Establishment of Microbial Eukaryotische Anreicherungskulturen aus einer chemisch geschichteten antarktischen See und Bewertung der Kohlenstoff-Fixierung Potential

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Protisten-Anreicherungskulturen aus dem antarktischen Lake Bonnie herzustellen und die Kohlenstofffixierung als ersten indirekten Hinweis auf die metabolische Diversität zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst Wasserproben aus Tiefen des Lake Bonnie entnommen werden, die bekannten Maxima an Protisten und Phytoplankton entsprechen. Die Wasserproben des Sees werden anschließend in verschiedene Nährmedien eingeseucht und vier bis sechs Wochen lang in einer Wachstumskammer mit Temperaturregelung und Beleuchtung inkubiert.

Die Kulturen können bei Bedarf bei vier Grad Celsius transportiert werden. Der nächste Schritt besteht darin, rohe Zelllysate aus den Anreicherungskulturen zu gewinnen. Der letzte Schritt dieses Verfahrens ist die Beurteilung des Kohlenstofffixierungspotenzials im Zelllysat mithilfe eines Radioisotopen-Assays zur Bestimmung der Aktivität von Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/Oxygenase oder RubisCO.

Schließlich zeigen die Pro-Anreicherungskulturen eine Variation des Kohlenstofffixierungspotenzials in der natürlichen Protisten-Gemeinschaft. Diese Methode kann uns helfen, zentrale Fragen zur mikrobiellen Ökologie von Seen zu beantworten. Zum Beispiel die Rolle mikrobieller Eukaryoten im Kohlenstoffkreislauf in verschiedenen Schritten stratifizierter antarktischer Seen.

Obwohl das Entnehmen von Wasserproben aus der Wassersäule für nachfolgende Generationen von Anreicherungskulturen eine häufig verwendete Technik ist, enthält diese Methode Modifikationen, um in extrem kalten Umgebungen zu funktionieren, in denen unvorhergesehene Komplikationen auftreten können. Ich hatte diese Idee erstmals, als ich überlegte, wie man den Redisco-Assay in natürlichen Seeproben testen könnte. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da sich die Probennahmeschritte schwer vorstellen lassen, weil die Probenahmestellen in einer Umgebung liegen, die für viele Forschende fremd ist.

Proben werden vom Lake Bonnie entnommen, einem von zahlreichen dauerhaft vereisten Seen in den McMurdo-Trockentälern in Antarktis optica. Einen Tag vor der Entnahme der Wassersäule wählen und bereiten Sie den Probenahmestandort vor. Dadurch können sich die geschichteten Schichten der Wassersäule nach der Störung durch das Bohren und das Schmelzen des Eises wieder neu bilden. Identifizieren Sie den Standort der Bohrstelle per GPS, um Zugang zur Wassersäule zu erhalten.

Beginnen Sie damit, mit einer an eine vier Zoll lange Jiffy-Flugelverlängerung und Schneidwerkzeug angebrachten Jiffy-Eisbohrmaschine ein Loch durch das Eis zu bohren, um das Einfrieren der Bohrmaschine im Loch zu verhindern. Versuchen Sie, das Bohren in das flüssige Wasser zu vermeiden, indem Sie das Bohren etwa vier bis sechs Zoll oberhalb der Wasseroberfläche stoppen. Das Bohrloch muss von einem Durchmesser von sechs Zoll auf zwei Fuß verbreitert werden, um Proben entnehmen zu können.

Dies wird mithilfe eines heißen See-Modell-Bohrlochschmelzers erreicht, der erhitztes Polyethylenglykol durch ein Kupferrohr-Bohrloch zirkulieren lässt. Das Schmelzen dauert in der Regel bis zu 18 Stunden am Tag vor der Probenahme der Wassersäule. Stellen Sie sicher, dass die gesamte erforderliche Ausrüstung und alle Probenbehälter am Probennahmeort bereitstehen.

Zum Probenahmematerial gehören eine NICU-Flasche mit einem Fassungsvermögen von fünf bis zehn Litern, eine Winde mit einer tiefenkalibrierten Leine, ausreichend Probenflaschen für jede Probenahmetiefe, ein Messenger sowie Kühlboxen für den Probentransport. Beginnen Sie mit der Probenahme früh am Tag, etwa um 5:00 Uhr morgens, da die Filtration des See­wassers am selben Tag der Probenahme abgeschlossen sein sollte. Verwenden Sie einen Kin-Sampler, der an eine kalibrierte Handwinde angebracht ist.

Entnehmen Sie Wasserproben von ein bis fünf Litern aus den gewünschten Tiefen für diese Studie. Die Probenahmetiefen betragen sechs Meter, 15 Meter und 18 Meter, gemessen vom symmetrischen Pegelstand des Leiters im Eisschacht. Lagern Sie die See-Proben in Kühltaschen und transportieren Sie sie vom Probenahmeort ins Feldlabor.

Unter Verwendung eines Schlittens, der an einem A TV befestigt ist, sollten Proben im Feldlabor verarbeitet oder stabilisiert werden. Unmittelbar nach der Probenahme sollte die Anzucht von Anreicherungskulturen beginnen, sobald die Proben ins Feldlabor transportiert wurden. Konzentrieren Sie 0,5 bis einen Liter Seewasser auf eine 47 Millimeter große Membran mit einer Porengröße von 0,45 Mikron.

POLYETHERSULFON-Filter mit sanfter Filtration. Wenn die Vielfalt der natürlichen Gemeinschaft gewünscht ist, eine zweite Probe auf 47 Millimeter, 0,45 Mikrometer Porengröße filtern.

POLYETHERSulfon-Filter werden durch Schnellgefrieren in flüssigem Stickstoff fixiert. Überführen Sie jeden Filter in ein steriles 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen, das etwa 20 Milliliter gefiltertes See­wasser enthält, das aus derselben Probenahmetiefe wie der Filter stammt.

Überführen Sie die Zellsuspension in einen sterilen Zellkulturgefäßkolben mit 25 Quadratzentimetern Fläche für Anreicherungen auf verschiedenen Kulturmedien. Richten Sie mehrere Replikate für jede Probenahmetiefe ein. Ergänzen Sie jeden Kulturkolben mit 50 x sterilen Lösungen der folgenden Kulturmedien: bold basil, Medium, BG 11 und F zwei.

Wenn die Kultivierung von gemischten atrophen Organismen erforderlich ist, richten Sie zwei mit F2 ergänzte Gefäße ein und geben Sie zwei bis drei Körner steriler Reis in eines der Inkubationskulturgefäße bei niedriger Temperatur und geringer Bestrahlungsstärke in einem temperaturgeregelten Wachstumsinkubator mindestens vier Wochen vor dem Versand an das US-Labor ein. Überführen Sie die Anreicherungskulturen in sterile 50-Milliliter-Falcon-Röhrchen. Fordern Sie beim Versandantrag die Versandanforderungen „nicht einfrieren“ und „gekühlt halten“ an. Nach Eintreffen in den USA übertragen Sie fünf Milliliter jeder Anreicherungskultur in 45 Milliliter geeignetes Wachstumsmedium in ein 125-Milliliter-Fläschchen.

Sterile Erlenmeyerkolben, verschlossen mit einem sterilen Schwamm. Die Anreicherungskulturen als Standkulturen in einer temperaturgeregelten Wachstumskammer bei vier Grad Celsius pflegen und alle 30 Tage Übertragungskulturen mit geringer Strahlungsintensität auf frisches Medium überführen. Um mit dem Verfahren zur Zelllysat-Extraktion zu beginnen, fünf Liter Anreicherungskultur unter Verwendung eines sanften Vakuums auf einen 25-Millimeter-Watman-GFF-Filter filtrieren.

Schneiden Sie anschließend den Filter mit sterilen Stahlscheren in vier bis fünf Abschnitte. Überführen Sie die Stücke dann mit sterilen Pinzetten in ein 2-Milliliter-Schraubverschlussgefäß, das zu einem Fünftel mit 0,1-Millimeter-Durchmesser gefüllt ist.

Zirkonia-Silica-Perlen. Geben Sie 1,25 Milliliter Filterextraktionspuffer in das Reaktionsgefäß und lysieren Sie anschließend die Zellen mithilfe eines Mini-Bead-Beaters für 30 Sekunden bei einer Geschwindigkeit von 48, danach kühlen Sie eine Minute auf Eis. Wiederholen Sie den Bead-Beat-Vorgang insgesamt dreimal, jeweils mit einer einminütigen Inkubation auf Eis dazwischen, um eine Erwärmung der Probe während der Zentrifugation zu verhindern.

Filtrieren Sie die Suspension zwei Minuten lang bei 3000 × g und vier Grad Celsius, um einen lockeren Pfropf aus GFF-Filterfasern und Zellwandtrümmern zu bilden. Entnehmen Sie eine 200-Mikroliter-Portion des Überstandes und geben Sie sie in 800 Mikroliter eiskalte 90 %ige Aceton.

Überführen Sie das verbleibende snat in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Messen Sie den extrahierbaren Chlorophyll-A-Gehalt in einem Spektrophotometer bei Wellenlängenwerten von 664 Nanometern und 647 Nanometern. Zentrifugieren Sie das verbleibende SUP-Überstand für zwei Minuten bei 15.000 ×g bei vier Grad Celsius.

Überführen Sie das S in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, wobei das Pellet aus unlöslichen zellulären Membranen und verbleibenden GFF-Filterfasern vermieden werden sollte. Dieser lösliche Zelllysat kann nun im Rubis-Carboxylase-Aktivitätsassay verwendet werden, der als Nächstes demonstriert wird. Um diesen Assay zu beginnen, überführen Sie 125 Mikroliter jedes löslichen Lysats in ein 1,5-Milliliter-Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen, das zuvor auf Eis gekühlt wurde.

Fügen Sie für die Negativkontrollproben 125 Mikroliter löslichen Lysat einem 1,5-Milliliter-Schraubverschluss-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, fügen Sie jedoch kein Substrat hinzu. Führen Sie anschließend Duplikatreaktionen für alle Proben und Negativkontrollen durch. Bereiten Sie 10 Milliliter Assaypuffer frisch zu und kühlen Sie ihn auf Eis.

Gegeben Sie ausreichend des Assaypuffers für alle Proben und Negativkontrollen in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen. Ab diesem Punkt müssen alle Schritte unter einem Abzug durchgeführt werden. Fügen Sie C-14-markiertes Natriumbicarbonat zum zugewiesenen Puffer hinzu und bewahren Sie den Puffer auf Eis auf.

Entfernen Sie 10 Mikroliter des Assaypuffers, der C 14 enthält, und verdünnen Sie diesen in einem Milliliter Assaypuffer durch Invertieren. Geben Sie 100 Mikroliter der verdünnten Mischung zu drei Millilitern Biosafe Two Szintillationszählmischung in einer Szintillationsflasche hinzu, um zu mischen, und invertieren Sie die Flasche. Messen Sie die C-14-Zählraten mit einem Beckman LS 6.500 Szintillationszähler; die Zählraten sollten vor Fortsetzung des Assays über 18.000 Zählraten pro Minute liegen.

Wenn genügend mit C 14 markiertes Natriumbicarbonat zum Assay-Puffer hinzugefügt wurde, die Reaktionsgefäße in ein Trockenbad überführen, das auf 25 Grad Celsius voreingestellt ist, und drei bis fünf Minuten inkubieren. Anschließend 100 Mikroliter Assay-Puffer zu den Lysaten geben und fünf Minuten bei 25 Grad Celsius inkubieren. Nach fünf Minuten Ribulose-1,5-bisphosphat zu jeder Probe hinzufügen und die Reaktion fünf bis zehn Minuten bei 25 Grad Celsius fortschreiten lassen.

Um die Reaktion zu stoppen, 100 Mikroliter 100 %iger probiotischer Säure hinzufügen und eine Stunde bei 2000 × g zentrifugieren, um nicht eingebautes C-14 auszuschleusen. Abschließend das gesamte Probenvolumen in Szintillationsgefäße überführen, die drei Milliliter Bios enthalten. Safe-two-Szintillationszähler-Cocktail verwenden, um die Zählraten pro Minute der säurestabilen Fraktion zu bestimmen.

Endprodukte durch Szintillationszählung. Mithilfe von Anreicherungskulturen wurden neuartige kälteangepasste phototrophe und mixotrophe Protisten aus dem antarktischen Lake Bonnie in drei Tiefen isoliert. Verschiedene Arten von Nährmedien wurden verwendet, um eine größere Vielfalt an Organismen auszuwählen: Bolds-Basil-Medium oder BBMF zwei si, Marine-Medium und BG-11-Medium.

Die Nährstoffkonzentration und die photosynthetisch aktive Strahlung oder PAR, die in dieser Tabelle angegeben sind, repräsentieren die Bedingungen zum Zeitpunkt der Probenentnahme. Die visuelle Untersuchung der Anreicherungskulturen mittels Lichtmikroskopie zeigte, dass die Kulturen von phototrophen Protisten dominiert wurden, wie durch das Vorhandensein von Chlorophyllpigment in den meisten Zellen angezeigt. Die Kulturen enthielten außerdem eine Vielzahl von Zellmorphologien, abhängig von der Entnahmetiefe des Inokulums und der Art des Kulturmediums, das verwendet wurde.

Die maximalen Raten der durch das Enzym Rubis katalysierten Carboxylaseaktivität wurden in den angereicherten Kulturen als Proxy für die Kohlenstofffixierung gemessen. Das potenzielle Vorkommen von Chlorophyll a wurde außerdem als Schätzung der phototrophen Protistenbiomasse überwacht, wie hier gezeigt.

Trotz der Kultivierung aller Kulturen unter denselben Temperaturbedingungen variieren Lichtregime, Kohlenstofffixierungspotential und phototrophische Biomasse zwischen den Anreicherungskulturen erheblich. Die maximale RubisCO-Aktivität wurde in den Anreicherungskulturen vier und sechs, die in BBM-Medium wuchsen, sowie in den Anreicherungskulturen 13 und 14, die in BG-11-Medium wuchsen, beobachtet. Im Gegensatz dazu wiesen die Kulturen 1921 und 23, die in F2-Wachstumsmedium angereichert wurden, maximale Carboxylaseaktivitäten auf, die vier- bis 34-fach niedriger waren.

Diese Unterschiede waren nicht auf geringere Biomassewerte in den F2-Kulturen zurückzuführen, da die Carboxylaseaktivität bezogen auf Chlorophyll a angegeben wurde. Darüber hinaus zeigte eine Pearson-Korrelationsanalyse, dass die Rubisco-Aktivität nicht mit der Chlorophyll-a-Konzentration korrelierte. Die BBM-Kulturen wurden mit Seewasser aus sechs Metern und 15 Metern Tiefe beimpft.

Im Forum fünf der Anreicherung wurden die höchsten Chlorophyll-a-Werte gemessen, während alle anderen Kulturen unabhängig von der Rubis-Enzymaktivität relativ niedrige Chlorophyll-a-Werte aufwiesen. Wenn man die Technik einmal beherrscht, dauert die Probenahme im See etwa zwei Stunden. Abhängig von der Anzahl der entnommenen Proben benötigt der Carboxylase-Assay bei korrekter Durchführung ebenfalls etwa zwei Stunden. Nach dieser Vorgehensweise können weitere Methoden wie der Assay zur heterotrophen Enzymaktivität angewendet werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, in welcher Tiefe Heterotrophe vorkommen. Gut, nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man See-Proben sammelt, sie zur Produktion anreichert und auf Rubis-Carboxylase-Aktivität testet.