Solubilisierung und Bio-Konjugation von Quantenpunkten und bakterielle Toxizitätstests von Wachstumskurve und Keimzahl

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Hochdurchsatz-Screenings der antibakteriellen Wirkungen von Nanopartikeln mit oder ohne Konjugation an Antibiotika durchzuführen. Hierzu werden die antibakteriellen Wirkungen von Poly-Mix und B, konjugierten Cadmiumtellurid-Quantenpunkten, getestet. Die Quantenpunkte werden zunächst in Mercaptopropionsäure gelöst.

Anschließend werden die Quantenpunkte mit Poly-Mix und B konjugiert; antibiotikabehandelte Bakterien werden dann sowohl mit konjugierten als auch nicht konjugierten Quantenpunkten behandelt, und die Hälfte der Proben wird 30 Minuten lang einer Bestrahlung mit blauem Licht von 440 Nanometer unterzogen, wodurch die Quantenpunkte Exzitonen und reaktive Sauerstoffspezies erzeugen, um den Effekt der Quantenpunkt-Behandlung auf das bakterielle Wachstum und die Überlebensfähigkeit zu bewerten. Es werden Messungen der optischen Dichte vorgenommen und Koloniezahlen bestimmt. Die resultierenden Daten zeigen, dass die Anwendung von antibiotikakonjugierten Cadmium-Tellurid-Quantenpunkten, gefolgt von Bestrahlung, die stärksten abtötenden Wirkungen unter allen getesteten Bedingungen hervorruft.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Wirkung von Cadmiumtellurid-Quantenpunkten und deren Konjugation an Polyx in B auf das Wachstum von E. coli ermöglicht, kann sie auch auf andere Arten von Nanopartikeln und Antibiotika bei verschiedenen Bakterienstämmen angewendet werden. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da ein Überschuss an MPA dazu führt, dass sich die Quantenpunkte aggregieren, und wenn sie auch nur eine geringe Menge an Toluin abpipettieren, zerstören sie den Filter.

Obwohl wir heute eine Methode zur Beurteilung der antibakteriellen Wirkung von antibiotisch konjugierten KE IDE-Quantenpunkten demonstrieren werden, könnte eine ähnliche Methode auch mit anderen Arten von Quantenpunkten wie Indiumphosphat, Zinksulfat und Cadmiumid-Zinksulfat angewendet werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie eine Lösung von Cadmiumtellurid- oder CdTe-Quantenpunkten in Toluol mit einer Konzentration von 15 µM in einem Glasfläschchen herstellen. Bestimmen Sie die optische Dichte (OD) mittels Absorptionsspektroskopie, indem Sie mit einer Pipette 200 µL dieser Stammlösung in ein Glasfläschchen überführen.

Verwenden Sie kein Plastik. Geben Sie dann 800 µL Toluol, 1 mL 200 mmolaren Boratpuffer und 2 µL 11,5-molares MER-Capto-propionsäure oder MPA zu, verschließen Sie das Gefäß und schütteln Sie es kräftig für 30 bis 60 Sekunden. Nach dem Schütteln trennen sich die wässrige und die organische Lösungsmittelphase spontan voneinander.

Die wässrige Phase nimmt die Farbe der Quantenpunkte an. Um die Tiling-Schicht zu vermeiden, entfernen Sie diese, danach die Phase mit den Quantenpunkten, und überführen Sie sie in ein sauberes Gefäß. Zum Reinigen der solubilisierten Quantenpunkte überführen Sie diese in einen Zentrifugenfilter mit 500 Mikroliter Kapazität.

Fügen Sie 100 Mikroliter 50 Millimolar Bore-Acht-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 3000 × g für 13 Minuten. Führen Sie diese Waschung viermal durch; nach der letzten Waschung suspendieren Sie die gewaschenen Quantenpunkte in 500 Mikrolitern Bore-Puffer und lagern Sie bei vier Grad Celsius.

Sie sind eine bis zwei Wochen stabil. Um die Konzentration der Quantenpunkte abzuschätzen, messen Sie die Absorptions- und Emissionsspektren. Diese Abbildung zeigt CdTe-Quantenpunkte unter UV-Lampenbestrahlung sowie Emissionsspektren vor und nach der Wasserlöslichmachung, wobei eine vernachlässigbare Änderung der optischen Eigenschaften durch den Ligandenaustausch sichtbar ist.

Dieser Teil des Protokolls ist anwendbar auf alle negativ geladenen, wässrigen, solarisierten Nanopartikel, einschließlich Moos, kommerzieller Quantenpunkte, Metallpartikel und weiterer. In diesem Beispiel wird das Antibiotikum Poly-Mixen B oder PMB im molaren Verhältnis von 30 zu 1 an die Quantenpunkte konjugiert. PMB ist positiv geladen und aggregiert spontan, ohne dass eine Konjugation erforderlich ist. Reagenzien: Lösen Sie PMB in Wasser.

Bei 60 Mikromolar. Für eine 96-Well-Platte mit 0,3 Milliliter Bakterien pro Well in vierfachen Duplikaten sind 0,5 Milliliter 200 Nanomolar-Konjugat ausreichend, um dies durch Zugabe von 100 Mikrolitern einmikromolarer Quantenpunkte in 50 Millimolar Bortuffer zu einem Mikrozentrifugenröhrchen vorzubereiten.

Fügen Sie anschließend 50 Mikroliter der 10×- oder 60-Mikromolar-PM-B-Antibiotikalösung in Wasser dem Konjugatgefäß hinzu. Geben Sie 50 Mikroliter Wasser in das Kontrollgefäß. Füllen Sie das Volumen mit 50 Millimolar ATE-Puffer auf 0,5 Milliliter auf, schützen Sie die Gefäße vor Licht mit Aluminiumfolie und stellen Sie sie eine Stunde lang auf einen Rotator.

Wenn eine Aggregation auftritt, wiederholen Sie die Konjugation mit niedrigeren Konzentrationen des Antibiotikums. Titrieren Sie die Konzentration schrittweise nach oben, bis die Partikel nicht mehr aggregieren, um die Konjugate zu waschen. Gießen Sie die Lösungen durch einen Filter mit einer Molekulargewichtsabscheidung von 10.000, der für die meisten Antibiotika geeignet ist, jedoch nicht für Proteine oder Antikörper.

Schätzen Sie abschließend die Anzahl der Antibiotikamoleküle pro Quantenzähleinheit mittels Absorptions- oder Fluoreszenzspektroskopie, Gelelektrophorese oder transformierter Infrarotspektroskopie. Diese Abbildung zeigt die typischen Absorptions- und Emissionsspektren der Quantenpunkte vor der Konjugation mit PMB sowie die Emission nach Zugabe von 160 molaren Äquivalenten PMB.

Der Zusammenhang zwischen dem Verhältnis von PMB und der durch die Quadrate angezeigten Emissionsintensität der Quantenpunkte sowie der durch die Dreiecke gekennzeichneten Peak-Wellenlängenposition wird hier dargestellt. Mit steigender PMB-Konzentration nimmt die Emissionsintensität der Quantenpunkte ab, was zu einer Verschiebung der Peak-Emissionswellenlänge führt. Der nächste Teil des Protokolls wird durchgeführt, um die halbe maximale Hemmkonzentration oder IC50 des Antibiotikums und der Quantentoxizität am Abend zwei Tage vor dem Konjugationsexperiment zu bestimmen.

Impfen Sie 10 Milliliter LB-Medium mit einer frischen Kolonie von e coli. Füllen Sie am nächsten Tag, eine bis zwei Stunden vor dem Experiment, jedes der Löcher einer klaren 96-Loch-Platte mit Wachstumsmedium. Die Assay-Platte sollte wie hier gezeigt angeordnet sein.

Die Proben sollten im Dreifachansatz ausgeplattet werden, ebenso die Antibiotikakonzentrationen. Der Konzentrationsbereich sollte ausreichend breit gewählt sein, um sowohl eine Konzentration einzuschließen, die die Bakterien kaum hemmt, als auch eine, die sie vollständig abtötet. Zudem sollten alle Brunnen, die Quantenpunkte in den für die Konjugat-Experimente verwendeten Konzentrationen enthalten, im Dreifachansatz angelegt werden. Unter Verwendung einer Mehrkanalpipette sollten die entsprechenden Brunnen mit ein bis 50 Mikroliter Bakterienkultur beimpft werden.

Die Konzentration hängt davon ab, wie schnell der jeweilige Stamm wächst, und muss entsprechend kalibriert werden. Um das Wachstum zu überwachen, stellen Sie die Platte in ein Plattenlesegerät und stellen es so ein, dass alle 10 Minuten über einen Zeitraum von zwei Stunden bei 600 Nanometern gemessen wird. Sobald die Zellen alle einen OD-Wert von 0,1 bis 0,15 erreicht haben, nehmen Sie die Platte aus dem Plattenlesegerät und beenden die Aufzeichnung.

Fügen Sie anschließend die PMB in Quantenpunkten den entsprechenden Vertiefungen hinzu und decken Sie die Hälfte der Platte in dreifacher Ausführung mit Aluminiumfolie ab. Stellen Sie dann die Platte unter eine benutzerdefinierte 440-Nanometer-Lampe, die aus 2,4-Milliwatt-LEDs besteht, und belichten Sie die Platte 30 Minuten lang. Nach der Lichtexposition geben Sie die Platte in das Plattenlesegerät und erfassen Sie alle 10 Minuten den OD 600 über einen Zeitraum von fünf bis zwölf Stunden, abhängig von der Wachstumsrate. Halten Sie die Temperatur nach Möglichkeit unter 32 Grad Celsius, um das Austrocknen der Kulturen mithilfe der Software zu vermeiden.

Tragen Sie die Wachstumskurven zu einem ausgewählten Zeitpunkt über der Log-Konzentration auf und ermitteln Sie die IC50 des Antibiotikums mithilfe der auf dem Bildschirm angezeigten Hill-Gleichung, wobei H der Hill-Koeffizient ist. Ymax ist der höchste Wachstumspunkt und Ymin ist ein Nullpunkt, der idealerweise ebenfalls auf einer Plateauphase liegt. Am Ende der Aufzeichnungszeit zeigen klare Mulden einen vollständigen Zelltod an, und entlang steigender Wirkstoffkonzentrationen sollte ein Gradient der Zelldichte sichtbar werden.

Die Bakterien sollten Wachstumskurven mit S-Form wie hier gezeigt aufweisen. Die Lage des maximalen Plateaus variiert stark von Stamm zu Stamm und hängt außerdem von der Temperatur ab. Ein bestimmter Zeitpunkt kann als repräsentativ gewählt werden, und die Werte können gegen den Logarithmus des Antibiotikums aufgetragen werden, um die IC 50 zur Beurteilung der Quantenpunkte zu erhalten.

Toxizität und Überleben in Abhängigkeit vom Logarithmus der Quantenpunkt-Konzentration können ebenfalls aufgetragen werden, allerdings ist eine signifikante bakterielle Abtötung durch Quantenpunkte allein bei den verwendeten Konzentrationen selten. Sobald die Toxizität der Quantenpunkte und Antibiotika allein bestimmt wurde, kann derselbe Protokollansatz zur Ermittlung der Toxizität des Antibiotikums angewendet werden. Konjugierte Quantenpunkte dargestellt.

Hier ist ein Beispiel-Layout für den Assay. Beachten Sie, dass die Konjugate in zunehmenden Konzentrationen in vierfacher Ausführung getestet werden; ein Kontrollstreifen nur mit Bakterien, ein Streifen nur mit Wirkstoff sowie Probenwells nur mit Quantenpunkten sollten ebenfalls enthalten sein. Die OD-600-Messwerte können anschließend zur Erstellung von Wachstumskurven verwendet werden, und die IC50-Werte können wie zuvor bestimmt werden.

Diese Abbildung zeigt ein Beispiel für Konjugate, die genauso toxisch sind wie das Antibiotikum allein, sowie ein Beispiel für Konjugate, die toxischer sind. Um die Anzahl an koloniebildenden Einheiten oder CFU für jede Bedingung zu bestimmen, wählen Sie ein oder mehrere Vertiefungen der behandelten 96-Loch-Platte aus, die zur Durchführung der Plattenzählung verwendet werden sollen. Führen Sie eine serielle Verdünnung jedes ausgewählten Bakterienproben mit Kochsalzlösung durch.

Pipettieren Sie hierfür 180 Mikroliter Kochsalzlösung in die entsprechenden Reihen. Übertragen Sie 20 Mikroliter der Bakterienlösung und verdünnen Sie diese mit 180 Mikroliter Kochsalzlösung. Wechseln Sie die Pipettenspitze, mischen Sie und übertragen Sie 20 Mikroliter der verdünnten Bakterienlösung zu 180 Mikroliter Kochsalzlösung.

Wiederholen Sie diesen Vorgang sechs Mal. Nehmen Sie danach jeweils 10 Mikroliter aus den letzten sechs Verdünnungen und pipettieren Sie sie als Tropfen auf eine rechteckige Auger-Platte. Auf einer rechteckigen Platte können 36 Tropfen aufgebracht werden.

Lassen Sie die Platte nach 15 Minuten Trocknungszeit auf dem Laborpult weitere 15 Minuten trocknen, anschließend inkubieren Sie die Platte 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie die Kolonien, um die koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zu bestimmen. Multiplizieren Sie die Anzahl der Kolonien mit dem Verdünnungsfaktor und dividieren Sie durch das ausplattierte Volumen, um den Einfluss der Behandlungen auf das bakterielle Wachstum zu ermitteln.

Die Zelldichte von E. coli wurde bei OD 600 gemessen. Dargestellt sind repräsentative bakterielle Wachstumskurven mit verschiedenen Wirkstoffkonzentrationen von null bis zum vollständigen Zelltod. Die offenen Symbole zeigen ausschließlich PMB in den angegebenen Konzentrationen.

Die ausgefüllten Symbole stellen C-D-T-E-P-M-B ohne Bestrahlung dar, die halbgefüllten Symbole stellen C-D-T-E-P-M-B mit Bestrahlung dar. Die Bestrahlung hatte keinen Einfluss auf die ausschließlich PMB enthaltenden Proben, daher wurden diese Kurven der Übersichtlichkeit halber weggelassen. Hier sind die Wachstumskurvenwerte nach 200 Minuten in Abhängigkeit vom log PMB dargestellt sowie Anpassungen an diese Gleichung, um IC50-Werte zu bestimmen, um die Effekte des Lichts zu kontrollieren.

Mit Antibiotikum wird eine Kurve nur bei 30 Minuten Lichtexposition erstellt. Diese Abbildung zeigt das bakterielle Überleben nach 200 Minuten in Abhängigkeit von der QD-Konzentration unter Verwendung von CDTE-QDs. Bei Lichtexposition ist eine geringe Toxizität erkennbar, jedoch zu gering, um einen IC50-Wert bestimmen zu können.

Dies zeigt, dass die Toxizität von CDTE allein bei den in der Konjugationsversuch verwendeten Konzentrationen vernachlässigbar ist. Zum Vergleich der Effekte verschiedener Behandlungen auf das Zellwachstum wurden Wachstumskurvenwerte nach 200 Minuten aufgetragen und an die weiter oben gezeigte Gleichung angepasst. C-D-T-E-P-M-B-Konjugate waren toxischer als PMB allein. Im Vergleich dazu zeigen goldene Nanopartikel-A-U-P-M-B-Konjugate keine erhöhte Toxizität gegenüber PMB allein, um den Effekt der Behandlungen auf das bakterielle Überleben zu bestimmen.

Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten wurde für E. coli bestimmt, die in einer 96-Well-Platte kultiviert wurden, die mit P-M-B-Q-D-P-M-B oder allein mit QD behandelt und mit oder ohne I-Bestrahlung für 30 Minuten exponiert wurde, gefolgt von einer Inkubation bei 32 Grad Celsius für vier Stunden. Serielle Verdünnungen jeder Bakterienprobe wurden mit Kochsalzlösung hergestellt, und 10 Mikroliter der 100× bis 10⁷× Lösungen wurden auf Agarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden bei 37 Grad Celsius inkubiert, und die Kolonien wurden nach 16 Stunden gezählt.

In diesem Beispiel enthalten die Plattenkolonnen A bis C Bakterien, die mit ansteigenden Konzentrationen von CDTE behandelt wurden. Konjugate ohne Bestrahlung sowie die Kolonnen D bis F enthalten Bakterien, die mit ansteigenden Konzentrationen von Konjugaten behandelt wurden. Zusammen mit einer 30-minütigen Bestrahlung sind die Verdünnungen entlang der Reihen dargestellt.

Die Daten zeigen, dass die Konjugate bei Bestrahlung eine stärkere Hemmung des bakteriellen Wachstums aufweisen als die Konjugate ohne Bestrahlung. Vergessen Sie nicht, dass die Reagenzien äußerst toxisch sind und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen von Handschuhen, Laborkitteln und Schutzbrillen stets zu beachten sind, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Hochdurchsatz-Screening der antibakteriellen Wirkung von Nanopartikeln mit oder ohne Konjugation an Antibiotika durchführt.