Name: High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated In-situ- Hybridisierung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Erfahren Sie die automatisierte hochdurchsatz-physikalische Kartierung von Chromosomen bei Mücken mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. Diese Methode verbessert Effizienz und Konsistenz bei der Entwicklung genomischer Karten erheblich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde durch eine Förderung der National Institutes of Health (1R21AI094289) an Igor V. Sharakhov unterstützt. Das Xmatrx Automated Slide Staining System und das ACCORD PLUS Automated Scanning System wurden mit Hilfe des Equipment Trust Fund-Programms, des Fralin Life Science Institute, der Abteilung für Entomologie und der Abteilung für Biochemie der Virginia Tech erworben.

1. Herstellung von Polytänchromosomen bei hohem Druck aus Ovarialnursezellen
<ol>
	<li>Sezieren Sie halbträchtige Anopheles-Weibchen 25 Stunden nach der Blutmahlzeit unter einem Stereomikroskop und fixieren Sie die Ovarien in frischer modifizierter Carnoy’scher Lösung mit Methanol (100 % Methanol : eisessige Säure, 3:1). Zu diesem Zeitpunkt befinden sich die Ovarien im Christophers-Stadium III, bei dem die Follikel eine ovale Form aufweisen und der transparente Bereich mit den Nährzellen innerhalb der Follikel rundlich ist13. Geben Sie die Ovarien von etwa fünf Weibchen in 500 μl modifizierter Carnoy’scher Lösung in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen und lagern Sie sie 24 Stunden bei Raumtemperatur. Überführen Sie die Ovarien anschließend zur Langzeitlagerung bei -20 °C.</li>
	<li>Stellen Sie die modifizierte Carnoy’sche Lösung kurz vor dem Präparieren her, indem Sie Ethanol (100 % Ethanol : eisessige Säure, 3:1) und 50 % Propionsäure mischen. Geben Sie ein Ovarienpaar auf einen staubfreien Objektträger in einen Tropfen der modifizierten Carnoy’schen Lösung. Teilen Sie die Ovarien mit Hilfe von Präparationsnadeln in etwa sechs Abschnitte und legen Sie diese in Tropfen 50 %iger Propionsäure auf saubere Objektträger unter einem Stereomikroskop Leica MZ6. Verwenden Sie für jeden Abschnitt einen separaten Objektträger.</li>
	<li>Lösen Sie die Follikel vorsichtig mit Nadeln und entfernen Sie restliches Gewebe mit Filterpapier oder Küchenpapier unter dem Stereomikroskop. Geben Sie einen neuen Tropfen 50 %iger Propionsäure zu den Follikeln und lassen Sie diese 3–5 Minuten bei Raumtemperatur einwirken. Legen Sie ein Deckglas auf den Tropfen der 50 %igen Propionsäure. Lassen Sie das Präparat etwa 1 Minute stehen.</li>
	<li>Umwickeln Sie den Objektträger mit Filterpapier und Plastikfolie. Drücken Sie die Follikel mit einem Dremel-200-Rotationsgerät, das mit einem Flex-Schaft und einer weichen Kunststoffspitze ausgestattet ist, bei 3000–5000 U/min durch kreisförmiges Bewegen und leichtes Andrücken des Deckglases gleichmäßig auseinander, um die Kerne zu verteilen. Dieser Schritt sollte etwa 1 Minute dauern. Überprüfen Sie die Qualität der Verteilung mit einem Phasenkontrastmikroskop Olympus CX41 und einem 20x-Objektiv.</li>
	<li>Erstellen Sie ein Sandwich, indem Sie ein zusätzliches Deckglas neben das chromosomenbedeckende Deckglas legen und beide mit einem zweiten Objektträger abdecken. Dadurch wird die Gefahr verringert, dass der Objektträger in der Schraubzwinge zerquetscht wird. Wickeln Sie das Präparat mit der Plastikfolie, wie sie in Objektträgerbehältern enthalten ist, und Filterpapier ein, um das Sandwich zu stabilisieren und den Objektträger vor Kratzern durch die Zwickel zu schützen.</li>
	<li>Üben Sie Druck auf die Objektträger mithilfe einer mechanischen Schraubzwinge aus. Ein Drehmoment von 85–120 inch-lbs ist ausreichend und wird mit einem Drehmomentschlüssel erreicht. Dieser Schritt ist notwendig, um die Chromosomen so flach wie möglich zu machen.</li>
	<li>Entfernen Sie den zweiten Objektträger und das zusätzliche Deckglas. Erhitzen Sie den Objektträger mit dem chromosomenbedeckenden Deckglas 10–15 Minuten lang auf 55 °C in einem System zur Denaturierung/Hybridisierung von Objektträgern, um die Chromosomen weiter zu glätten. Tauchen Sie den Objektträger mindestens 15 Sekunden in flüssigen Stickstoff und entfernen Sie, sobald das Blasen aufgehört hat, das Deckglas rasch mit einer Rasierklinge. Stellen Sie die Objektträger unmittelbar für 5 Minuten in kalten 50 %igen Ethanol. Dehydrieren Sie die Objektträger nacheinander in 70 %, 90 % und 100 %igem Ethanol je 5 Minuten. Lassen Sie die Objektträger anschließend an der Luft trocknen.</li>
</ol>
2. FISH unter Verwendung eines automatisierten Objektträger-Färbegeräts
Das Programm ist am Xmatrx-Automatisierten Objektträgerfärbungssystem so eingerichtet, dass die folgenden Schritte durchgeführt werden, mit Ausnahme der Sondenmarkierung. Die ausführliche Nick-Translation-Markierungsanleitung ist in der Dokumentation beschrieben, die zusammen mit der DNA-Polymerase von Fermentas bereitgestellt wird.
<ol>
	<li>Vor der FISH-Analyse fluoreszierende Sonden herstellen, indem genomische BAC-DNA mit einem Fluorochrom über ein Nick-Translation-Protokoll markiert wird. 1 μg DNA, jeweils 0,05 mM unmarkiertes dATP, dCTP und dGTP sowie 0,015 mM dTTP, 1 μl Cy3- oder Cy5-dUTP, 0,05 mg/ml BSA, 5 μl 10x Nick-Translationspuffer, 20 Einheiten DNA-Polymerase I, 0,0012 Einheiten DNase I und nukleasefreies Wasser zu 25 μl Gesamtvolumen mischen. Das Verhältnis von DNA-Polymerase I zu DNase I wird empirisch so gewählt, dass Sonden mit einer Größe zwischen 300 und 500 bp entstehen. Die Mischung 1 Stunde bei 15 °C inkubieren.</li>
	<li>Die Objektträger und Reagenzien in das automatisierte Objektträgerfärbegerät Xmatrx geben und das Programm starten, um die folgenden Schritte durchzuführen. 800 μl 1x PBS 20 Minuten lang zugeben. Die Objektträger mit Luft abblasen. Die Fixierung mit Formalin durchführen, indem 450 μl 4 % Formalin in 1x PBS 1 Minute lang zugegeben werden, gefolgt von zwei Spülgängen mit 100 % Ethanol je 1 Sekunde und einem Spülgang mit 2 Minuten Dauer. Die Objektträger mit Luft abblasen.</li>
	<li>Die Objektträger 2 Minuten lang auf 45 °C erhitzen, um Blasenbildung beim Auftragen der Sonden zu vermeiden. 20 μl der DNA-Sonden auftragen, Tropfen Paraffinöl hinzufügen, um die Verdunstung der Hybridisierungslösung zu verhindern, und ein Deckglas auflegen. Chromosomen und DNA-Sonden durch Erhitzen der Objektträger auf 90 °C für 10 Minuten denaturieren.</li>
	<li>Zur Hybridisierung die Objektträger 14 Stunden bei 42 °C mit aufgelegtem Deckglas inkubieren. Die Hybridisierungslösung besteht aus 2x SSC, 100 mM Natriumphosphat, 1x Denhardt-Lösung, 100 μg/ml Natriumazid und 10 % Dextran Sulfat in Formamid.</li>
	<li>Für die Stringenzwäschen die Objektträger 2 Minuten lang auf 42 °C erhitzen, die Deckgläser entfernen und die Objektträger viermal je 1 Sekunde in 2x SSC waschen. Die Objektträger mit Luft abblasen. Jeweils zweimal 800 μl 0,4x SSC bei 42 °C 10 Minuten lang zugeben. Die Objektträger bei 25 °C 10 Minuten lang in 2x SSC waschen.</li>
	<li>Die Chromosomenanfärbung durchführen, indem 50 μl 1 μM YOYO-1 in 1x PBS aufgetragen werden. Tropfen Paraffinöl hinzufügen, um die Verdunstung der Färbelösung zu verhindern, Deckgläser auflegen und 10 Minuten bei 25 °C inkubieren. Die Deckgläser entfernen und die Objektträger viermal je 1 Sekunde in 2x SSC waschen. Die Objektträger mit Luft abblasen. 15 μl ProLong Gold Antifade-Reagenz auftragen. Deckgläser auflegen.</li>
</ol>
3. Schlidenbeurteilung mit einem automatischen fluoreszenzbasierten Bildgebungssystem
Dieser Abschnitt beschreibt die Verwendung der Duet-Software, die standardmäßig mit dem automatisierten ACCORD PLUS-Scansystem geliefert wird. Die Anweisungen beginnen nach dem Einschalten in folgender Reihenfolge: Olympus U-RFL-T-Netzteil für eine Halogenlampe, Computer Dell Precision T3500, Mikroskop Olympus BX61 mit angeschlossener Kamera Olympus U-CMAD3.
<ol>
	<li>Öffnen Sie die Duet-Software im ACCORD PLUS automatisierten Scansystem, um den 10x-Vorscan einzurichten. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Online“. Geben Sie eine neue Fall-ID ein und weisen Sie eine Objektträger-ID zu. Klicken Sie auf den Punkt mit der Bezeichnung „BF“. Dies ist die Hellfeld-Option. Wählen Sie als Scan-Option „10x Prescan“. Verwenden Sie „2500x circle“, „10000x circle“ oder „rectangle“. Klicken Sie auf „Set&amp;run“, um den 10x-Vorscan zu starten.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche „OK“, um den 10x-Vorscan auszuführen. Befolgen Sie die Anweisungen, um den Scanvorgang korrekt einzustellen. Klicken Sie auf „Finish“, um den Scan zu starten. Drücken Sie die Registerkarte „Main“, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Offline“. Suchen Sie die zugewiesene Fall-ID und Objektträger-ID und klicken Sie auf „Offline Scan“. Klicken Sie in der schwarzen Box im oberen linken Bereich auf einen Pfeil und wählen Sie „10x Prescan“. Navigieren Sie mithilfe der Pfeile (&lt; || Δ &gt;, auch bekannt als „zurück“, „pause“, „play“, „vorwärts“-Tasten) durch die gescannten Bilder.</li>
	<li>Nachdem Sie ein Bild von Interesse gefunden haben, doppelklicken Sie auf den Bildschirm in der Mitte des Zielbereichs und drücken Sie „Snap“. Dadurch wird ein Bild für die spätere Aufnahme markiert. Klicken Sie nach Auswahl aller Ziele auf „Classify“. Wählen Sie „10x Prescan“. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf ein Bild, um die Möglichkeit zu erhalten, die Bilder zu klassifizieren. Wählen Sie „Polytene“.</li>
	<li>Richten Sie den 40x-Vorscan in der Duet-Software ein. Klicken Sie auf „Main“, um zum Hauptmenü zurückzukehren. Wählen Sie erneut „Online“. Wählen Sie einen Objektträger aus. Ändern Sie „BF“ in „FL“. Ändern Sie den Aufgabennamen in „Revisit-X40-RG“. Ändern Sie den Abschnitt direkt unter der letzten Einstellung in „Revisit-ALL“. Klicken Sie auf „Set&amp;Run“. Drücken Sie „OK“. Befolgen Sie erneut die Anweisungen, um die Automatisierung einzurichten. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Start matching views“, um die 10x- und 40x-Bilder abzugleichen. Klicken Sie auf „Finish“, um den Scan zu starten. Klicken Sie danach auf „Classify“ und betrachten Sie die Bilder.</li>
</ol>
4. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1 zeigt schematisch die Vorgehensweise zur Herstellung von Chromosomen unter hohem Druck. Dieser Schritt umfasst das Zerquetschen und Flachdrücken der Chromosomen mithilfe eines Dremel-Werkzeugs und einer mechanischen Schraubzwinge sowie die Visualisierung der Chromosomen mittels eines Phasenkontrstmikroskops. Abbildung 2 veranschaulicht die Hybridisierung einer fluoreszenzmarkierten Sonde an die Ziel-DNA auf den Chromosomenpräparaten unter Verwendung eines automatisierten Objektträger-Färbungssystems, den Einsatz eines automatisierten Scanningmikroskops zur Visualisierung und Kartierung der Sonden nach dem FISH-Experiment sowie das Platzieren und Ausrichten genomischer Scaffolds auf den Chromosomen.
Präparationen von polytänen Ovarialnursezellchromosomen aus Weibchen von An. gambiae wurden mithilfe der Hochdrucktechnik angefertigt. Diese Methode beschädigt oder verändert die meisten Chromosomenstrukturen nicht (Abbildung 3). Sie glättet gekrümmte Chromosomen und macht dadurch versteckte Feinbanden sichtbar, die in regulären Präparationen nicht zu erkennen sind (Abbildung 4).
Die in diesem Protokoll verwendeten Sonden sind genomische BAC-DNA-Klone, die aus einer ND-TAM-BAC-Bibliothek stammen, die aus DNA des An. gambiae-Stamms PEST gewonnen wurde. Die genomische DNA für diese Bibliothek wurde aus frisch geschlüpften Larven des ersten Entwicklungsstadiums beider Geschlechter isoliert. Abbildung 5 zeigt die Ergebnisse einer FISH-Analyse unter Verwendung von BAC-Klonen, die an Polytänchromosomen von An. gambiae hybridisiert wurden. Dieses Verfahren wurde mit dem automatisierten Objektträgerfärbungssystem Xmatrx durchgeführt. Anhand einer zytogenetischen Fotokarte für An. gambiae10 wurden zwei BAC-Klone, 102B24 (GenBank: BH372701, BH372694) und BAC 142O19 (GenBank: BH368703, BH368698), den Unterteilungen 16C bzw. 16D des 2R-Arms zugeordnet. Eine BLAST-Suche gegen die AgamP3-Genomassembly des An. gambiae-Stamms PEST14 identifizierte jedoch die Sequenzen, die homolog zu 102B24 und 142O19 sind, in den Unterteilungen 16B bzw. 17A des 2R-Arms (Tabelle 1). Daher kann die Zuordnung zwischen den genomischen Koordinaten und den zytogenetischen Unterteilungen nun anhand unserer Kartierungsdaten korrigiert werden. Die BLAST-Suche gegen die Genom-Assemblies der M-Form und S-Form von An. gambiae ergab, dass sich die beiden BAC-Klone in unterschiedlichen Contigs, jedoch in denselben Scaffolds innerhalb jeder Form befinden (Tabelle 1). Die identifizierten Contigs können nun bestimmten chromosomalen Positionen zugeordnet werden. Darüber hinaus können die identifizierten Scaffolds innerhalb der zytologischen Unterteilungen 16CD korrekt orientiert werden. Interessanterweise betragen die Abstände zwischen den Sequenzen 102B24 und 142O19 in den Scaffolds 1.892.981 bp, 1.658.391 bp und 1.688.426 bp in den Genom-Assemblies des PEST-Stamms, der M-Form bzw. der S-Form. Da der PEST-Stamm ein Hybrid aus der M- und der S-Form ist, liegt dieser Unterschied wahrscheinlich an einer fehlerhaften Assembly des PEST-Genoms.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BAC 
			(Zugangsnummer)</td>
			<td>PEST-Stamm 
			AgamP3 
			 
			Koordinaten</td>
			<td>M-Form 
			Contigs 
			 
			Koordinaten</td>
			<td>M-Form 
			Scaffolds 
			 
			Koordinaten</td>
			<td>S-Form 
			Contigs 
			 
			Koordinaten</td>
			<td>S-Form 
			Scaffolds 
			 
			Koordinaten</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372694)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_26 (16B) 
			 
			43.681.342- 
			43.681.874</td>
			<td>ABKP020247 
			53,1 
			 
			32.513- 
			33.045</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			1.858.377- 
			1.858.909</td>
			<td>ABKQ010123 
			32,1 
			 
			4.299- 
			4.832</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			215.891- 
			216.424</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>102B24 
			(BH372701)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8844_28 (16B) 
			 
			43.788.213- 
			43.788.969</td>
			<td>ABKP020247 
			51,1 
			 
			24.816- 
			25.575</td>
			<td>EQ090167.1, 
			 
			1.772.683- 
			1.773.442</td>
			<td>ABKQ010123 
			35,1 
			 
			27.782- 
			28.540</td>
			<td>EQ099711.1, 
			 
			305.514- 
			306.272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368698)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			 
			8805_5 (17A) 
			45.428.580- 
			45.429.264</td>
			<td>ABKP020247 
			01,1 
			 
			2.499- 
			3.185</td>
			<td>EQ090167.1 
			 
			315.806- 
			316.492</td>
			<td>ABKQ010123 
			76,1 
			 
			49.242- 
			49.942</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1.791.625- 
			1.792.325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>142O19 
			(BH368703)</td>
			<td>2R:AAAB0100 
			8805_8 (17A) 
			 
			45.560.099- 
			45.574.323</td>
			<td>ABKP020220 
			17,1 
			 
			30.971- 
			32.469</td>
			<td>EQ090167.1 
			200.518- 
			202.016</td>
			<td>ABKQ010123 
			79,1 
			 
			27.760- 
			28.508</td>
			<td>EQ099711.1 
			 
			1.903.569- 
			1.904.317</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1. BLAST-Ergebnisse der BAC-Endsequenzen im Vergleich mit den Genomzusammenstellungen von An. gambiae.
<img alt="Dissektion der Mückenovarien; Stereomikroskop; Chromosomenpräparation; Phasenkontrastmikroskopie." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Chromosomenpräparation unter hohem Druck. Mückenovarien sind im korrekten Entwicklungsstadium dargestellt.
<img alt="Probenmarkierung für die Chromosomenkartierung mit automatisierter Objektträger-Hybridisierung und Abtastmikroskop." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. Ein Schema, das die automatisierte FISH, die Objektträgerabtastung und die Chromosomenkartierung genomischer Scaffolds darstellt.
<img alt="Struktur der Polytänchromosomen, Mikroskopaufnahme, Analyse des DNA-Bandenmusters, genetische Forschung" src="/files/ftp_upload/4007/4007fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. Eine Ausbreitung des Polytänchromosoms 3 von An. gambiae, erhalten mit der Hochdrucktechnik. 3L und 3R markieren die linke bzw. rechte Chromosomenarme an ihren Telomeren. PH und IH zeigen perizentrische bzw. interkalar heterochromatische Regionen an.
<img alt="Mikroskopische Aufnahme zum Vergleich der Bandenmuster der 3R/3L-Chromosomen unter verschiedenen Druckbedingungen." src="/files/ftp_upload/4007/4007fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4. Vergleich von An. gambiae-Polytänchromosomen, die mit der traditionellen (oben) und der Hochdruckmethode (unten) präpariert wurden. Die Aufnahmen zeigen die Unterteilungen 29A–30E des Arms 3R (A) und 43D–46D des Arms 3L (B).
<img alt="Chromosomenkartierung, fluoreszierende Marker und genetische Loci auf Drosophila-Polytänchromosomen-Diagramm" src="/files/ftp_upload/4007/4007fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 5"> 
Abbildung 5. FISH von BAC-Klonen an Polytänchromosomen von An. gambiae. A) Hybridisierung von 102B24 (rotes Signal) mit dem 2R-Arm. B) Zweifarbige FISH von 102B24 (rotes Signal) und 142O19 (blaues Signal) an die Untereinteilungen 16C und 16D des gestreckten 2R-Arms. Pfeile zeigen die Hybridisierungssignale von BAC-Klonen, markiert mit Cy3 (rot) und Cy5 (blau). C – der zentromere Bereich. a/+ zeigt die heterozygote 2La-Inversion. Die Chromosomen wurden mit dem Fluorophor YOYO-1 kontrastgefärbt.

<ol><li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+10K%3A+a+proposal+to+obtain+whole-genome+sequence+for+10%2C000+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hered%22%5BJournal%5D)">Genome 10K: a proposal to obtain whole-genome sequence for 10,000 vertebrate species.</a> J. Hered. 100, 659-674 (2009).</li>
<li>Robinson, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creating+a+Buzz+About+Insect+Genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Creating a Buzz About Insect Genomes.</a> Science. 331, 1386-1386 (2011).</li>
<li>Project description at Broad Institute [Internet]. , The Eli and Edythe L. Broad Institute of Harvard and MIT. Cambridge, MA. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/">http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/anopheles/</a> (2012).</li>
<li>Besansky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Analysis+Of+Vectorial+Capacity+In+Major+Anopheles+Vectors+Of+Malaria+Parasites%5BTitle%5D)+AND+%22White+Paper%22%5BJournal%5D)">Genome Analysis Of Vectorial Capacity In Major Anopheles Vectors Of Malaria Parasites.</a> White Paper. , 1-15 (2008).</li>
<li>Alkan, C., Sajjadian, S., Eichler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+next-generation+genome+sequence+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Limitations of next-generation genome sequence assembly.</a> Nature. 8, 61-65 (2011).</li>
<li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+of+the+Anopheles+gambiae+PEST+genome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Update of the Anopheles gambiae PEST genome assembly.</a> Genome Biol. 8, R5(2007).</li>
<li>Lewin, H. A., Larkin, D. M., Pontius, J., O'Brien, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Every+genome+sequence+needs+a+good+map%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Every genome sequence needs a good map.</a> Genome Res. 19, 1925-1928 (2009).</li>
<li>Bhutkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+rearrangement+inferred+from+comparisons+of+12+Drosophila+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosomal rearrangement inferred from comparisons of 12 Drosophila genomes.</a> Genetics. 179, 1657-1680 (2008).</li>
<li>Novikov, D., Kireev, I., Belmont, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+treatment+of+polytene+chromosomes+improves+structural+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution.</a> Nature. 4, 483-485 (2007).</li>
<li>George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+cytogenetic+map+for+the+African+malaria+vector+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution cytogenetic map for the African malaria vector Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 19, 675-682 (2010).</li>
<li>FISH Complete Automation [Internet]. , Abbott Laboratories. Abbott Park, IL. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html">http://www.abbottmolecular.com/products/instrumentation-automation/fish/fish-automation.html</a> (2012).</li>
<li>The ACCORD system [Internet]. , BioView Ltd. Billerica, MA. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332">http://www.bioview.co.il/htmls/article.aspx?c0=12510&bsp=12332&bss53=12332</a> (2012).</li>
<li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+AN+%22The+Biology+of+Mosquitoes%3A+Development%2C+Nutrition+and+Reproduction%22">The Biology of Mosquitoes: Development, Nutrition and Reproduction</a>. , Chapman & Hall. (1992).</li>
<li>BLAST @ VectorBase.org [Internet]. , VectorBase.org. Notre Dame, IN. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/">http://agambiae.vectorbase.org/Tools/BLAST/</a> (2012).</li>
<li>Sharakhova, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaginal+discs--a+new+source+of+chromosomes+for+genome+mapping+of+the+yellow+fever+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl.+Trop.+Dis%22%5BJournal%5D)">Imaginal discs--a new source of chromosomes for genome mapping of the yellow fever mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e10(2011).</li>
<li>Scriven, P. N., Kirby, T. L., Ogilvie, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FISH+for+Pre-implantation+Genetic+Diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis.</a> J. Vis. Exp. (48), e2570(2011).</li>
<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Drosophila+Polytene+Chromosome+Squashes+for+Antibody+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling.</a> J. Vis. Exp. (36), e1748(2010).</li>
<li>Vatolina, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction%3A+Identical+Functional+Organization+of+Nonpolytene+and+Polytene+Chromosomes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Correction: Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li>
</ol>

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Der kritischste Schritt des Hochdruckverfahrens ist das sachgemäße Zerquetschen von isolierten Ovarnachzellen im Christophers-III-Stadium der Ovarentwicklung13. Eine unsachgemäße Zerquetschung kann zu unzureichend ausgebreiteten Chromosomen führen, was Probleme bei der Bestimmung der Sondenpositionen nach FISH verursachen kann. Werden die Chromosomen zu stark zerquetscht, können sie zerbrechen oder derart in die Länge gezogen werden, dass die Bandmuster verloren gehen. Die Herstellung mehrerer Objektträger führt zu einer konsistenteren Zerquetschung der Präparate mithilfe des Dremel-Werkzeugs, wodurch die Gesamteffizienz der Objektträgerherstellung steigt. Die Hochdrucktechnik wurde ursprünglich für frisch isolierte Speicheldrüsen von D. melanogaster9 entwickelt. Ovarien von Mücken werden jedoch routinemäßig in einer modifizierten Carnoy’schen Fixierlösung (3 Methanol : 1 Eisessig nach Volumen) konserviert, bevor sie für chromosomale Präparationen verwendet werden. Daher haben wir das bestehende Hochdruckprotokoll angepasst, um es für die fixierten polyten Chromosomen der Ovarnachzellen der Malariamücke An. gambiae geeignet zu machen. Da der hohe Druck mittels einer Präzisionsklemmbacke aufgebracht wird, die über eine hochgradig parallele Arbeitsfläche über den gesamten Objektträger verfügt, ist die Herstellung der Chromosomenpräparation deutlich schneller als mit der traditionellen Klopftechnik unter Verwendung eines Radiergummis eines Bleistifts.
Weitere wichtige Schritte umfassen das ausreichende Einweichen der Follikel in 50%iger Propionsäure und das Erhitzen des Objektträgers. Beide Schritte sind entscheidend, um die Chromosomen zu entfalten. Werden sie vernachlässigt, können die Chromosomen nach der Dehydrierung glänzend erscheinen, was zu einer übermäßigen Hintergrundfärbung führen kann, die fälschlicherweise als Signal in der FISH interpretiert wird. Die Hochdruck-Präparationstechnik funktioniert ebenfalls gut mit denselben Lösungen bei der Herstellung von mitotischen Chromosomenpräparationen. Die zusätzliche Ausbreitung und Flachdrückung trägt dazu bei, die Chromosomen besser aus ihren Kernen herauszulösen. Durch gleichmäßigen Druck werden sie entsprechend geebnet, was Messungen und möglicherweise eine verbesserte Auflösung der durch Färbung sichtbaren Banden ermöglicht. Die Einzelheiten zur Isolierung mitotischer Chromosomen aus Mücken sind an anderer Stelle beschrieben15. Obwohl herkömmliche Präparationen durch Quetschen für viele Zwecke ausreichend sind, einschließlich FISH 16 und Immunfärbungen17, verringert die Hochdruckmethode nicht nur die potenzielle Variabilität von Objektträger zu Objektträger, sondern verbessert auch die Gesamtqualität der Chromosomen, was zu einer höheren Detailgenauigkeit bei der Kartierung führt. Dieses Verfahren kann ebenfalls zur Herstellung von Polytänchromosomen-Membranpräparaten für die Laser-Mikrodissektion verwendet werden.
Zu den Einschränkungen der Hochdruckmethode gehören das Zerbrechen der Objektträger und eine übermäßige Dehnung der Chromosomen. Das Zerbrechen der Objektträger kann auftreten, wenn durch den Schraubstock zu großer Druck auf den Objektträger ausgeübt wird; dies lässt sich jedoch durch die im Artikel angegebenen Druckwerte begrenzen. Bei einer übermäßigen Dehnung der Chromosomen besteht die Möglichkeit, dass diese zu stark auseinandergezogen werden und an Auflösung verlieren, falls das Dremel-Gerät über einen längeren Zeitraum auf den Objektträger angewendet wird. Dies kann behoben werden, indem das Gerät nur kurz eingesetzt, anschließend unter dem Mikroskop überprüft und gegebenenfalls bei unzureichender Verteilung der Chromosomen erneut mit dem Dremel-Gerät nachgearbeitet wird.
Ein herkömmliches FISH-Protokoll umfasst eine Reihe von Wasch- und Inkubationsschritten, die gewöhnlich 5–20 Minuten dauern und während der gesamten Versuchsdauer nahezu die volle Aufmerksamkeit eines Forschenden erfordern. Zudem ist die Anzahl der manuell bearbeitbaren Objektträger in einem gegebenen Experiment meist auf wenige Objektträger begrenzt. Im Gegensatz dazu führt ein automatisiertes Färbegerät alle Schritte (einschließlich Waschen, Inkubation, Probenauftrag, Denaturierung, Hybridisierung, Aufbringen und Entfernen der Deckgläser) automatisch durch. Dadurch werden im FISH-Experiment bis zu 6–8 Arbeitsstunden pro Forschenden freigesetzt. Außerdem kann ein automatisiertes FISH-System die Durchsatzleistung erheblich steigern. Beispielsweise ist das Xmatrx-System in der Lage, gleichzeitig bis zu 40 Assays auf Einzelpräparations-Objektträgern und bis zu 80 Assays auf Doppelpräparations-Objektträgern zu bearbeiten. Zu den Einschränkungen dieses Systems gehört, dass es bei einer geringen Anzahl von FISH-Experimenten nicht effizient ist, da große Lösungsvolumina vorbereitet werden müssen. Außerdem kann das im System programmierte FISH-Protokoll für neue Anwendungen Modifikationen und Anpassungen erfordern.
Ein Slide-Scanning-System ist eine automatisierte Version eines fluoreszierenden Mikroskops. Durch die automatische Verstellung des Objekttisches und ein einfaches Mikroskop-Bedienfeld wird die Forscherzeit entlastet und die Bedienung des Mikroskops äußerst vereinfacht. Beispielsweise ermöglicht die Software des ACCORD-PLUS-Scanning-Systems eine einfache Aufnahme mehrerer Fluoreszenzkanäle sowie eine übersichtliche Verwaltung der Bildakquisition. Ein Beispiel hierfür ist die Möglichkeit, statt einer Einzelaufnahme einen Z-Stack aufzunehmen; die Software erfasst dabei einen konfigurierbaren Stapel von Z-Aufnahmen, um sicherzustellen, dass mindestens ein Bild scharf bleibt. Obwohl dieses System vor allem für die Mehrfachbildaufnahme konzipiert ist (viele Zellen auf einem Objektträger), erleichtert es dennoch das Auffinden von Chromosomen auf dem Objektträger im Vergleich zur manuellen Durchsuchung erheblich.
Sowohl das automatisierte Objektträger-Färbungssystem als auch das Scansystem werden routinemäßig in zytogenetischen Laboren für die FISH-Diagnostik chromosomaler Abnormalitäten in menschlichen Zellen eingesetzt. In dieser Studie haben wir ein Protokoll entwickelt, das diese automatisierten Systeme für eine grundlegende Forschungsanwendung nutzt. Das automatisierte Hochdurchsatz-Verfahren zur physikalischen Kartierung kann die schnelle Erstellung physikalischer Chromosomenkarten für jede interessierende Spezies erleichtern. Obwohl wir in diesem Bericht polytäne Chromosomen für die physikalische Kartierung verwendet haben, können auch mitotische Chromosomen mit diesen Systemen eingesetzt werden. Es wäre sinnvoll, das Protokoll an mitotische Chromosomen anzupassen, da die Mehrheit der Organismen keine auswertbaren polytänen Chromosomen ausbildet. Allerdings können polytäne Chromosomen, falls verfügbar, nützliche Informationen über die Zuordnung funktioneller Genomdomänen zur Chromosomenstruktur mit höchster Auflösung liefern. Die organisationsprinzipien polytäner Chromosomen, wie Banden- und Interbandenmuster, wurden kürzlich mit denen regulärer nicht-polytäner (Interphase-)Chromosomen verglichen18. Daher besteht das Potenzial, durch detaillierte physikalische Kartierung an hochkomprimierten Chromosomenpräparationen DNA-Sequenzen spezifischen chromosomalen Strukturen wie Banden, Interbanden, Puffs, Zentromeren, Telomeren und Heterochromatin zuzuordnen und somit chromosomenbasierte Genom-Assemblys zu erstellen.

<table><tbody><tr><td>22x22 mm Mikroskop-Deckgläser</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm Mikroskop-Deckgläser</td><td>Fisher</td><td>12-553-402</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>Propionsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 200 Rotationstool mit Flexwellen-Aufsatz</td><td>Rand</td><td></td><td>3&quot; Multifunktions-Mini-Schleifbock (mit Drehzahlbegrenzer)</td></tr><tr><td>Speziell konstruierte 200 &amp;mu;l Kunststoffspitzen (mit geriffelten Kunststoffkanten) für Dremel-Tool</td><td>Pipetman</td><td>F171300</td><td>Schneiden und erhitzen Sie das dicke Ende der Pipettenspitzen</td></tr><tr><td>Zinnbeschichteter Schnellspannbacken-Reiter</td><td>Avenger Gold Toolmaker</td><td>MTC-200-1</td><td>Präzisionsgeschliffen, quadratisch und parallel innerhalb von 0,00025</td></tr><tr><td>Drehmomentschlüssel</td><td>Craftsman</td><td>44593</td><td></td></tr><tr><td>ThermoBrite Objektträger-Denaturierungs-/Hybridisierungssystem</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Barrier-Objektträger</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT108-SL</td><td></td></tr><tr><td>25 mm Deckgläser</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT122-90X</td><td></td></tr><tr><td>Xmatrx Automatisiertes Objektträger-Färbungssystem</td><td>Abbott Molecular</td><td>08L46-001</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Leica Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>Ein anderes Stereomikroskop kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Olympus CX41 Phasenkontrastmikroskop</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>Ein anderes Phasenkontrastmikroskop kann verwendet werden</td></tr><tr><td>ACCORD PLUS Automatisiertes Scansystem</td><td>BioView (USA)</td><td>BV-5000-ACCP</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>10 % NBF (neutral gepuffertes Formalin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>99 % Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>Dextran-Sulfat-Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC-Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>1 mM YOYO-1-Iodid (491/509) Lösung in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade-Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DNAPolymerase I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput-physikalische kartierung von chromosomen unter verwendung von automated<em&gt; in-situ-</em&gt; hybridisierung

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Es wird erwartet, dass Projekte zur Gewinnung von Ganzgenomsequenzen für 10.000 Wirbeltierarten1 und für 5.000 Insekten- und verwandte Arthropodenarten2 in den nächsten 5 Jahren durchgeführt werden. Beispielsweise erfolgt derzeit die Sequenzierung der Genome von 15 Malaria-Mückearten mithilfe einer Illumina-Plattform3,4. Dieser Anopheles-Artkomplex umfasst sowohl Vektoren als auch Nicht-Vektoren der Malaria. Sobald die Genomzusammenstellungen verfügbar sind, werden Forscher die einzigartige Gelegenheit haben, vergleichende Analysen durchzuführen, um evolutionäre Veränderungen im Hinblick auf die Vektorfähigkeit abzuleiten. Es hat sich jedoch als schwierig erwiesen, Sequenzierungsdaten der nächsten Generation für die Erstellung hochwertiger de-novo-Genomzusammenstellungen zu nutzen5. Zudem weisen die bisher verfügbaren Genomzusammenstellungen von Anopheles gambiae, obwohl sie mit der Sanger-Methode gewonnen wurden, Lücken oder Fragmentierungen auf4,6.
Der Erfolg vergleichender genomischer Analysen wird begrenzt sein, wenn Forscher mit zahlreichen Sequenzierungs-Contigs anstelle chromosomenbasierter Genom-Assemblys arbeiten. Fragmentierte, nicht zugeordnete Sequenzen verursachen Probleme für genomische Analysen, weil: (i) nicht identifizierte Lücken zu fehlerhaften oder unvollständigen Annotationen genomischer Sequenzen führen; (ii) nicht zugeordnete Sequenzen zu Verwechslungen zwischen paralogen Genen und Genen aus unterschiedlichen Haplotypen führen; und (iii) das Fehlen einer Chromosomenzuordnung und -orientierung der Sequenzierungs-Contigs die Rekonstruktion einer Rearrangements-Phylogenie und die Untersuchung der Chromosomenevolution unmöglich macht. Die Erstellung hochauflösender physikalischer Karten für Arten mit neu sequenzierten Genomen stellt eine zeitgemäße und kosteneffiziente Investition dar, die die Genomannotation, die evolutionäre Analyse sowie die Neusequenzierung individueller Genome aus natürlichen Populationen erleichtern wird7,8.
Hier stellen wir innovative Ansätze zur Chromosomenpräparation, zur fluoreszenzmarkierten in situ-Hybridisierung (FISH) und zur Bildgebung vor, die die schnelle Erstellung physikalischer Karten ermöglichen. Am Beispiel von An. gambiae zeigen wir, dass die Erstellung physikalischer Chromosomenkarten die Genom-Assemblys und damit die Qualität genomischer Analysen potenziell verbessern kann. Zunächst verwenden wir eine Hochdruckmethode zur Herstellung von Polytänchromosomenpräparaten. Diese Methode, ursprünglich für Drosophila9 entwickelt, ermöglicht es dem Anwender, mehr Details an den Chromosomen sichtbar zu machen als mit der herkömmlichen Quetschtechnik10. Zweitens kommt ein vollautomatisiertes Frontend-System für FISH zur Anwendung, das eine hochdurchsatzfähige physikalische Genomkartierung ermöglicht. Das automatisierte Objektträger-Färbungssystem führt mehrere Assays gleichzeitig durch und reduziert die manuelle Arbeitszeit erheblich11. Drittens scannt und fotografiert ein automatisiertes fluoreszierendes Bildgebungssystem, das einen motorisierten Objektträgertisch enthält, nach der FISH-Methode markierte Chromosomen automatisch12. Dieses System ist besonders nützlich, um mehrere chromosomale Platten auf demselben Objektträger zu identifizieren und sichtbar zu machen. Außerdem gewährleistet der Abtastprozess ein gleichmäßigeres FISH-Ergebnis. Insgesamt ist das automatisierte, hochdurchsatzfähige Verfahren zur physikalischen Kartierung effizienter als ein herkömmliches manuelles Protokoll.

Genom-Assemblys, die auf massiv parallelen DNA-Sequenzierungstechnologien basieren, sind gewöhnlich stark fragmentiert. Die Erstellung physikalischer Chromosomenkarten kann die Genom-Assemblys möglicherweise verbessern. Hier demonstrieren wir innovative Ansätze zur Chromosomenpräparation, zur fluoreszenzmarkierten in situ-Hybridisierung und zur Bildgebung, die den Durchsatz bei der Entwicklung physikalischer Karten erheblich steigern.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung

Projekte zur Gewinnung von Vollgenomsequenzen für 10.000 Wirbeltierarten1 sowie für 5.000 Insekten- und verwandte Arthropodenarten2 werden voraussichtlich durchgeführt ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, DNA-Sonden mithilfe einer Chromosomenpräparation unter hohem Druck an Polytänchromosomen von Mücken zu koppeln, gefolgt von einer automatisierten fluoreszenten in-situ-Hybridisierung und automatisierten Bildgebung. Dies wird erreicht, indem zunächst Polytänchromosomenpräparationen mit einer Methode unter hohem Druck erstellt werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, fluoreszierende Sonden herzustellen, indem genomische DNA mittels eines Nick-Übersetzungsprotokolls mit einem Fluorochrom markiert wird.Der dritte Schritt besteht darin, eine fluoreszente in-situ-Hybridisierung unter Verwendung automatisierter Objektträger-Färbungssysteme durchzuführen. Der letzte Schritt ist das Scannen und Fotografieren markierter Chromosomen mittels eines automatischen fluoreszenzbasierten Bildgebungssystems. Letztendlich können die Bilder die Lokalisation einer fluoreszenzmarkierten DNA-Sonde am Polychromosom zeigen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie einem standardmäßigen manuellen In-situ-Hybridisierungsprotokoll, liegt darin, dass das Hochdurchsatz-physikalische Kartierungsprotokoll konsistentere Ergebnisse liefert und die manuelle Arbeitszeit erheblich verkürzt. Dieses Protokoll beginnt damit, dass halbe Gravitations- und Oly-Weibchen etwa 25 Stunden nach der Blutmahlzeit seziert werden, um ihre Ovarien im Christopher-Stadium drei zu sammeln. In diesem Stadium sollte der transparente Bereich mit den Nährzellen innerhalb der Follikel eine runde Form aufweisen. Sammeln Sie Ovarien von fünf Weibchen und fixieren Sie sie in 500 µL frisch hergestellter modifizierter Car-Noise-Lösung.Sie können dann bis zu 24 Stunden bei Raumtemperatur oder länger bei minus 20 Grad Celsius gelagert werden. Bereiten Sie anschließend unmittelbar vor der Herstellung von Ovarpräparaten die Carnoysche Lösung und 50 %ige Propionsäure vor. Geben Sie jedes Ovarpaar in einen Tropfen frischer Carnoyscher Lösung auf einem staubfreien Objektträger unter einem Stereomikroskop.Teilen Sie die Eierstöcke mit der Präpariernadel. Überführen Sie alle Eierstockstücke auf sechs saubere Objektträger mit 50 % Propionsäure. Trennen Sie die Follikel untereinander mithilfe von Präpariernadeln voneinander.Danach alle verbleibenden Gewebestücke mit einem Papiertuch abwischen. Einen weiteren Tropfen 50% Proponic acid hinzufügen und drei bis fünf Minuten warten. Nachweislich verbessert die Einwirkung der Follikel auf 50% Proponic acid für drei bis fünf Minuten signifikant die Chromosomenausbreitung.Als Nächstes ein Deckglas aufsetzen und weitere Minute warten, um die Kerne zu verteilen. Die Objektplatte mit Filterpapier und Plastik umwickeln. Ein Dremel auf zwischen 3.000 und 5.000 U/min einstellen und etwa eine Minute lang die rotierende Dremel-Spitze leicht gegen das Deckglas kreisen lassen.Überprüfen Sie die Ausbreitungsqualität mit einem Phasenmikroskop und wenden Sie den Dremel gegebenenfalls länger an, um die Chromosomen zu glätten. Platzieren Sie einen zweiten Deckelobjektträger neben dem ersten und betten Sie die Deckelobjektträger durch einen weiteren Mikroskopobjektträger ein. Wickeln Sie die Objektträger anschließend mit einer Plastikfolie und Filterpapier ein, und legen Sie die verpackten Objektträger in einen Schraubstock, um sie auf 85 bis 120 Zollpfund zu komprimieren.Nachdem die Chromosomen auf allen sechs Objektträgern abgeflacht wurden, nehmen Sie die Objektträger aus der Verpackung und entfernen Sie die zusätzlichen Objektträger, um die Chromosomen weiter zu entfalten. Inkubieren Sie die Objektträger 10 bis 15 Minuten lang bei 55 Grad Celsius in einem System zur Denaturierung und Hybridisierung von Objektträgern. Tauchen Sie anschließend einen Objektträger mindestens 15 Sekunden lang oder bis zum Ende der Blasenbildung in flüssigen Stickstoff ein.Entfernen Sie dann schnell die Deckglas mit einem Rasiermesser und legen Sie die Probe sofort für fünf Minuten in kalten 50 %igen Ethanol. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Probe nacheinander. Dehydrieren Sie die Proben durch eine Reihe von Ethanolbädern mit 70 %, 90 % und 100 % Ethanol.Legen Sie sie in jedes Bad für fünf Minuten ein. Schließlich, nachdem die Objektträger an der Luft getrocknet sind, sind sie bereit für die FISH-Färbung. Eine automatisierte Vorrichtung führt die meisten Schritte des Verfahrens durch, mit Ausnahme der Sondemarkierung.Bevor Sie das Gerät beladen, bereiten Sie die fluoreszierende Sonde vor, indem Sie die DNA mit dem Fluorochrom gemäß einem kommerziellen NIC-Übersetzungsprotokoll markieren. Nachdem die Sonde hergestellt ist, laden Sie die Objektträger und Reagenzien in das automatisierte System für Objektträger und programmieren Sie das System, die folgenden Schritte durchzuführen. Zuerst geben Sie 800 Mikroliter eines 1x PBS für 20 Minuten zu.Zweitens die Objektträger trocken föhnen. Drittens die Objektträger mit 450 µL 4 % Formalin in 1× PBS für eine Minute fixieren. Anschließend die Objektträger zweimal für jeweils eine Sekunde und einmal für zwei Minuten mit 100 % Ethanol waschen.Nach dem Ethanoleinsatz die Objektträger erneut mit einem Gebläse trocknen. Anschließend die Objektträger zur Vermeidung von Blasenbildung zwei Minuten lang bei 45 Grad Celsius erhitzen. Danach 20 Mikroliter der DNA-Sonde auftragen, gefolgt von einem Tropfen Paraffinöl und einem Deckglas. Danach die Chromosomen bei 90 Grad Celsius zehn Minuten lang behandeln.Dann die Objektträger für 14 Stunden bei 42 Grad Celsius hybridisieren lassen. Nach der Hybridisierung die Stringenzwäschen zweimal für jeweils zwei Minuten bei 42 Grad Celsius durchführen, gefolgt von vier aufeinanderfolgenden einsekündigen Anwendungen von zwei XSSC und Trocknen. Anschließend zweimal je 800 Mikroliter 0,4 XSSC bei 42 Grad Celsius für 10 Minuten zugeben, gefolgt von einer weiteren Wäsche und einer Wäsche mit zwei XSSC bei 25 Grad Celsius für 10 Minuten.Tragen Sie nun 50 Mikroliter Yo-Yo-1-Färbemittel auf, gefolgt von Mineralspindel und Deckgläsern. Inkubieren Sie die Objektträger bei 25 Grad Celsius für 10 Minuten. Anschließend entfernen Sie die Deckgläser.Die Objektträger viermal jeweils eine Sekunde lang in zwei XSSC waschen und die Objektträger anschließend trockenblasen. Abschließend 15 Mikroliter eines prolongierten Gold-Anti-Fade-Reagenz auf jeden Objektträger geben und neue Deckgläser aufsetzen. Das automatisierte Scansystem Accord plus einschalten, beginnend mit der Olympus U-R-F-L-T-Netzversorgung für eine Halogenlampe. Danach der Computer und schließlich das Mikroskop mit einer Kameraanbindung. Öffnen Sie nun zuerst das Duet-Softwarepaket, richten Sie eine 10×-Vorscan-Einstellung ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche „Online“, geben Sie eine neue Fall-ID ein und weisen Sie eine Objektträger-ID zu.Klicken Sie auf den Punkt mit der Bezeichnung bf. Dies ist die Hellfeld-Option. Wählen Sie eine Scan-Option für den Vorscan mit 10×.Wählen Sie 2, 500 x Kreis, 10.000 x Kreis oder Rechteck. Klicken Sie auf „Setzen“ und „Ausführen“. Befolgen Sie dann die Aufforderungen, um den Scanvorgang korrekt anzupassen, und klicken Sie anschließend auf „Fertig“.Um den Scan zu starten, drücken Sie die Haupt-Registerkarte, um zum Hauptbildschirm zurückzukehren. Klicken Sie nun auf die Offline-Schaltfläche, suchen Sie die zugewiesene Fall-ID und Objektträger-ID und klicken Sie auf Offline.Scannen Sie das schwarze Feld im oberen linken Bereich ein. Klicken Sie auf einen Pfeil und wählen Sie 10x-Vorscan. Verwenden Sie die Pfeile, um nach dem Auffinden eines interessanten Bildes durch die gescannten Bilder zu navigieren.Doppelklicken Sie auf den Bildschirm in der Mitte des Zielbereichs und drücken Sie „Snap“. Dadurch wird ein Bild für die Aufnahme festgelegt, nachdem alle Ziele ausgewählt wurden. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf jedes Bild, wählen Sie „Classify“, dann „10x Pre-Scan“ und anschließend „Polytan“.Zurück zum Hauptmenü und Einrichten des 40×-Vorscans. Wählen Sie erneut Online und wählen Sie einen Objektträger aus. Ändern Sie HFD in ffl und ändern Sie den Aufgabennamen in erneuter Besuch Strich X 40 Strich rg.Ändern Sie den Abschnitt direkt unter der letzten Einstellung, um alle Striche erneut zu besuchen. Führen Sie dann das Programm aus und folgen Sie den Anweisungen. Um die Automatisierung einzurichten, klicken Sie auf die Schaltfläche „Start Matching Views“, um die Bilder mit 10× und 40× zu vergleichen.Klicken Sie auf „Fertig stellen“, um den Scan zu starten. Danach klicken Sie auf „Klassifizieren“ und betrachten die Bilder. Präparationen von Polytänchromosomen aus ovarialen Pflegezellen weiblicher Anomalie-Gambia wurden mit der Hochdrucktechnik hergestellt.Diese Methode beschädigt oder verändert die meisten Chromosomenstrukturen nicht. Sie glättet gebogene Chromosomen und macht dadurch versteckte Feinbanden sichtbar, die auf herkömmlichen Präparationen nicht zu erkennen sind. Das Chromosom wurde mit rückwärts gerichteten DNA-Klonen aus der Anomalie S Gambia nd Tam Rückbibliothek sondiert.Die Bibliothek wurde aus männlichen und weiblichen ersten Stern-Larven des Anomalie-S.-gambiae-Peststammes erzeugt. Mithilfe dieses Verfahrens kann eine automatisierte, hochdurchsatzfähige physikalische Kartierung durchgeführt werden, um die schnelle Entwicklung chromosomenbasierter Genom-Assemblys zu erleichtern.

high-throughput-physical-mapping-chromosomes-using-automated-situ

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Chromosomics: Erkennung von numerischen und strukturellen Veränderungen in alle 24 menschlichen Chromosomen gleichzeitig unter Verwendung eines neuartigen OctoChrome FISH-Test

Ein quantitatives Verfahren zur Analyse von Chromosomenreplikation Timing beschrieben. Das Verfahren nutzt BrdU Inkorporation in Kombination mit...

Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) erlaubt den Nachweis von Nukleinsäuren in ihrer natürlichen Umgebung innerhalb der Zellen. Wir beschreiben ein Protokoll für den kombinierten, gleichzeitigen Nachweis von RNA und DNA mit Hilfe von FISH, die verwendet werden können, um X-Chromosom Inaktivierung in embryonalen Maus-Stammzellen zu untersuchen.

Kombinierte DNA-RNA-Leuchtstoff<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung (FISH) zu X-Chromosom-Inaktivierung in Differenzierte Weiblich embryonalen Stammzellen der Maus Studieren

Methoden zur Kartierung von Protein-DNA-Interaktionen in vivo werden für jeden Aspekt der Genomforschung immer wichtiger, aber sie sind mühsam, kostspielig und zeitaufwändig. Hier wird ein kommerziell verfügbares robotisches Liquid-Handling-System vorgestellt, das die Chromatin-Immunpräzipitation automatisiert, um in vivo Protein-DNA-Wechselwirkungen mit begrenzten Zellmengen abzubilden.

Automatisierung von ChIP-seq Experimente Epigenetische Profile auf 10.000 HeLa-Zellen zu generieren

Hier stellen wir eine einfache Methode zur Durchführung einer Fluoreszenz-DNA-In-situ-Hybridisierung (DNA ISH) vor, um sich wiederholende heterochromatische Sequenzen auf Objektträger-montierten Chromosomen zu visualisieren. Die Methode benötigt nur minimale Reagenzien und ist vielseitig einsetzbar für kurze oder lange Sonden, verschiedene Gewebe und den Nachweis mit Fluoreszenz- oder nicht-fluoreszenzbasierten Signalen.

Einfache Methode zur Fluoreszenz DNA<em&gt; In-situ-</em&gt; Die Hybridisierung an Squashed Chromosomen

Dieses Manuskript stellt eine detaillierte Methode zur Erzeugung von X-Chromosom Arm Sonden und darstellende Fluoreszenz in Situ Hybridisierung (FISH) zu prüfen, den Zustand der Schwester Chromatids Zusammenhalt im prometaphase und Metaphase ich verhaftet  Drosophila Eizellen. Dieses Protokoll eignet sich zur Feststellung, ob meiotische Arm Zusammenhalt intakt oder in verschiedenen Genotypen gestört ist.

Fluoreszenz In Situ Hybridisierung (FISH) verwenden, um den Zustand der Arm Zusammenhalt im Prometaphase und Metaphase überwachen ich Drosophila Eizellen

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Identifizierung von homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern blotting und/oder PCR. Diese Methode ist durch die Generierung von Nonmuscle Myosin II genetische Ersatz Mausmodellen mit traditionellen embryonalen Stammzell-basierte homologe Rekombination-vermittelten targeting-Technologie veranschaulicht.

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Dieses Protokoll stellt eine Technik zur hochauflösenden Kartierung von Replikationsstellen in strukturell konserviertem Chromatin in situ vor, die eine Kombination aus voreingebetteter EdU-Streptatvid-Nanogold-Markierung und ChromEMT verwendet.

Abbildung replikativer Domänen in ultrastrukturell konserviertem Chromatin mittels Elektronentomographie

Wir berichten über ein DNA-FISH-Metaphasen-Spread-Protokoll, das die Locus-Kopiennummer und -Position im Genom visuell erkennt. Dieser Ansatz ermöglicht die Einzelzellauflösung von Amplifikationszuständen, insbesondere in Krebszelllinien mit extrachromosomaler DNA und homogen gefärbten Regionen.

Die DNA-FISH-Metaphase breitet sich aus, um extrachromosomale DNA von homogen färbenden Regionen in menschlichen Krebszelllinien zu unterscheiden

Erfahren Sie die automatisierte hochdurchsatz-physikalische Kartierung von Chromosomen bei Mücken mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung. Diese Methode verbessert Effizienz und Konsistenz bei der Entwicklung genomischer Karten erheblich.

High-Throughput-Physikalische Kartierung von Chromosomen unter Verwendung von Automated

Weitere Videos entdecken