Name: Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Neuronen in serumfreien Bedingungen. Dieses Protokoll ermöglicht reine neuronale Kulturen für neurobiologische Forschung.

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Wir bedanken uns bei Jonna Ellis für die redaktionelle Unterstützung. Vom National Institute of Mental Health: Das Projekt beschrieben wurde von Verleihungsnummer R01MH079751 (F. Peruzzi PI) unterstützt. Der Inhalt ist ausschließlich der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung des National Institute of Mental Health oder des National Institutes of Health.

1. Poly-D-Lysin (PDL): Herstellung <ol><li> 5 ml sterilem ddH 2 O bis 5 mg PDL um eine Stammlösung von 1 mg / ml zu erhalten. </li><li> Mischen Sie Stammlösung durch mehrmaliges Pipettieren. </li><li> Sofort verwenden oder speichern Poly-D-Lysin-Lösung bei 2-8 ° C. </li></ol> 2. Poly-D-Lysin (PDL): Beschichtung Zellkulturschalen <ol><li> Verdünnen Sie die PDL-Stammlösung mit sterilem ddH 2 O auf die Endkonzentration von 10 ug / ml. </li><li> Pipette genug Lösung in eine 60 mm-Schale zur Kultur-Oberfläche (3 ml für eine 60 mm-Schale) zu decken. </li><li> Schaukeln sanft auf gleichmäßige Beschichtung der Oberfläche Kultur zu gewährleisten. </li><li> Inkubieren beschichtete Platten bei Raumtemperatur (RT) über Nacht. </li><li> Am nächsten Tag, in der Regel der Tag der Dissektion, entfernen Sie das Poly-D-Lysin-Lösung durch Absaugen und waschen kurz mit 3 ml sterilem ddH 2 O. Wiederholen Sie diesen Schritt. Nach dem zweiten Waschen, Wasser vollständig zu entfernen durch Absaugen. </li><li>Die Platten können bei 4 ° C für bis zu drei Wochen gelagert werden. </li></ol> 3. Poly-D-Lysin (PDL) und Laminin: Vorbereitung und Beschichtung von Glas Zwei-Kammer-Objektträgern <ol><li> Mix PDL (1 mg / ml) und Laminin (1 mg / ml) Stammlösungen in sterilem ddH 2 O bis zu einer Endkonzentration von 10 und 5 g / ml. </li><li> Pipette genug Lösung in die Vertiefungen einer Glas Zwei-Kammer-Objektträger, die Kultur Oberfläche (1 ml pro Vertiefung einer 2 gut Glas Zwei-Kammer-Objektträger) bestimmt. </li><li> Schaukeln sanft auf gleichmäßige Beschichtung der Oberfläche Kultur zu gewährleisten. </li><li> Inkubieren beschichteten Platten über Nacht bei RT. </li><li> Am nächsten Tag, entfernen Sie das Poly-D-Lysin-Beschichtung Laminin-Lösung durch Absaugen und waschen Sie kurz zweimal mit 1 ml sterilem ddH 2 O. Nach dem zweiten Waschen, Wasser vollständig zu entfernen durch Absaugen. </li><li> Chamber Slides können bei 4 ° C für bis zu drei Wochen gelagert werden. </li></ol> Hinweis: Jeder Glas Chamber Slide können beschichtet werden following dieses Protokoll. Wir verwenden oft die Zwei-Kammer-Objektträgern, weil jede Folie ermöglicht die Steuerung-Test experimentellen Setting (z. B. im Vergleich zu unbehandelten behandelt, im Vergleich zu untransfizierte transfiziert). 4. Neuronale Dissection und Kultur <ol><li> Wärmen Sie die folgenden Reagenzien in einem 37 ° C warmes Wasserbad: <ul type="disc"><li> TrypLE Express auf seiner ursprünglichen 100 ml Flasche. </li><li> Neurobasal/B27 Vollmedium (siehe Tabelle I). Das Volumen erwärmt hängt von der Anzahl der Gänge zu plattierenden (zB 30 ml für zehn 60 mm beschichtet Geschirr). </li></ul></li><li> 3 ml kaltem Ruhezustand E-Lösung, um vier 60 mm-Kulturschalen und 13 ml einer 15 ml Falcon BD hohe Klarheit Polypropylen konische Röhre. </li><li> In 25-30 ml kaltem Dissektion Medium (siehe Tabelle II, Dr. Olimpia Meucci, persönliche Mitteilung) zu jeder der drei 100 mm-Kulturschalen. Diese Platten, die eine große Volumen des Mediums, wird verwendet, um die Embryonen unmittelbar nach ihrer waschenEntnahme aus den Fruchtblasen (Schritte 4.7 und 4.8). </li><li> Euthanize einen E17 timed trächtigen Ratten durch CO 2 in Übereinstimmung mit Public Health Services Policy über humane Pflege und Verwendung von Labortieren und unter einer institutionell genehmigt Tierpflege und nutzen Protokoll. </li><li> Sprühen Sie Unterbauch mit 70% EtOH und schneiden medial durch die Haut und Muskeln mit einer Schere Aussetzen der Gebärmutter und Embryonen. </li><li> Entfernen Sie alle Föten und legen Sie sie in einem sterilen 100-mm-Schale mit einem Überschuß von kaltem Medium Dissektion (25-30 ml, siehe Schritt 4.3). </li><li> Schneiden Embryonen mit Hilfe eines kleinen Schere aus Fruchtblase und legen Sie sie in der zweiten 100-mm-Schale mit kaltem Medium Dissektion. </li><li> Waschen der Embryonen bei Raumtemperatur durch leichtes Kippen des 100-mm-Schale für 5-10 Sekunden. Dann übertragen Sie die gespülten Embryonen in die dritte Schale mit 100 mm Sezieren Medium. Zwei Waschungen in überschüssige Medium sind in der Regel aus, um alle Spuren von Blut zu entfernen. Jedoch, wenn notwendig,Essary, waschen Sie ein weiteres Mal mit einer frischen 100-mm-Schale mit 25-30 ml kaltem Medium Dissektion. </li><li> Mit einem Stereomikroskop und einer gebogenen Pinzette, extrahieren jeder Ratte Embryo das Gehirn durch Herausziehen der Haut und Schädel. Zeigen gesamte Gehirn in einem der 60-mm-Schalen (in der Regel mit nicht mehr als 5 Gehirne pro Schale) mit kaltem Hibernate E. Bewahren Sie diese Platten auf Eis. </li><li> Nehmen Sie eine Schüssel zu einer Zeit und unter einem Binokular, trennen Sie die Hemisphären und isolieren die zerebralen Kortex Entfernen des Mittelhirns und der Hirnhäute. </li><li> Optional: Schnitt Gehirne auf die Mittellinie, extrahieren hippocampi, und gehen Sie folgendermaßen vor, um Hippocampus-Neuronen zu isolieren. </li><li> Sammeln Sie alle seziert Kortex in einem 15-ml klare konischen Rohr mit 13 ml kaltem Hibernate E. Lassen Sie die zerebralen Kortex auf Eis, bis alle Sektionen abgeschlossen sind. Aufgrund ihrer geringen Größe kann präpariert hippocampi in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen anstelle einer 15-ml-Röhrchen gesammelt werden. Falls gewünscht, in diesem Schritt Kortex oderhippocampi in einem Kryoröhrchen Fläschchen mit 1 ml gebracht werden Ruhezustand E + B27 + 2% Gentamicin (50 ug / ml) + Fungizone (250 ng / ml) im Verhältnis von 2-4 oder 2-4 Kortex hippocampi pro Röhrchen. Hirngewebe bei 4 ° C im Dunkeln bis zu einer Woche (späteren Zeiten nicht noch nicht getestet) gespeichert werden. Bei Bedarf nutzen, um die feinen Pinzette Hirngewebe in ein 15 ml Röhrchen mit Hibernate E übertragen und folgen Sie dann das Protokoll unten, um Neuronen zu isolieren. </li><li> Übertragen der Röhre eine Gewebekulturabzug. Lassen Sie die Rinden auf dem Boden des Röhrchens absetzen und dann vorsichtig den Überstand. </li><li> In 13 ml frisch Hibernate E an den 15-ml konischen Röhrchen, erlauben Kortex am Boden des Röhrchens absetzen und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Schritt 2 weitere Male und nach dem letzten Waschen, sorgfältig entfernen Sie alle Medien. </li><li> Enzymatisch verdauen zerebralen Kortex mit indem 1-2 ml (abhängig von der Anzahl Rindenanzahl; verbrauchen weniger für hippocampi Trennung) von warmem TrypLE Express. Verschließen Sie den Deckel des Röhrchens mit Parafilm und schweben Sie den Schlauch in einem 37 ° C warmen Wasserbad für 10 Minuten. </li><li> Sprühen Sie das Rohr mit 70% Ethanol vor dem Öffnen der Kappe und 10 ml Hibernate E. Lassen Sie die Rinden am Boden des Röhrchens absetzen und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt dreimal zu waschen TrypLE Express. Im letzten Schritt entfernen Sie vorsichtig alle Medien. </li><li> Sanft verreiben (4-5 mal) die Rinden in 2 ml Neurobasal/B27 Vollmedium mit einem Feuer-poliertem Glas Pasteur (ca. 1 mm im Durchmesser). Seien Sie vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. </li><li> Wiederholen weitere 4-5 Mal mit einer sterilen Pasteurpipette aus Glas kleineren Durchmesser (dh eine Pipette zu 1/2-3/4 mm im Durchmesser). Verwenden Sie nicht einer Pasteurpipette kleiner als diese, oder es wird die Zellen zu zerstören. </li><li> Erlauben restlichen Stücke von Gewebe (in der Regel nur sehr wenige, wenn überhaupt) zu begleichen. </li><li> Übertragen der oberen Einzelzell-Suspension auf ein neues 15-ml-Röhrchen, hinterlässt ständiger Gewebestücke. Pelzther verdünnen die Zellsuspension bis zu 10-12 ml mit Neurobasal/B27 Vollmedium. </li><li> Gut mischen und verdünnen Zellen zum Zählen durch Zugabe von 10 ul Zellsuspension zu 490 ul 50x Counting Lösung (siehe Tabelle III) in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Tafel Zellen auf PDL-beschichteten Platten mit einer Dichte von 5,0 x 10 4 / cm 2. Wenn Nukleofektion durchgeführt werden soll, empfehlen wir Ausplattieren der Zellen in einer höheren Konzentration (8-10 x 10 4 / cm 2). </li><li> Normalerweise sezieren wir 9-10 Feten pro Experiment, wie etwa 13 x 10 6 Neuronen aus jedem E17 Fötus stammen. Wenn mehr Embryonen benötigt werden, um sicherzustellen, dass die ganze Prozedur dauert nicht länger als zwei Stunden. </li><li> Falls gewünscht, 24 Stunden nach der Isolierung können 10 uM Cytosin-β-D-arabinofuranosid (AraC) jeder Schale zugegeben werden, um Gliawucherung verhindern. Jedoch ist dieser Schritt nicht erforderlich, da Neurobasal/B27 Medium inhibiert Gliawucherung, Gemäß den Empfehlungen des Herstellers (Invitrogen / Gibco). </li><li> Neuronen können für Experimente nach 4-5 Tagen in vitro verwendet werden, obwohl genaue Zeit hängt von der gewünschten Differenzierung der Bühne. Wir haben kultivierten Neuronen für bis zu 4 Wochen ohne eine signifikante Abnahme der Überlebensrate (Abbildung 1). </li><li> Für längere Kultivierung, ersetzen Kulturmedium jede Woche mit frisch zubereiteten Neurobasal/B27 Vollmedium. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Neuronen auf Glas Chamber Slides kultiviert werden können, um Immunzytochemie unterzogen werden. 1 zeigt ein typisches Bild einer kortikalen Neuronen nach fünf Tagen in Kultur fixiert und immunmarkiert mit anti-MAP-2-Antikörper auf neuronale Prozesse zeigen. 2 zeigt ein repräsentatives Bild einer Ratte Hippocampus nach 3 Wochen in Kultur. Die neuronale Morphologie einer ausdifferenzierten Zelle wird durch MAP-2 hervorgehoben immunolabeling (MAP-2 neuronalen Marker, monoklonalen Maus-Antikörper Klon AP-20, Gene Tex, Irvine, CA) nach einem Standard-Verfahren wie zuvor 1 beschrieben. Die Bilder wurden sichtbar gemacht mit der Nikon Eclipse E400 aufrecht Fluoreszenz-Mikroskop mit Kamera EXI aqua (Qimaging), motorisierte Z-Achse, und SlideBook5 Akquisition / Dekonvolution Software (Intelligent Imaging Innovations, Inc., Denver, CO) ausgestattet. Eine Reihe von dreidimensionalen Bildern der einzelnen Bild wurden zu einem zweidimensionalen Bild zerlegt und aufgelöst durch Anpassung der Signal Cut-off in der Nähe von maximaler Intensität, um die Auflösung zu erhöhen. Abbildung 3 zeigt Reinheit der neuronalen Kulturen. Protein wurden Lysate DIV7 Ratte neuronalen Kulturen (CTX) und von einem Fall von humanen Glioblastomen (GBM) erhalten. Wie erwartet, ist die neuronale Lysat stark positiv für die neuronale Protein MAP-2 und negativ für den Astrozyten-Marker GFAP, während der GBM Proteinlysatpräparation negativ ist foder MAP-2 und positiv für GFAP. Obwohl in unserem Protokoll wir verwendet haben Hibernate E für mehrere Jahre als sezieren und Spülmedium, vor kurzem haben wir ein zusätzliches und sehr praktischen Gebrauch davon, um Hirngewebe zur weiteren Verwendung zu erhalten erforscht. Abbildung 4 zeigt einen Tag in-vitro-5 (DIV5) Kultur von Ratten-kortikalen Neuronen aus Kortex bei 4 ° C für eine Woche lang in den Ruhezustand E + B27 ihres ursprünglichen Präparation von den Embryonen isoliert. Neuronen wurden auf einer Glasbasis Zwei-Kammer-Objektträger mit PDL und Laminin beschichtet, wie zuvor beschrieben ausplattiert. Das aufgenommene Bild wurde mit Hilfe entfaltet SlideBook5 Akquisition / Dekonvolution Software wie oben beschrieben (Abb. 2). <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig1.jpg" /> Abbildung 1. Repräsentatives Bild einer kortikalen Neuronen mit pmaxGFP (Amaxa, Lonza, Walkersville, MD) und nucleofected immunmarkiert mit MAP-2 Antikörper, in rot. Original-Vergrößerung 100x. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vertreter Bild zeigt MAP-2 Immunomarkierung, in rot, von Neuronen im Hippocampus nach 3 Wochen in der Kultur. DAPI-Färbung, in blau, zeigt Zellkernen. Original-Vergrößerung 40x. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig3.jpg" /> 3. Western-Blot, Reinheit von neuronalen Zellkulturen. 30 ug neuronalen Ratten und menschlichen GBM Protein-Lysate wurden durch Elektrophorese aufgetrennt und einer Western-Blot-Analyse nach Standardverfahren ein. Anti-MAP-2 war ein polyklonaler Hasen von Cell Signaling (Danvers, MA), wurde Anti-GFAP-Antikörper ein monoklonaler Maus von Chemicon (Millipore, Billerica, MA), und die monoklonalen anti-GRB2 Antikörper wurde von Transduction Laboratories BD ( Sparks, MD). GRB2 wurde als Kontrolle verwendet Belastung. </p&gt; <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3965/3965fig4.jpg" /> Abbildung 4. Vertreter Bilder der Tage in vitro 5 (DIV5) kortikale Neuronen der Ratte aus Kortex links in Hibernate erhaltenen E + B27 bei 4 ° C für eine Woche nach ihrer Präparation. A) Phasenkontrast von Neuronen auf einem Glas-Zwei-Kammer-Objektträger kultiviert. Original-Vergrößerung 20x. B) Immunfluoreszenz, der die Expression von MAP-2 bei der neuronalen Prozessen, grünen, die Kultur wurde für die Astrozyten-Marker GFAP negativ. DAPI-Färbung, in blau, zeigt Zellkernen. Original-Vergrößerung 40x.

<ol><li>Aprea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin-mediated+binding+of+human+immunodeficiency+virus-1+Tat+to+the+cytoskeleton+causes+proteasomal-dependent+degradation+of+microtubule-associated+protein+2+and+neuronal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tubulin-mediated binding of human immunodeficiency virus-1 Tat to the cytoskeleton causes proteasomal-dependent degradation of microtubule-associated protein 2 and neuronal damage.</a> J. Neurosci. 26, 4054-4062 (2006).</li>
<li>Kivell, B. M., McDonald, F. J., Miller, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+rat+post-natal+and+fetal+brainstem+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Dev.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of rat post-natal and fetal brainstem neurons.</a> Brain Res. Dev. Brain Res. 120, 199-210 (2000).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Methode der Präparation und Kultur von Ratten-Hippocampus und kortikalen Neuronen hier beschriebenen ermöglicht die Durchführung von Experimenten unter Verwendung nahezu reinen neuronalen Kulturen in einem chemisch definierten Medium (Abbildung 3) gewachsen. Obwohl Protokolle für die Kultivierung nahezu reinem Neuronen in serumfreiem Medium wurden zuvor 2,3,4 beschrieben, gibt es wesentliche Änderungen in unserer Methode. Anders als bei traditionellen Protokollen (zB Banker et al.) 5...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> 98% </td></tr><tr><td> B27 </td><td> 2% </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> 0,5 mM </td></tr></tbody></table> Tabelle I Neurobasal/B27 Vollmedium. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 16 mM </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 22 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 160 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 2 </td><td> 0,22 mM </td></tr><tr><td> Gentamicin </td><td> 50 ug / ml </td></tr&gt; <tr><td> Fungizone </td><td> 250 ng / ml </td></tr><tr><td> pH-Wert </td><td> 7,4 </td></tr><tr><td> Osmolarität </td><td> 320-330 mOsm </td></tr></tbody></table> Tabelle II. Dissection Medium. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Volume (ul) </td></tr><tr><td> Neurobasal/B27 Vollmedium </td><td> 240 </td></tr><tr><td> Trypanblau Stain 0,4% </td><td> 250 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 490 </td></tr></tbody></table> Tabelle III. 50x Counting Lösung. <table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Firma </td><td> Cat. Anzahl </td></tr><tr><td> Hibernate E </td><td> Brainbits </td><td> 767171 </td></tr><tr><td> Neurobasal </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 21103-049 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 17504-044 </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15290-018 </td></tr><tr><td> Gentamicinsulfat </td><td> Sigma Aldrich </td><td> G1264 </td></tr><tr><td> 200 mM Glutamax </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050 </td></tr><tr><td> TrypLE Express w / o Phenolrot </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 12604 </td></tr><tr><td> Cytosin-β-D-Hydrochlorid arabinofuranosid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C6645 </td></tr><tr><td> Poly-D-Lysin </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P6407 </td></tr><tr><td> Laminin 1 mg / ml </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma Aldrich </td><td> H3375 </td></tr><tr><td> Trypanblau Stain 0,4% </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 15250 </td></tr></tbody></table&gt; Tabelle IV. Spezifische Reagenzien. <table border="1"><tbody><tr><td> Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Cat. Anzahl </td></tr><tr><td> Stereo-Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> SZ61 </td></tr><tr><td> Große Zange </td><td> FST </td><td> 11022-14 </td></tr><tr><td> Fine-Pinzetten </td><td> Moria </td><td> MC40B </td></tr><tr><td> Micro Fine-Pinzetten </td><td> Moria </td><td> MC31 </td></tr><tr><td> Gestochen scharfe Schere </td><td> Roboz </td><td> RS-6820 </td></tr><tr><td> Micro Präparierschere </td><td> FST </td><td> 91460-11 </td></tr><tr><td> Micro Dissecting gebogenen Schere </td><td> FST </td><td> 14067-11 </td></tr><tr><td> Glas 2-Kammer-Objektträgern </td><td> Lab-Tek </td><td> 154461 </td></tr><tr><td> 60 mm Platten </td&gt; <td> BD Falcon </td><td> 353002 </td></tr><tr><td> 100 mm-Schalen </td><td> Corning </td><td> 430167 </td></tr><tr><td> 15 ml Röhrchen </td><td> BD Falcon </td><td> 352099 </td></tr><tr><td> 1,5 ml Kryo-Röhrchen Fläschchen </td><td> Nunc </td><td> 375353 </td></tr></tbody></table> Tabelle V. Ausstattung.

isolierung und kultivierung von embryonalen ratten-nervenzellen: ein quick-protokoll

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Dissoziation und Kultur oder kortikalen Neuronen des Hippocampus von E15-17 Rattenembryonen. Das Verfahren kann erfolgreich zur Isolierung von Maus und Mensch primären Neuronen und neuralen Vorläuferzellen angewendet werden. Dissoziierte Neuronen in serumfreiem Medium bis zu mehreren Wochen aufrechterhalten. Diese Kulturen können Nukleofektion, Immunzytochemie, Nukleinsäuren Herstellung sowie Elektrophysiologie verwendet werden. Ältere neuronalen Kulturen können auch mit einem guten Wirkungsgrad von lentiviralen Transduktion und, weniger effizient, mit Calciumphosphat oder Lipid-basierte Methoden wie Lipofectamin transfiziert werden.

Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Isolierung und Kultur hippokampalen und kortikalen Neuronen aus Nagetier Embryonen. Dieses Protokoll erlaubt es uns, Experimente, in denen nahezu reinen neuronalen Kulturen sind erforderlich, durchzuführen.

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

Wir beschreiben eine schnelle Methode zur Dissoziation und Kultivierung von hippokampalen oder kortikalen Neuronen aus Rattenembryonen im Stadium E15-17. Das Verfahren kann angewendet werden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, kortikale oder hippokampale Neuronen unter serumfreien Bedingungen zu isolieren und zu kultivieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die Rattenembryonen seziert werden, um die Kortizes oder Hippocampi zu gewinnen. Der zweite Schritt besteht darin, das Gehirngewebe mit Trip le Express zur schonenden enzymatischen Verdauung zu inkubieren.Anschließend werden die Gewebe mit Hibernate E gespült und mechanisch trituriert sowie in vollständigem Kulturmedium suspendiert. Um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten, erfolgt im letzten Schritt die Zählung und Aufplatierung der dissoziierten Neuronen auf mit Poly-D-Lysin beschichteten Schalen oder mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichteten Objektträgern. Letztlich ermöglicht diese Methode die Isolierung und Kultivierung der Neuronen unter serumfreien Bedingungen und ohne gliale Unterstützung.Neuronale Kulturen können für die Immunchemie von Nukleinsäuren, die Probenvorbereitung und die Elektrophysiologie verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass wir Trypsin durch ein schonenderes Enzym ersetzt haben. Wir haben sowohl das Zerklein

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Ein alternativer Weg zur Isolierung von embryonalen Maus-Motoneurone aus dem Rückenmark beschrieben. Die Methode berücksichtigt die Tatsache, dass Lektin kann die geringe Affinität nerve growth factor receptor p75NTR binden. Das Lektin-basierte preplating ermöglicht eine Reinigung ähnlich wie mit einem spezifischen Antikörper gegen das p75NTR.

Lectin-basierte Isolierung und Kultivierung von embryonalen Maus-Motoneuronen

Isolierung von embryonalen Neuralleiste vom Neuralrohr erleichtert die Verwendung...

Isolierung und Kultivierung von Zellen der Neuralleiste aus embryonalen murinen Neuralrohr

Dieses Video stellt eine Methode zur Isolierung von neuralen Stamm-/Vorläuferzellen aus dem periventrikulären Gewebe des Rückenmarks bei erwachsenen Ratten vor. Die Technik beinhaltet die Inkubation der Gewebefragmente in einer Lösung, die proteolytische Enzyme enthält, um die extrazelluläre Matrix zu zerstören und die Zellen freizusetzen. Anschließend werden die freigesetzten Zellen in ein Medium überzogen, das spezifische Wachstumsfaktoren enthält, die die Proliferation von neuralen...

Isolierung von neuralen Stammvorläuferzellen aus der periventrikulären Region des Rückenmarks einer erwachsenen Ratte

Das Video zeigt den Prozess der Isolierung und Kultivierung von Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn von Mausembryonen. Die isolierten ventralen Mittelhirnböden werden mit Hilfe von Enzymen dissoziiert. Die resultierenden Dopamin-Neuronen werden geerntet und in Mikroinseln in Multi-Well-Platten übertragen. Die Zellen werden mit einem Dopamin-Neuronenmedium inkubiert, um die Zellen in den Mikroinseln auf einer hohen Dichte zu halten.

Isolierung und Kultivierung von primären embryonalen Dopamin-Neuronen aus dem Mittelhirn der Maus

Ein Protokoll zur Generierung eines Co-Kultursystems, bestehend aus Neuronen, die von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) abstammen, primären kortikalen Neuronen und Astrozyten wird beschrieben. Dieses Co-Kultursystem ermöglicht den Nachweis der Bildung von synaptischen Kontakten und Schaltkreisen zwischen neuen, iPSC-abgeleiteten Neuronen und bereits vorhandenen kortikalen Neuronen, die Channelrhodopsin-2 exprimieren.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Das Rückenmark eines adulten Säugetieres enthält neurale Stamm-/Vorläuferzellen (NSPCs), die in Kultur isoliert und erweitert werden können. Dieses Protokoll beschreibt die Entnahme, Isolierung, Kultivierung und Passage von NSPCs, die aus der periventrikulären Region des adulten Rückenmarks von der Ratte und von menschlichen Organtransplantatspendern erzeugt wurden.

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Wir modifizieren und Umsetzung eines bereits veröffentlichten Protokoll beschreibt die schnelle, reproduzierbare und effiziente Differenzierung von humanen 12 pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) in exzitatorischen kortikalen Neuronen induziert. Insbesondere ermöglicht unsere Modifikation zur Steuerung neuronaler Zelldichte und der Verwendung auf Mikroelektrodenarrays elektrophysiologischen Eigenschaften auf Netzwerkebene zu messen.

Schnelle Neuronale Differenzierung von induzierten pluripotenten Stammzellen zur Messung der Netzwerkaktivität auf Micro-Elektroden-Arrays

Hier stellen wir eine neuartige mikrochirurgische Technik für die Isolierung von neuralen Stammzellen aus E13 Maus Embryo ganglionic Eminenz.

Isolation und Kultur der embryonalen Maus neurale Stammzellen

Hier präsentieren wir ein Protokoll für Ca2 + Bildgebung in Neuronen und Gliazellen, die das Sezieren von Ca2 + Signale in subzellulären Auflösung ermöglicht. Dieser Prozess gilt für alle Zelltypen, die die Expression von genetisch codierte Ca2 + Indikatoren zu ermöglichen.

Dissektion der lokalen Ca2 + Signale in kultivierten Zellen durch die Membran-gezielte Ca2 + Indikatoren

Dieses Papier beschreibt die Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten sympathischen Neuronen aus den überlegenen zervikalen Ganglien. Es bietet auch detaillierte Protokolle für immunzytochemische Färbung und für die Vorbereitung neuronaler Extrakte für die Massenspektrometrie-Analyse.

Culturing Rat Sympathische Neuronen aus embryonalen überlegenen Cervical Ganglia für morphologische und proteomische Analyse

Hier präsentieren wir einen einfachen Ansatz mit spezifischen Kulturmedien, die die Etablierung von neuron- und astrozytenangereicherten Kulturen oder neuronglia-Kulturen aus dem embryonalen Kortex mit hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit ermöglichen.

Ein Zellkulturmodell zum Studium der Rolle von Neuron-Glia-Interaktionen in Ischämie

Lernen Sie die Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Neuronen in serumfreien Bedingungen. Dieses Protokoll ermöglicht reine neuronale Kulturen für neurobiologische Forschung.

Isolierung und Kultivierung von embryonalen Ratten-Nervenzellen: ein Quick-Protokoll

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