliche neue Therapien zu entwickeln. Deren klinische Relevanz bleibt ein Thema der Debatte vor der gelungene Übersetzung von Tierversuchen in klinische Anwendungen für die Sepsis. Obwohl neutralisierende Antikörper gegen den frühen Zytokinen (zB TNF) waren Schutzschicht in Tiermodellen von Bakteriämie / Endotoxämie 17,18 sie tatsächlich verschlechtern Überleben im Tiermodell der Sepsis ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> Purdue Products LP </td><td> 25655-41-8 </td></tr><tr><td> Imipenem </td><td> Merck &amp; Co., Inc. </td><td> 9882821 </td></tr><tr><td> Ketamin HCl </td><td> Hospira Inc. </td><td> RL-0065 </td></tr><tr><td> Xylazin </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> 4821 </td></tr><tr><td> Autoclip </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427631 </td></tr><tr><td> 4-0 Seidenfaden </td><td> Roboz </td><td> SUT-15-2 </td></tr><tr><td> Surflo IV-Katheter </td><td> Terumo </td><td> SR * OX2419CA </td></tr><tr><td> RayBio Maus Zytokin-Antikörper-Array </td><td> RayBiotech, Inc. </td><td> AAM-CYT-3 </td></tr><tr><td> Thioglycollate </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211716 </td></tr></tbody></table>

die verwendung tiermodell für sepsis zu neuartigen therapien zu beurteilen herbal

Use of Animal Model of Sepsis to Evaluate Novel Herbal Therapies

Sepsis bezieht sich auf eine Systemic Inflammatory Response Syndrome, die aus einer mikrobiellen Infektion. Es wurde routinemäßig simulierten bei Tieren durch mehrere Techniken, einschließlich der Infusion von exogenem bakterielles Toxin (Endotoxämie) oder Bakterien (Bakteriämie), sowie chirurgische Perforation des Blinddarms von Blinddarm Ligation und Punktion (CLP) 1-3. CLP ermöglicht es Bakterien Verschütten und fäkalen Verunreinigung der Bauchhöhle, Nachahmung der menschlichen klinischen Erkrankung der perforierten Appendizitis oder Divertikulitis. Die Schwere der Sepsis, wie durch die eventuelle Sterblichkeit reflektiert, können chirurgisch durch Variieren der Größe der Nadel zum Blinddarm Punktion 2 verwendet gesteuert werden. Bei Tieren induziert CLP ähnlich, biphasische hämodynamischen kardiovaskulären, metabolischen und immunologischen Reaktionen, wie bei den klinischen Verlauf der menschlichen Sepsis 3 beobachtet. So wird die CLP-Modell als eines der klinisch relevanten experimentellen Modellen für Sepsis 3.1 berücksichtigt. &lt;/ P&gt; Verschiedene Tiermodelle wurden verwendet, um die komplizierten Mechanismen der Pathogenese der experimentellen Sepsis aufzuklären. Die tödliche Folge von Sepsis basiert teils auf einer übermäßigen Ansammlung von frühen Zytokine (wie TNF, IL-1 und IFN-γ) 4-6 und späten proinflammatorischen Mediatoren (zB HMGB1) 7. Im Vergleich mit früher proinflammatorische Zytokine, haben Ende wirkenden Mediatoren eine größere therapeutische Fenster für klinische Anwendungen. So verzögerte Gabe von HMGB1-neutralisierende Antikörper beginnend 24 Stunden nach CLP, noch zu retten Mäuse aus Letalität 8,9, Gründung HMGB1 als späte Vermittler von tödlichen Sepsis. Die Entdeckung von HMGB1 als spät wirkender Mediator hat ein neues Feld der Forschung für die Entwicklung einer Sepsis Therapien mit traditionellen chinesischen Kräutermedizin eingeleitet. In diesem Beitrag beschreiben wir ein Verfahren der CLP-induzierten Sepsis, und seine Verwendung in Screening Kräutermedizin für HMGB1-Targeting-Therapien.

Sepsis bezieht sich auf eine systemische inflammatorische Reaktion, die sich aus einer mikrobiellen Infektion, und simuliert werden können durch eine Blinddarm-OP-Technik bezeichnet Ligatur und Punktion (CLP). Hier beschreiben wir eine Methode zur CLP-induzierte Tiermodell zu verwenden, um Heilkräuter für therapeutische Wirkstoffe zu screenen.

Die Verwendung Tiermodell für Sepsis zu neuartigen Therapien zu beurteilen Herbal

Sepsis bezeichnet ein systemisches Entzündungsreaktionssyndrom infolge einer mikrobiellen Infektion. Sie wurde routinemäßig in Tieren durch verschiedene ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Mausmodell der Sepsis durch eine chirurgische Methode namens SQL-Ligatur und Punktion, oder CLP, zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein 1,5 bis zwei Zentimeter langer medianer Schnitt im Bauchbereich einer Maus angelegt wird. Anschließend wird das Caecum freigelegt und ligiert, danach wird das Caecum punktiert, um eine bakterielle Translokation auszulösen.Schließlich wird der Einschnitt verschlossen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Anstiege der systemischen und peritonealen Zytokinspiegel sowie Symptome wie Lethargie und Letalität zeigen. Ich werde Ihnen zeigen, wie man ein Maus-Sepsismodell namens Sation und Punktion erzeugt, das von dem ursprünglichen Modell abgeleitet ist, das von Dr. Chandry und seinen Kollegen entwickelt wurde.Der durchschnittliche Hauptvorteil dieses Modells besteht darin, dass es das am besten geeignete Modell für Sepsis ist. Außerdem ist es einfach, gut charakterisiert und wirtschaftlich machbar und wurde daher in der Sepsis- und Entzündungsforschung weit verbreitet eingesetzt. Als Beispiel werden wir die Anwendung dieses Modells zur Bewertung des therapeutischen Pot

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Das Mausmodell der Blinddarm Ligatur und Punktion als ein wertvolles Instrument für das Studium der menschlichen Sepsis.

Blinddarm Ligation Punktion

Dieses Protokoll beschreibt ein zentral katheterisiertes Mausmodell für anhaltende kritische Erkrankungen. Wir kombinieren die Zäkalligatur und die Punktionsmethode zur Induktion einer Sepsis mit der Verwendung eines zentralen Venenzugangs für die Verabreichung von Flüssigkeiten, Medikamenten und Nährstoffen, um das klinische Umfeld des Menschen nachzuahmen.

Die Verwendung eines zentralen Venenkatheter für Flüssigkeiten, Drugs und Nährstoffverwaltung in einem Maus-Modell der Critical Illness

Dieses Protokoll beschreibt Techniken zur Messung von infektiösen Ergebnissen, die sekundären Krankenhausinfektionen im immunsuppressiven Zustand zugrunde liegen, indem sie zunächst Cecal-Ligations-/Punktionsmäuse einrichten und sie mit intranasalen Infektionen herausfordern, um ein klinisch relevantes Modell der Immunsuppressionssepsis zu erstellen.

Design von Cecal Ligation und Punktion und Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Hier stellen wir ein reproduzierbares intensivstationsorientiertes Endotoxinmodell an Ratten vor.

Ein reproduzierbares intensivstationsorientiertes Endotoxinmodell bei Ratten

Dieses Protokoll stellt die operativen Details der Stuhlligatur und -punktion (CLP) in einem Mausmodell der Sepsis dar. CLP ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken, um ein Tiermodell für Sepsis zu erstellen. Daher ist ein standardisiertes CLP-Protokoll erforderlich, um zuverlässige Forschungsergebnisse zu erzielen.

Bewertung eines zuverlässigen Biomarkers in einem Stuhlligatur- und Punktions-induzierten Mausmodell der Sepsis

Das Protokoll bietet einen detaillierten Standardisierungsprozess der Abkochformel und der Sondentechnik am Beispiel der Yiqi Jiedu-Abkochung im Osteosarkom-Mausmodell. Es beschreibt den Tierschutz und verbessert die Zuverlässigkeit von Forschungsdaten, indem es effektive Strategien zur Untersuchung der therapeutischen Wirksamkeit und der molekularen Mechanismen von Abkochrezepturen in vivo bietet.

Sondenstrategie für die Sudformel der Traditionellen Chinesischen Medizin bei Osteosarkom-Modellmäusen

Ein Maus-Tumormodell der chirurgischen Stress wird verwendet, um zu erkunden, wie postoperative Immunsuppression fördert Metastasen und immunstimulierende perioperative Therapien zu evaluieren.

Ein Maus-Tumormodell der operativen Belastung zu Entdecken Sie die Mechanismen der postoperative Immunsuppression und Bewerten Novel Perioperative Immuntherapien

Hier wird die Methode zur Etablierung eines syngenen Mausmodells eines orthotopen Blasentumors beschrieben, um die Anti-Tumor-Wirksamkeit des bakteriellen Proteins HP-NAP zu bewerten.

Bewertung der Wirksamkeit der<em&gt; H. pylori</em&gt; Protein HP-NAP als therapeutisches Werkzeug zur Behandlung von Blasenkrebs in einem orthotopen Mausmodell

GL261 Gliomzellen stellen ein nützliches immunkompetentes Tiermodell des Glioblastoms dar. Die Ziele dieses Protokolls sind die Demonstration geeigneter Techniken zur Überwachung des intrakraniellen Tumorwachstums unter Verwendung von in vivo Biolumineszenz-Bildgebung und die Überprüfung des Nutzens von Luciferase-modifizierten GL261-Zellen für die Untersuchung der Tumorimmunologie und immuntherapeutischer Ansätze zur Behandlung von Glioblastomen.

Biolumineszenz-Bildgebung von einem immunkompetenten Tiermodell für Glioblastoma

Dieses Papier beschreibt die Vorbereitung und Auswertung der Nabelschnur Matrix-mesenchymale Stammzellen Sphäroide mit einem bilateralen Patellasehne defekt-Modell in eine Ratte. Dieses Modell wurde wurde mit einer akzeptablen Morbidität verbunden festgestellt, dass die Unterschiede zwischen unbehandelten und behandelten sehnen erkennen und zwischen den beiden Behandlungen getestet.

Bewertung von Stammzelltherapien in einem bilateralen Patellasehne Verletzungen Modell bei Ratten

Erfahren Sie die Erstellung eines Sepsis-Mausmodells mittels zäkaler Ligatur und Punktion zur Bewertung therapeutischer Kräuterextrakte. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung systemischer Entzündungsreaktionen und die Entwicklung neuartiger Behandlungsansätze.

Die Verwendung Tiermodell für Sepsis zu neuartigen Therapien zu beurteilen Herbal

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