Name: Solubilisierung und Bio-Konjugation von Quantenpunkten und bakterielle Toxizitätstests von Wachstumskurve und Keimzahl (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Solubilisierung und Bio-Konjugation von CdTe-Quantenpunkten mit Antibiotika zur Untersuchung antibakterieller Effekte. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screening und Lichtaktivierung für verbesserte bakterielle Toxizitätstests.

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Diese Arbeit wurde vom NSERC Individuelle Discovery-Programms, dem NSERC / CIHR Collaborative Health Research Program (CHRP) und dem kanadischen NSERC CREATE Astrobiologie Training Program (CAPT) gefördert.

1. QD Solubilisierung Dies ist eine geeignete Methode für CdTe. Ähnliche Verfahren können mit anderen Arten von QD wie InP / ZnS 20 und CdSe / ZnS 21 verwendet werden. <ol><li> Eine Lösung aus CdTe-QDs in Toluol bei 15 uM (optische Dichte = 2,5 bei der ersten Excitonenpeak). </li><li> Übertragen Sie 200 ul dieser Aktie in einen Glaskolben. Verwenden Sie kein Plastik! </li><li> Fügen Sie 800 ul Toluol, 1 ml 200 mM Boratpuffer (pH 9) und 2 ul 11,5 M Mercaptopropionsäure (MPA). </li><li> Verschließe das Röhrchen und schütteln Sie sie kräftig für 30-60 Sekunden. </li><li> Die wässrigen und organischen Phasen-Lösungsmittel spontan trennen. Die wässrige Phase wird die Farbe der QDs geworden. Um die Toluol-Schicht zu vermeiden, entfernen Sie sie und entsorgen Sie sie. Übertragen Sie anschließend die wässrige Phase in ein sauberes Gefäß. </li><li> Reinigung der solubilisierten QDs durch Waschen / Filterung viermal mit 500 ul, 10000 Molekulargewichtsschnitt Zentrifuge Filter. Die Filter solltenversponnen bei 3000 × g für 13 Minuten. Für mindestens die letzten zwei Wäschen, mit dem gewünschten End-Puffer waschen. </li><li> Nach dem letzten Waschen, suspendieren die gewaschenen QDs in 50 mM Boratpuffer bei dem gewünschten pH-Wert und lagern bei 4 ° C. Sie werden für 1-2 Wochen stabil. </li><li> Wird die Extinktion und Emissionsspektren, um die Konzentration auf den veröffentlichten Formeln 22 schätzen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1 zeigt ein Bild von CdTe-QDs unter UV-Lampe Beleuchtung, und Emissionsspektren vor und nach Wasser Solubilisierung, zeigt vernachlässigbare Veränderung von der Kappe Austausch. Die Größe Werte der Kerndurchmesser gemessen durch Elektronenmikroskopie. 2. QD Konjugation an Antibiotika Dieser Teil des Protokolls ist anwendbar auf alle negativ geladene Wasser gelösten Nanopartikel, darunter die meisten kommerziellen QDs, Metallpartikel, 19 und mehr. <ol><li> Jedes Molekül wird funktionieren, dass either selbst montiert, um den negativ geladenen solubilisiert QD, oder das eine reaktive Gruppe, die konjugiert werden können, wie ein primäres Amin. In diesem Beispiel verwenden wir Polymyxin B (PMB), das positiv geladen ist und selbst montiert, ohne dass eine Konjugation Reagenzien. Lösen Sie die PMB in H 2 O bei 60 um. (Wenn das Antibiotikum ausgewählt ist nicht löslich in H 2 O, in DMSO oder Ethanol gelöst in einer Konzentration von 0,1-1 mM). Dies wird eine 10-Lösung (in H 2 O) oder eine 100-Lösung (in Lösungsmittel) sein. </li><li> Berechnen Sie, wie viel QD-Lösung werden Sie für die Bakterientoxizität Experimente benötigen. Für eine Platte mit 96 Vertiefungen mit 0,3 ml pro Vertiefung in quadruplicates werden 0,5 ml von 200 nM Konjugat benötigt. Bereiten Sie zwei Röhrchen mit 100 ul 1 uM Quantenpunkte in 50 mM Boratpuffer. </li><li> Wenn Kopplung mit einem primären Amin, Herstellung einer 19 mg / ml (100 mM) Lösung von 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-hydrochlorid (EDC) in H 2 O. EDC in Lösung nicht stabil ist; Sie diese sofort und den Rest wegwerfen. </li><li> In 50 ul der 10x Antibiotika-Lösung (in H 2 O) oder 5 ul der 100x-Lösung (in Lösungsmittel) zu dem Konjugat Rohr. Für PMB: CdTe-Konjugation bei molaren Verhältnis von 30:1, fügen Sie 50 ul 60 uM PMB. In H 2 O oder Lösungsmittel zu der QD nur Steuerrohr. </li><li> Wenn nötig, fügen Sie 1 ul der EDC-Stammlösung zu dem Konjugat Rohr. </li><li> Öffne das Konjugat Volumen von 0,5 mL mit dem geeigneten Puffer (Borat oder PBS, keine Amin-enthaltenden Puffer wie Tris, da sie EDC inhibieren). </li><li> Schild Rohre von Licht mit Aluminiumfolie, und auf ein Kolbenpendel oder Wippe für 1 Stunde. Wenn Aggregation auftritt, wiederholen Sie die Konjugation mit niedrigeren Konzentrationen von Antibiotika. Daraufhin wird die Konzentration nach oben, bis die Partikel nicht aggregieren. </li><li> Waschen Sie die Konjugate, indem sie durch einen entsprechenden Filter. 10.000 Molekulargewicht Cutoff ist für die meisten Antibiotika, aber nicht für Proteine ​​oder Antikörper. </li&gt; <li> Je nach dem Molekül, können verschiedene Methoden verwendet, um die Zahl der Antibiotika-Moleküle pro QD schätzen werden: Absorption oder Fluoreszenz-Spektroskopie, Gelelektrophorese oder Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR). </li></ol> Repräsentative Ergebnisse. In diesem Beispiel wird PMB Konjugation durch Veränderungen in QD-Emission-Spektrum charakterisiert. Abbildung 2 zeigt die Spektren von CdTe-QDs mit PMB hinaus. 3. Vorbereitung der Bakterien für 96-Well-Screen; Bestimmung von Antibiotika-IC 50 Dies ist auf fast jedes Bakterienstamm in einem geeigneten Medium gezüchtet 18. Die genaue Länge der Zeit die Aufnahmen sollten weiterhin abhängig von der bakteriellen Wachstumsrate. In unserem Beispiel verwenden wir Escherichia coli in Lysogenie Brühe (LB)-Medium. <ol><li> Um die entsprechenden QD-Konjugat-Konzentrationen zu wählen, ist es wichtig, das wissenIC 50 des Antibiotikums zu konjugiert werden und wenn die QDs allein toxisch sind. Dies sollte 2 Tage vor der Konjugation Experiment begonnen werden. Am Abend, mit Samen 10 ml Bakterienwachstum Medium aus einer frischen Kolonie, richtig steril und Biosicherheit Technik. </li><li> Am nächsten Tag, 1-2 Stunden vor dem Experiment, füllen jede der Mulden einer klaren mit 96-Loch-Platte mit einer nahezu maximale Menge an Wachstumsmedium. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Saatgut jedes Well mit 1-50 ul der Bakterienkultur (der Zusammenschluss auf, wie schnell die besondere Belastung wächst hängen und müssen von Ihrem Labor kalibriert werden). </li><li> Legen Sie die Platte auf die Platte Leser und stellen Sie es auf alle 10 Minuten für 2 Stunden bei einer bestimmten Wellenlänge (meist 600 nm) zu lesen. Überwachen Sie den Teller so, dass die Bakterien nicht wachsen zu dicht, zu schnell. </li><li> Wenn die Zellen alle erreichen OD = 0,1 bis 0,15, entfernen Sie die Platte aus der Platten-Lesegerät und stoppen Sie die Aufnahme. </li><li> Fügen Medikament allein und allein an QDsunterschiedlichen Konzentrationen in mindestens dreifacher Ausführung. Verwenden Sie eine Seite der Platte als &quot;dunkel&quot;-Steuerung und eine Hälfte beleuchtet werden. Eine vorgeschlagene Layout ist in Abbildung 3 angegeben. Die Konzentrationen sollten umfassen einen weiten Bereich genug, um eine Konzentration, die die Bakterien hemmt sehr wenig, und eine, die sie alle tötet gehören. </li><li> Schirmen Sie das &quot;dunkle&quot; Seite der Platte mit Aluminiumfolie. Freilegen der anderen Seite mit einer Lampe bei der gewünschten Wellenlänge. Wir verwenden ein benutzerdefiniertes 96-well, 440-nm-Lampe von 2,4 mW-LEDs (Abbildung 4) und bestrahlen für 30-60 min gemacht. Die schwarzen Platten mit transparentem Boden helfen, schützen die unbelichteten Bakterien von Streulicht. Eine leere Spalte kann auch zwischen den exponierten und nicht-exponierten Seiten verwendet werden. </li><li> Nach Belichtung, stellte den Teller in die Platte und Leser Rekord OD 600 alle 10 Minuten für 5-12 Stunden je nach Wachstumsrate. Halten Sie die Temperatur &lt;32 °. C, wenn möglich zu vermeiden, Trocknen der Kulturen </li><li> Zeichnen Sie die Wachstumskurvenbei einer ausgewählten Zeitpunkt gegen log [Konzentration] und bestimmen den IC 50 des Antibiotikums mit der Hill-Gleichung: </li></ol><img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> wobei H der Hill-Koeffizient ist, y max der höchste Punkt des Wachstums (im Idealfall auf einem Plateau) und y min ist der Nullpunkt, auch ideal auf einem Plateau. Es ist unwahrscheinlich, dass QD allein wesentlich Toxizität für die Zellen bei den verwendeten Konzentrationen zeigen, so dass ein Wert nicht bestimmt werden. Repräsentative Ergebnisse. Am Ende der Aufnahmezeit wird klar Vertiefungen zeigen vollständige Zelltod, und einen Gradienten von Zelldichte sollte entlang steigenden Konzentrationen des Arzneimittels zu sehen. Die Bakterien sollten für S-förmigen Wachstumskurven (5 A), die Lage des Maximums Plateau wird sehr von Stamm zu Stamm und hängt auch von der Temperatur ab. Ein gegebenen Zeitpunkt kanngewählt als Vertreter und die Werte aufgetragen gegen log [Antibiotikum], um dem IC 50 (Abbildung 5 B). Um QD Toxizität zu bewerten, Überleben vs Log [QD] kann auch aufgetragen werden, aber Erzielung erheblicher Abtöten der Bakterien mit QDs allein ist selten (Abbildung 5 C). 4. Vorbereitung der Bakterien für 96-Well-Screen mit Antibiotika / QDs <ol><li> Der Tag vor dem Experiment, Samen 10 ml Kultur aus einer frischen Kolonie in das entsprechende reichen Medium, mit richtig steril und Biosicherheit Technik. Die QD-Antibiotikum-Konjugat sollte an diesem Tag zubereitet werden, es sei denn, es ist sehr instabil. </li><li> 1-2 Stunden vor dem Experiment füllen jede der Mulden einer klaren mit 96-Loch-Platte mit einer nahezu maximale Menge an Wachstumsmedium. Mit einer Mehrkanal-Pipette, Saatgut jedes Well mit 1-50 ul der Bakterienkultur. </li><li> Legen Sie die Platte auf die Platte Leser und stellen Sie es auf alle 10 Minuten für 2 Stunden bei der gleichen Wellenlänge wie in Teil 3 zu lesen.</li><li> Wenn die Zellen alle erreichen OD = 0,1 bis 0,15, entfernen Sie die Platte aus der Platten-Lesegerät und stoppen Sie die Aufnahme. </li><li> Fügen Sie QD-Konjugate in unterschiedlichen Konzentrationen in mindestens vierfacher Ausfertigung. Verwenden Sie eine Seite der Platte als &quot;dunkel&quot;-Steuerung und eine Hälfte beleuchtet werden. Eine vorgeschlagene Layout ist in Abbildung 6 zu entnehmen. A-Bakterien nur Kontrollstreifen immer sollte bei Problemen mit dem Kultur-, Temperatur aufgenommen werden, beeinflussen usw. Wachstumsbedingungen. Ein einziger Streifen von Medikamenten und nur QD nur sollten ebenfalls einbezogen, um sicherzustellen, dass sie die Kontrolle Platte gemacht vorher angepasst werden. Der Rest der Brunnen befinden, um Konjugate gewidmet, um für gute Statistiken zu ermöglichen. </li><li> Schirmen Sie das &quot;dunkle&quot; Seite der Platte mit Aluminiumfolie. Freilegen der anderen Seite mit einer Lampe bei der gewünschten Wellenlänge. </li><li> Nach Belichtung, stellte den Teller in die Platte und Leser Rekord OD 600 alle 10 Minuten für 5-12 Stunden. Halten Sie die Temperatur &lt;32 ° C, wenn möglich, vermeiden drYing der Kulturen. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse. Die Kombination von Quantenpunkten und Antibiotikum möglicherweise weniger toxisch als Antibiotikum allein, gleich toxisch; oder mehr giftig. Dies kann quantifiziert werden mit Hilfe der Wachstumskurven und IC 50 Messungen werden. Abbildung 7 zeigt ein Beispiel, dass Konjugate gleich toxisch als Antibiotikum allein, und ein Beispiel für Konjugate, die giftiger sind. 5. Keimzahl <ol><li> Wählen Sie eine oder mehrere Vertiefungen der behandelten 96-Well Platte, für serielle Verdünnungen und das Auszählen von Kolonien verwendet werden. </li><li> Einen seriellen Verdünnung von jedem der ausgewählten bakteriellen Proben mit PBS oder Salzlösung (0,9% NaCl). Übertragen Sie 20 ul der bakteriellen Lösung und verdünnen Sie es mit 180 ul Kochsalzlösung, ändern Sie die Pipettenspitze, Mischen und Übertragen 20 uL der verdünnten Lösung, um bakterielle 180 ul Kochsalzlösung. Wiederholen Sie die 6-fache. </li><li> Nehmen Sie sich 10 ul von jeder Verdünnung und Teller auf einem geeigneten<html> festen Medien Platte. Alle 8-Konzentrationen einer Probe kann auf einem 10 cm runden Petrischale ausgestrichen werden, obwohl rechteckige Gerichte bevorzugt werden, da es einfacher ist, Dinge antreten. </li><li> Lassen Sie es auf der Bank für 15 Minuten trocknen lassen. dann bei entsprechender Temperatur für Ihre Bakterien inkubieren für 16 Stunden. </li><li> Anzahl Kolonien und Berechnung koloniebildenden Einheiten (CFU) nach Anspruch (# von Kolonien x Verdünnungsfaktor) / Volumen plattierten = CFU / ml. </li></ol> Abbildung 8 zeigt ein Beispiel CFU Platte. 6. Repräsentative Ergebnisse <img alt="1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> Abbildung 1. CdTe-QDs. (A) acht Zubereitungen von CdTe-QDs die Beleuchtung mit einer UV-Stab (365 nm). (B) Absorptions-und Emissionsspektren von fünf ausgewählten Größen vor und nach der Wasser-Solubilisierung. Die gestrichelten Linien sind Spektren in Toluol, die durchgezogenen Linien in Wasser. files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; Abbildung 2. Spectral-und Gel-Analyse der QD-PMB-Konjugate. Orange-emittierende CdTe-QDs wurden für dieses Beispiel verwendet, die Auswirkungen auf andere Arten von QDs müssen für jedes Experiment ausgewertet werden. (A) Typische Absorption (graue Linie) und Emissionsspektren (schwarze Linie) der QDs vor der Konjugation von PMB und der Emission (gestrichelte Linie) nach der Zugabe von 160 Moläquivalenten PMB. (B) Beziehung zwischen dem Verhältnis von PMB und dem QD Emissionsintensität (Quadrate) und Peakwellenlänge Lage (Dreiecke). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> Abbildung 3. Empfohlene Platte Layout für die Steuerung Wachstumsfuge. Eine Vielzahl von PMB und QD-Konzentrationen dargestellt. Die eine Hälfte der Platte wird bestrahlt (blau hervorgehoben), und eine identische Hälfte wird vor Licht geschützt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier</a>für eine größere Abbildung zu sehen. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> Abbildung 4. Benutzerdefinierte 96-LED-Lampe für eine gleichmäßige Bestrahlung Platte, welche Erscheinung aus-und einschalten. Eine typische Hand-UV-Lampe kann auch verwendet werden, jedoch wird nicht die gesamte Platte gleichmäßig. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiel für Kontrolle Wachstumsfuge. (A) Repräsentative Bakterienwachstum Kurven mit unterschiedlichen Wirkstoffkonzentrationen, von 0 abzuschließen Zelltod. Die offenen Symbole sind nur mit PMB Konzentrationen gegeben, die festen Symbole sind CdTe-PMB ohne Bestrahlung, und die halb gefüllte Symbole sind CdTe-PMB mit Bestrahlung. Die Bestrahlung hatte keinen Einfluss auf den PMB nur Muster, so dass diese Kurven aus Gründen der Klarheit weggelassen wurden. Alle PMB-CdTe-Konjugate sind 30:1 PMB: QD-Verhältnisse. (B) Plots der Wachstumskurve Werte bei 200 min vs Log [PMB] und passt zu Gl. (1). Um control für die Wirkung des Lichts wird eine Kurve mit Antibiotika nur 30 min mit der Belichtung erfolgen. (C) die Überlebensrate der Bakterien bei 200 min vs QD-Konzentration, mit CdTe-QDs. Einige Toxizität ist mit der Belichtung, aber zu wenig, um einen IC 50-Wert bestimmen zu sehen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> Abbildung 6. Vorgeschlagene Layout für Konjugat Testplatte. Die blau-markierten Hälfte der Platte sollte sie dem Licht ausgesetzt werden, und der nicht hervorgehobenen Hälfte wird geschützt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> Abbildung 7. Beispiel für konjugierte Testplatte. Wachstumskurve Werte bei 200 min waren plotted und fit zu Gl. (1). (A) CdTe-PMB-Konjugate Toxizität über PMB allein erhöht. (B) Gold-Nanopartikel-Au-PMB-Konjugate zeigen keine erhöhte Toxizität über PMB allein. <img alt="8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> Abbildung 8. Beispiel einer CFU Platte. E. coli in einer 96-Well-Platte ausgesät wurde mit QD-PMB mit oder ohne Bestrahlung für 30 min behandelt. dann bei 32 ° C für 4 Stunden inkubiert. Serielle Verdünnungen von jeder bakteriellen Probe wurden mit Kochsalzlösung und 10 ul 100 X 10 7 X Verdünnungen wurden auf Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden inkubiert bei 37 ° C und Kolonien nach 16 Stunden gezählt. Die Platte zeigt, die Verdünnungen entlang der Reihen wie angegeben, die Säulen sind: (A) 0,06 uM PMB + 2 nM CdTe, (B) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe (C) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe, (D) 0,06 um PMB + 2 nM CdTe bestrahlt, (E) 0,12 uM PMB + 4 nM CdTe bestrahlt, (F) 0,2 uM PMB + 6,7 nM CdTe Bestrahlungsbestrahlte.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Nanopartikel bieten einen vielversprechenden Ansatz zur Schaffung neuer antimikrobieller Mittel. Wachstumskurvenanalyse ist ein Weg, der bakteriellen Zelldichte, die aktiv wachsenden Zellen von Wachstum gehemmt Zellen zeichnet überwachen. Wenn mit Platte gekoppelt zählt, ermöglicht es einer gründlichen Analyse des Antibiotikums Potenzial eines Konjugats. Der 96-Well-Format erlaubt relativ hohem Durchsatz Variationen der Konzentration und anderer Bedingungen, wie Belichtung, die letztere ist entscheidend für Licht aktivi...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare (optional) </td></tr><tr><td> Boratpuffer Component # 1 </td><td> Fischer </td><td> Borsäure A-74-1 </td><td></td></tr><tr><td> Boratpuffer Component # 2 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Natriumtetraborat B9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9322 </td><td> Verschiedene MWCO verfügbar </td></tr><tr><td> Glasfläschchen </td><td> Fischer </td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td> Polymyxin B </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td> Bakterielle growth Medium (LB)-Komponente Nr. 1 </td><td> Fischer </td><td> NaCl-S271 </td><td></td></tr><tr><td> Bakterienwachstum Medium (LB)-Komponente # 2 </td><td> BD </td><td> Trypton 211705 </td><td></td></tr><tr><td> Bakterienwachstum Medium (LB)-Komponente # 3 </td><td> BD </td><td> Hefeextrakt 211929 </td><td></td></tr><tr><td> Lampe für Belichtung </td><td> Brauch </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clear-bottom 96-Well Platten </td><td> Fischer </td><td> 07-200-567 oder 07-200-730 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoreszenz-Spektrometer </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Die Absorption Plattenlesegerät </td><td> Molecular Devices </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bactoagar für feste Medien </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen runden </td><td> Fischer </td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen rechteckigen </td><td> Fischer </td><td> 08 bis 757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilisierung und bio-konjugation von quantenpunkten und bakterielle toxizitätstests von wachstumskurve und keimzahl

Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

Quantenpunkte (QP) sind fluoreszierende Halbleiter-Nanopartikel mit größenabhängigen Emissionsspektren, die durch eine breite Auswahl an Wellenlängen angeregt werden kann. Quantenpunkte haben ein großes Interesse für die Bildgebung, Diagnostik, Therapie und dank ihres hellen, stabile Fluoreszenz 1,2 3,4,5 angezogen. QD konjugiert werden kann, um eine Vielzahl von bioaktiven Molekülen zur Bindung an Bakterien und Säugerzellen 6. QDs werden auch allgemein als Zytostatika für die gezielte Tötung von Bakterien untersucht. Die Entstehung der mehrfach resistente Bakterienstämme sich schnell zu einer Krise des öffentlichen Gesundheitswesens, insbesondere im Fall von Gram-negative Erreger 7. Wegen der bekannten antimikrobiellen Wirkung bestimmter Nanomaterialien, insbesondere Ag, gibt es Hunderte von Studien, welche die Toxizität von Nanopartikeln zu 8 Bakterien. Bakterielle Studien mit anderen Typen von Halbleiter-Nanopartikeln sowie, durchgeführt Especbeugende Wartung TiO2 9,10-11, sondern auch ZnO-12 und andere, einschließlich CuO 13. Einige Vergleiche von Bakterienstämmen wurden in diesen Studien durchgeführt, üblicherweise Vergleichen eines Gram-negativen Stamm mit einem Gram-positiven. Entweder die Photoerzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) von den Partikeln oder die direkte Freisetzung von Metallionen, die oxidative Toxizität verursachen können: Mit all diesen Teilchen werden Mechanismen der Toxizität gegenüber Oxidation zugeschrieben. Selbst mit diesen Materialien gibt es unterschiedliche Ergebnisse verschiedener Studien erheblich. In einigen Studien die Gram-positive Test-Stamm ist dem Vernehmen empfindlicher als der Gram-negativen 10, in anderen ist es umgekehrt 14. Diese Studien wurden gut 15 bewertet. In allen Studien Nanopartikel können Partikel Zusammensetzung, Größe, Oberflächenchemie, Probe Alterung / Abbau und Wellenlänge, Leistung und Dauer der Lichteinwirkung alle dramatischen Einfluss auf die Ergebnisse. Darüber hinaus SYNTHESIs Nebenprodukte und Lösungsmittel müssen 16 17 berücksichtigt werden. High-Throughput-Screening-Techniken nötig sind, um in der Lage sein, neue wirksame Nanomedizin Mittel zu entwickeln. CdTe-QDs haben antimikrobielle Wirkungen allein 18 oder in Kombination mit Antibiotika. In einer vorangegangenen Studie konnten wir zeigen, dass die Kopplung von Antibiotika kann zu CdTe Toxizität gegenüber Bakterien zu erhöhen, sondern verringern die Toxizität für Säugerzellen, aufgrund der verringerten Produktion von reaktiven Sauerstoff-Spezies aus den Konjugaten 19. Obwohl es unwahrscheinlich, dass Cadmium-Verbindungen zur Verwendung bei Menschen zugelassen werden wird, könnte eine solche Zubereitungen zur Desinfektion von Oberflächen oder Sterilisieren von Wasser verwendet werden. In diesem Protokoll, geben wir einen einfachen Ansatz zur Solubilisierung CdTe-QDs mit Mercaptopropionsäure (MPA). Die Quantenpunkte sind bereit, innerhalb einer Stunde zu nutzen. Wir haben dann zu demonstrieren eines antimikrobiellen Mittels Kopplung. Der zweite Teil des Protokollsdemonstriert eine 96-Well-bakteriellen Hemmtest mit den konjugierten und unkonjugierten QDs. Die optische Dichte wird über viele Stunden zu lesen, es gestatten, die Wirkungen der Zugabe und QD Belichtung sofort als auch nach einer Erholungszeit ausgewertet. Wir zeigen auch eine Zählung der Kolonien für die Quantifizierung von Bakterien das Überleben.

Nanopartikel wie Halbleiter-Quantenpunkten (QP) verwendet werden, um photoaktivierbare Agenten für anti-mikrobiellen oder Anti-Krebs-Anwendungen zu erstellen. Diese Technik zeigt, wie Wasser-löslich zu Cadmium-Tellurid (CdTe) QDs, konjugieren sie gegen ein Antibiotikum, und führen Sie einen bakteriellen Hemmtest auf Wachstumskurven und die Keimzahl basiert.

Solubilisierung und Bio-Konjugation von Quantenpunkten und bakterielle Toxizitätstests von Wachstumskurve und Keimzahl

Quantenpunkte (QDs) sind fluoreszierende Halbleiter-Nanopartikel mit größenabhängigen Emissionsspektren, die durch eine breite Auswahl an Wellenlängen angeregt werden können. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Hochdurchsatz-Screening der antibakteriellen Wirkungen von Nanopartikeln mit oder ohne Konjugation an Antibiotika durchzuführen. Hierzu werden die antibakteriellen Wirkungen von Poly-Mix und B, konjugierten Cadmiumtellurid-Quantenpunkten, untersucht. Die Quantenpunkte werden zunächst in Mercaptopropionsäure gelöst. Anschließend werden die Quantenpunkte mit Poly-Mix und B konjugiert; antibiotikabehandelte Bakterien werden dann sowohl mit konjugierten als auch unkonjugierten Quantenpunkten behandelt, und die Hälfte der Proben wird 30 Minuten lang einer Bestrahlung mit blauem Licht von 440 Nanometer unterzogen, wodurch die Quantenpunkte Exzitonen und reaktive Sauerstoffspezies erzeugen, um den Effekt der Quantenpunkt-Behandlung auf das bakterielle Wachstum und die Überlebensfähigkeit zu bewerten. Es werden Messungen der optischen Dichte vorgenommen und Koloniezahlen bestimmt. Die resultierenden Daten zeigen, dass die Anwendung von antibiotikakonjugierten Cadmium-Tellurid-Quantenpunkten, gefolgt von Bestrahlung, die stärksten abtötenden Effekte unter allen getesteten Bedingungen hervorruft.Obwohl diese Methode Einblicke in di

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Dieses Video demonstriert den quantitativen Multiplex-Bakteriennachweis mit carboxylierten magnetischen Polystyrol-Mikrosphären, die in unterschiedliche Sätze eingefärbt sind. Das Verfahren umfasst die Bildung von Kügelchen-Bakterien-Komplexen, die magnetische Trennung und die flussbasierte Analyse, die eine präzise und gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Bakterien in derselben Reaktionsvertiefung ermöglicht.

Quantitativer Multiplex-Bakteriennachweis mit Farbstoff-markierten magnetischen Mikrosphären

Es wird ein Protokoll für die gleichzeitige Quantifizierung und den Vergleich von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen vorgestellt. Die Methodik umfasst den Einsatz von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, Biofilm-Strukturanalyse- und Visualisierungssoftware sowie statistischer Analysesoftware.

Gleichzeitige Quantifizierung zellulärer und extrazellulärer Bestandteile von Biofilmen

Bakterien können sich während ihres Lebens entweder schädliche oder vorteilhafte Mutationen ansammeln. In einer Population von Zellen können Individuen, die vorteilhafte Mutationen angesammelt haben, ihre Mitmenschen schnell übertreffen. Hier stellen wir ein einfaches Verfahren zur Visualisierung der intraspezies-Konkurrenz in einer bakteriellen Zellpopulation im Laufe der Zeit mit fluoreszierend markierten Individuen vor.

Überwachung des Intraspezies-Wettbewerbs in einer bakteriellen Zellpopulation durch Kokultivierung fluoreszierender Stämme

Wir stellen detaillierte Anweisungen für die Herstellung von monovalenten zielgerichteten Quantenpunkten (mQDs) aus Phosphorthioat-DNA definierter Länge zur Verfügung. Die DNA-Umhüllung erfolgt bei hoher Ausbeute, so dass die Produkte nicht gereinigt werden müssen. Wir demonstrieren die Verwendung des SNAP-Tags, um mQDs für Anwendungen zur Bildgebung lebender Zellen an Rezeptoren auf der Zelloberfläche zu richten.

Produktion und Targeting von Monovalenter Quantenpunkte

Biofilminfektionen zeigen eine hohe Toleranz gegenüber Chemotherapien. Kein einzelner Assay erfasst die Komplexität von Biofilmen. Stattdessen werden komplementäre Assays benötigt. Wir präsentieren eine Screening-Plattform (entwickelt für S. aureus), die Assays für Viabilität, Biomasse und Biofilmmatrix kombiniert. Es ermöglicht die Entdeckung von Anti-Biofilm-Medikamenten, einschließlich der Bewertung langfristiger chemotherapeutischer Wirkungen.

Eine Plattform von Assays Anti-Biofilm auf die Erforschung der natürlichen Substanzbibliotheken Geeignet

Es wurde ein Echtzeit-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um gleichzeitig (1) eukaryotische zellpenetrierende antimikrobielle Wirkstoffe zu identifizieren, die auf einen intrazellulären bakteriellen Krankheitserreger abzielen, und (2) die Zytotoxizität eukaryotischer Zellen zu bewerten. Eine Variation der gleichen Technologie wurde anschließend mit digitaler Dosiertechnologie kombiniert, um einfache, hochauflösende Dosis-Wirkungs-Studien sowie zwei- und dreidimensionale Synergiestudien zu...

Hoher Durchsatz, Echtzeit, Doppel-Ausleseprüfung intrazellulärer antimikrobieller Aktivität und eukaryotischen Zelle Zytotoxizität

Eine einfache Messung der ATP Assay und lebenden/Toten Färbung Methode dienten zu quantifizieren und zu visualisieren, Neisseria Gonorrhoeae Überleben nach Behandlung mit Ceftriaxon. Dieses Protokoll kann verlängert werden, um die antimikrobielle Wirkung der jedes Antibiotikum zu untersuchen und kann verwendet werden, um die minimalen inhibitorischen Konzentration der Antibiotika bei bakteriellen Biofilmen definieren.

Quantitative Untersuchung der Antibiotikaempfindlichkeit von Neisseria Gonorrhoeae Aggregate verwenden ATP-Auslastung kommerziellen Assays und Live/Dead Färbung

Fluoreszierend getaggte Antibiotika sind leistungsstarke Werkzeuge, die verwendet werden können, um mehrere Aspekte der antibiotika-resistenz zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von fluoreszierend markierten Antibiotika und ihre Anwendung auf die Untersuchung von Antibiotikaresistenzen bei Bakterien. Sonden können verwendet werden, um Mechanismen der bakteriellen Resistenz (z. B. Efflux) durch Spektrophotometrie, Durchflusszytometrie und Mikroskopie zu untersuchen.

Visualisierung der bakteriellen Resistenz mit fluoreszierenden Antibiotikasonden

Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zur Verwendung der Einzelzellfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung und Quantifizierung der bakteriellen Konkurrenz in der Kokultur.

Quantifizierung der interbakteriellen Konkurrenz mittels Einzelzell-Fluoreszenzbildgebung

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Bewertung der antibakteriellen Wirksamkeit eines antibiotikafreisetzenden Polymers vor, um eine prophylaktische klinische Anwendung unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen ATP-basierten lumineszierenden mikrobiellen Viabilitätstests in Echtzeit zu simulieren. Diese Methode ermöglicht die Überwachung der longitudinalen Aktivität von wirkstofffreisetzenden Materialien und kann weitgehend für die Erprobung antimikrobieller...

Eine neuartige Methode zur Bestimmung der longitudinalen antibakteriellen Aktivität von wirkstofffreisetzenden Materialien

Dieses Protokoll bietet einen systematischen Rahmen, um zu bewerten, wie phytochemische Methoden die bakteriiziden Effekte traditioneller Biozide durch bakteriizide Aktivitätsmodellierung und kombinatorische Interaktionstests verstärken können, die darauf abzielen, synergistische Mischungen zu identifizieren, die die mikrobielle Kontrolle verbessern und den gesamten Biozidverbrauch reduzieren.

In vitro Bewertung der potenzierenden Wirkung pflanzlicher Moleküle auf konventionelle Biozide

Erfahren Sie die Solubilisierung und Bio-Konjugation von CdTe-Quantenpunkten mit Antibiotika zur Untersuchung antibakterieller Effekte. Diese Methode ermöglicht Hochdurchsatz-Screening und Lichtaktivierung für verbesserte bakterielle Toxizitätstests.

Solubilisierung und Bio-Konjugation von Quantenpunkten und bakterielle Toxizitätstests von Wachstumskurve und Keimzahl

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