High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated In-situ- Hybridisierung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, DNA-Sonden mit Hilfe einer Hochdruck-Chromosomenpräparation auf Mückenpolytan-Chromosomen zu kartieren, gefolgt von einer automatisierten Fluoreszenz-in-C-Zwei-Hybridisierung und automatisierter Bildgebung. Dies wird erreicht, indem zunächst Polytan-Chromosomenspreizungen mit einem Hochdruckverfahren vorbereitet werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, Fluoreszenzsonden herzustellen, indem genomische DNA-Dateien mit dem Fluorochrom unter Verwendung eines Nick-Translationsprotokolls markiert werden.

Der dritte Schritt besteht darin, die Fluoreszenz-in-C-Zwei-Hybridisierung mit automatisierten Objektträgerfärbesystemen durchzuführen. Der letzte Schritt besteht darin, markierte Chromosomen mit einem automatischen Fluoreszenzbildgebungssystem zu scannen und zu fotografieren. Letztendlich können Bilder die Lokalisierung einer fluoreszenzmarkierten DNA-Sonde auf dem Polychromosom zeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik oder bestehender Methoden, wie z. B. eines standardmäßigen manuellen In-situ-Hybridisierungsprotokolls, besteht darin, dass das physikalische Mapping-Protokoll mit dem höchsten Durchsatz konsistentere Ergebnisse liefert und den Zeitaufwand drastisch reduziert. Dieses Protokoll beginnt mit der Präparierung von Weibchen in halber Schwerkraft und bei Oly-Weibchen etwa 25 Stunden nach der Blutfütterung, um ihre Eierstöcke zu entnehmen, wenn sie sich in Christophers drittem Stadium befinden. In diesem Stadium sollte der transparente Bereich mit den Ammenzellen innerhalb der Follikel eine runde Form haben, Eierstöcke von fünf Frauen sammeln und sie in 500 Mikrolitern frisch hergestellter modifizierter Autogeräuschlösung fixieren.

Anschließend können sie bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur oder länger bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Bereiten Sie als nächstes, kurz vor der Herstellung von Eierstockdissektionen, Autogeräuschlösung und 50% Propionsäure vor. Legen Sie jedes Paar Eierstöcke in einen Tropfen frischer Autogeräuschlösung auf einen staubfreien Objektträger unter einem Präpariermikroskop.

Teilen Sie die Eierstöcke mit der Präpariernadel. Übertragen Sie alle Eierstockstücke auf sechs saubere Objektträger mit 50 % Propionsäure. Trennen Sie die Follikel mit Präpariernadeln voneinander.

Wischen Sie dann alle restlichen Taschentücher mit einem Papiertuch ab. Fügen Sie einen weiteren Tropfen 50%ige Proponsäure hinzu und warten Sie drei bis fünf Minuten. Legende, die Follikel sitzen drei bis fünf Minuten in 50%iger Proponsäure und verbessern die Chromosomenausbreitung erheblich.

Bringen Sie anschließend einen Deckschirm an und warten Sie eine weitere Minute, um die Kerne zu spreizen. Wickeln Sie den Objektträger mit Filterpapier und Plastik ein. Stellen Sie einen Dremel auf drei bis 5.000 U/min ein und schwenken Sie etwa eine Minute lang eine sich drehende Dremelspitze leicht gegen den Deckglas.

Bestätigen Sie die Spreizqualität mit einem Phasenmikroskop und tragen Sie den Dremel bei Bedarf länger auf, um die Chromosomen abzuflachen. Platzieren Sie ein zweites Deckglas neben dem ersten und verbinden Sie die Deckgläser mit einem anderen Mikroskop. Schieben Sie als nächstes, wickeln Sie die Objektträger mit einer Plastikfolie und mit Filterpapier ein und legen Sie die Objektträger in einen Schraubstock, um die Objektträger auf ein Gewicht zwischen 85 und 120 Zoll zu drücken.

Nachdem Sie die Chromosomen auf allen sechs Objektträgern abgeflacht haben, wickeln Sie die Objektträger aus und entfernen Sie die zusätzlichen Objektträger, um die Chromosomen weiter abzuflachen. Inkubieren Sie die Objektträger bei 55 Grad Celsius für 10 bis 15 Minuten in einem Objektträger-Denaturierungshybridisierungssystem. Tauchen Sie anschließend einen Objektträger mindestens 15 Sekunden lang in flüssigen Stickstoff oder bis das Blasen aufgehört hat.

Entfernen Sie dann schnell den Deckglas mit einer Rasierklinge und legen Sie den Objektträger sofort fünf Minuten lang in kaltes, 50%iges Ethanol. Wiederholen Sie diesen Vorgang nacheinander für jede Folie. Entwässern Sie die Objektträger in einem 70%-, 90%- und einem 100%Ethanolbad.

Tauchen Sie sie fünf Minuten lang in jedes Bad. Nachdem die Objektträger an der Luft getrocknet sind, sind sie bereit für den Fisch zum Färben. Ein automatisiertes Gerät führt die meisten Schritte des Verfahrens aus, mit Ausnahme der Sondenbeschriftung.

Bereiten Sie also vor dem Laden des Geräts die Fluoreszenzsonde vor, indem Sie die DNA mit dem Fluorochrom unter Verwendung eines kommerziellen NIC-Übersetzungsprotokolls zurückmarkieren, wobei die Sonde vorbereitet ist, laden Sie die Objektträger und Reagenzien in die automatisierten Objektträger. Färbesystem und programmieren Sie das System so, dass es die folgenden Schritte ausführt. Zuerst werden 800 Mikroliter eines XPBS für 20 Minuten zugeführt.

Zweitens, föhnen Sie die Objektträger. Drittens, fixieren Sie die Objektträger mit 450 Mikrolitern 4%igem Formalin in einem XPBS für eine Minute. Waschen Sie dann die Objektträger eine Sekunde, zweimal und zwei Minuten lang mit 100%igem Ethanol.

Föhnen Sie die Objektträger nach dem Ethanolbad erneut trocken. Erhitzen Sie die Dias nun zwei Minuten lang bei 45 Grad Celsius, um Blasenbildung zu vermeiden. Dann tragen Sie 20 Mikroliter der DNA-Sonde auf, gefolgt von einem Tropfen Mineralöl und einem Decktuch als nächstes in der Natur, die Chromosomen bei 90 Grad Celsius für 10 Minuten zu untersuchen.

Stellen Sie dann die Objektträger so ein, dass sie 14 Stunden lang bei 42 Grad Celsius hybridisieren. Nach dem Aushärten der Hybridisierung wird die Strenge zwei Minuten lang bei 42 Grad Celsius gewaschen, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden einsekündigen Anwendungen von zwei XSSC und Trocknung. Tragen Sie dann zweimal 800 Mikroliter 0,4 XSSC bei 42 Grad Celsius für 10 Minuten auf, gefolgt von einer weiteren Wäsche und zwei XSSC bei 25 Grad Celsius für 10 Minuten.

Tragen Sie nun die Beize 50 Mikroliter Jojo eins auf, gefolgt von Mineralöl und Deckgläsern. Inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei 25 Grad Celsius. Entfernen Sie dann die Deckgläser.

Waschen Sie die Objektträger viermal pro Waschgang eine Sekunde lang in zwei XSSC und blasen Sie die Objektträger trocken. Tragen Sie zum Schluss 15 Mikroliter verlängertes Gold-Anti-Fade-Reagenz auf jeden Objektträger auf und bringen Sie neue Deckgläser an. Schalten Sie das automatisierte Scansystem Accord plus ein, beginnend mit dem Olympus U-R-F-L-T-Netzteil für eine Halogenlampe.

Dann der Computer und schließlich das Mikroskop mit Kameraaufsatz. Öffnen Sie nun zuerst das Duett-Softwarepaket, richten Sie einen 10 x Pre-Scan ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Online", geben Sie eine neue Fall-ID ein und weisen Sie eine Folien-ID zu.

Klicken Sie auf den Punkt mit der Bezeichnung bf. Dies ist die Hellfeld-Option. Wählen Sie eine Scan-Option für 10 x Vorscan.

Wählen Sie 2, 500 x Kreis, 10, 000 x Kreis oder Rechteck. Klicken Sie auf Festlegen und ausführen. Und dann, okay, folgen Sie den Anweisungen, um den Scanvorgang richtig anzupassen, und klicken Sie dann auf Fertig.

Um den Scan zu starten, drücken Sie die Hauptregisterkarte, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Klicken Sie nun auf die Schaltfläche Offline, suchen Sie die zugewiesene Fall-ID und Folien-ID. Und klicken Sie auf Offline.

Scannen Sie in das schwarze Feld im oberen linken Bereich. Klicken Sie auf einen Pfeil und wählen Sie 10 x Pre-Scan. Verwenden Sie die Pfeile, um durch die gescannten Bilder zu blättern, nachdem Sie ein interessantes Bild gefunden haben.

Doppelklicken Sie auf den Bildschirm in der Mitte des Zielbereichs und drücken Sie Snap. Dadurch wird ein Bild für die spätere Erfassung ausgewählt, nachdem alle Ziele ausgewählt wurden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jedes Bild, klicken Sie auf Klassifizieren, wählen Sie 10 x Vorscan und wählen Sie Polytan.

Kehren Sie zum Hauptmenü zurück und richten Sie den 40-fachen Pre-Scan ein. Wählen Sie erneut online aus, und wählen Sie eine Folie aus. Ändern Sie BF in ffl und ändern Sie den Aufgabennamen, um dash X 40 dash rg erneut zu besuchen.

Ändern Sie den Abschnitt direkt unter der letzten Einstellung, um alle Striche erneut zu verwenden. Führen Sie dann das Programm aus und folgen Sie den Anweisungen. Um die Automatisierung einzurichten, klicken Sie auf die Schaltfläche Abgleichen von Ansichten starten, um 10 x und 40 x Bilder abzugleichen.

Klicken Sie auf Fertig stellen, um den Scan zu starten. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Klassifizieren und sehen Sie sich die Bilder an. Die Präparation von polytanen Chromosomen der ovariellen Ammenzelle aus der weiblichen Anomalie Gambia wurde mit der Hochdrucktechnik hergestellt.

Diese Methode beschädigt oder verändert den größten Teil der Chromosomenstruktur nicht. Es glättet verbogene Chromosomen und legt so verborgene feine Banden frei, die bei normalen Präparaten nicht zu sehen sind. Das Chromosom wurde mit Back-DNA-Klonen untersucht, die aus der Anomalie-Back-Bibliothek von S Gambia und Tam gewonnen wurden.

Die Bibliothek wurde aus Männchen und Weibchen zuerst in Sternlarven des Anomalie-Schädlingsstamms S Gambia generiert. Im Anschluss an dieses Verfahren kann ein automatisiertes physikalisches Hochdurchsatz-Mapping durchgeführt werden, um die schnelle Entwicklung von chromosomenbasierten Genomassemblierungen zu erleichtern.