A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Ziel dieses Verfahrens ist es, quantitative mikrobielle Kulturqualitäten parallel auf einer genomweiten Skala präzise und mit hohem Durchsatz zu erfassen. Dies wird durch erstes Turing und eine Array-Bibliothek von mikrobiellen Kolonien in 96-Well-Platten erreicht und die Kultur bis zur Sättigung gezüchtet. Anschließend werden die gesättigten Kulturen in Wasser verdünnt und dann auf feste Agarplatten getupft.

Dann werden die festen Platten periodisch und so lange fotografiert, bis das Wachstum der mikrobiellen Kolonie gesättigt ist. Schließlich werden die Zeitverlaufsfotos des Wachstums jeder Kultur in quantitative Messungen der Zelldichte umgewandelt und die beobachteten Wachstumskurven mit Wachstumsmodellen und quantitativen Messungen der mikrobiellen Fitness zusammengefasst. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Hinweise auf genetische Wechselwirkungen liefern, indem gezeigt wird, dass mikrobielle Stämme unterschiedliche Eigenschaften aufweisen, entweder wenn sie mit unterschiedlichen Mutationen kombiniert oder unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie High-Density-Pinning-Methoden wie SGA oder Barcode-Wettbewerbsexperimenten besteht darin, dass Fitnessmessungen genauer sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklung von Krebsmedikamenten zu beantworten, z. B. welche Gene und Prozesse für die Reaktion auf DNA-Schäden und die Kontrolle des Zellzyklus wichtig sind, sowie das Verständnis und die Übersetzung solcher Forschungsergebnisse und grundlegender Mikroorganismen in Form potenzieller Wirkstoffziele in menschlichen Krebszellen. Diese Methode kann jedoch Einblicke in die Funktion und Sichtbarkeit der Telomere geben.

Es kann auch auf andere Bereiche der Hefebiologie oder auf jeden Bereich angewendet werden, in dem Fitness-Phänotypen Einblicke in die mikrobielle Biologie geben können. Wir hoffen, dass QFA auf viele andere mikrobielle Organismen angewendet werden kann, für die es Array-Bibliotheken gibt. Zum Beispiel, Povi e coli, Orilla-Überschuss Ausgehend von gesättigten Übernachtkulturen spielten bis zu 96 unabhängige Hefestämme in 200 Mikroliter Volumen reichhaltiges flüssiges Medium.

In einer 96-Well-Kulturschale sterilisieren Sie einen manuellen Nachbauplatten mit 96-Pin-Durchmesser, indem Sie ihn zuerst in 100 % Ethanol tauchen, dann abflammen und abkühlen lassen, 200 Mikroliter steriles Wasser in den Vertiefungen eines 96-Well-Plattenwirbels hat Hefekulturen gesättigt und verdünnen durch dreimaliges Eintauchen des sterilisierten Stiftwerkzeugs in die Stämme. Sobald Sie es in die Platte mit dem Wasser gegeben haben, sterilisieren Sie das Stiftwerkzeug und lassen Sie es abkühlen, bevor Sie es dreimal in die verdünnten Kulturen tauchen. Übertragen Sie dann die Nadel auf eine feste Agarplatte.

Verwenden Sie nach dem Inkubieren der Agarplatten einen SP-Imager von s und p robotics, um sie für die automatisierte Kultivierung manuell abzubilden. Beginnen Sie mit einer rechteckigen Anordnung unabhängiger Hefestämme, die auf festem Agar wachsen. In diesem Beispiel sind die Startstämme das Ergebnis der Kreuzung einer temperaturempfindlichen Abfragemutation mit der Hefedeletionssammlung.

1.536 Kulturen, die vier Replikate von 384 unabhängigen Hefestämmen repräsentieren, werden auf SGA-Platten gezüchtet, wobei ein Roboter mit einem sterilen Stiftwerkzeug mit einem Durchmesser von 96 Stiften und einem Millimeter verwendet wird, das 384 der 1.536 Stämme in 4 96 überträgt. Well-Kulturplatten mit 200 Mikrolitern Selektivmedium züchten die Kulturen bei 20 Grad Celsius bis zur Sättigung. Um die gesättigten Hefekulturen zu erkennen, übertragen Sie sie zunächst auf einen Liquid-Handling-Roboter, und Resus suspendiert sie auf einem magnetischen Shaker, verdünnen Sie die Kulturen auf etwa eins bis 70, indem Sie ein steriles 96-Pin-Roboter-Pin-Tool verwenden, um es in 200 Mikroliter steriles Wasser zu pinnen.

Nachdem Sie das Stiftwerkzeug gereinigt und sterilisiert haben, tupfen Sie die verdünnten Kulturen auf Agarplatten. Beim 384-Well-Format werden die Platten in einen temperaturgesteuerten, befeuchteten Inkubator mit automatischem Karussell und Zugangsluke übertragen. Um die Kulturen abzubilden, verwenden Sie einen robotergestützten automatischen Imager, der die Platten wiederholt aus dem Inkubator nimmt, die Deckel entfernt, sie in einen gleichmäßig beleuchteten Raum unter einer 35-Millimeter-Kamera überträgt und ein Bild bei 5.184 x 3.456 aufnimmt.

Bei der Pixelauflösung wird der Deckel ausgetauscht und dann wieder in das Inkubatorkarussell zurückgeführt, um die Kulturpositionen auf den Platten und die darauf angewendeten Behandlungen zu verfolgen. Die Platten werden automatisch mit einem Barcode entsprechend dem Namen des Inkubators, der Temperatur, der eindeutigen sequenziellen Chargennummer und der Position im Inkubator versehen. Bildnamen sind eine Verkettung aus dem Plattennamen und dem Zeitstempel und werden bei der Bildaufnahme automatisch generiert.

Die Platten werden oft auch manuell beschriftet, um sicherzustellen, dass sie beim Transfer zwischen Roboterkarussells in der gleichen Reihenfolge bleiben. Bei den Metadatendateien handelt es sich um tabulatorgetrennte Textdateien, die manuell generiert werden. Die experimentelle Beschreibungsdatei FT zwei.

Tabelle eins ist für jedes Experiment einzigartig, aber die Bibliotheksbeschreibung FT drei, Tabelle eins kann umfassend wiederverwendet werden. Nach der Konstruktion wird das Experiment in der experimentellen Beschreibungsdatei FT beschrieben: zwei Tabellen mit Spalten für den Barcode oder automatisch generierte Plattennamen, Experiment, Startzeitstempel, Plattenbehandlung, Inhalt des festen Agarmediums, Bildschirmname, Bibliotheksplattennummer für Bibliotheken mit mehreren Platten und eine Wiederholungsquadrantennummer für das Herunterskalieren von 1.536, Well-Format auf 384. Die e-Stammbibliothek wird mit einer Bibliotheksbeschreibungsdatei FT drei beschrieben, wobei die erste Tabelle den Genotyp angibt, der an jedem Kulturstandort gezüchtet wurde.

In jedem Schild einer Bibliothek enthält es die Spalten vier, den Bibliotheksnamen, den ORF, das Nummernschild des Blechs, die Spalte für das Zeilenschild und eine optionale Spalte für Notizen. Eine optionale Standard-Gennamensdatei kann FT vier bereitgestellt werden, wobei Tabelle eins den Standardgennamen beschreibt, der mit jeder systematischen ORFY-Nummer assoziiert ist, und die zu untersuchenden Stämme identifiziert. Diese Datei enthält zwei Spalten, ORF und Genname für die Analyse der Daten.

Der QFA-Rechenworkflow erfordert den Zugriff auf eine einigermaßen leistungsfähige Multi-Core-Computer-Workstation, auf der installiert ist. Die Bildanalyse-Software für Kolonierer und das QFAR-Paket, die beide online dokumentiert sind, sind frei verfügbar und laufen auf einer Reihe von Betriebssystemen. Führen Sie den Kolonisator mit jedem der erfassten Plattenbilder als Eingabe aus, um eine Kolonisator-Ausgabedatei FT fünf zu generieren, Tabelle eins für jedes erfasste Bild, Kolonisator-Ausgabedateien, geben Sie Schätzungen der Kulturdichte, Kultur, Fläche, Form und Farbe an.

Für jede der 384 Positionen auf der Imageplatte wird automatisch ein Name der Ausgabedatei aus dem Namen der Quellbilddatei kopiert. Das QFAR-Paket enthält die Funktionen seldens to time courses für jede Kultur, um verallgemeinerte logistische Populationsmodelle an Beobachtungen anzupassen und zu plotten. Beide siehe Beispiele in den Abbildungen zwei und drei.

Angepasste Parameterwerte werden in QFA logistische Parameterdateien geschrieben. Das QFAR-Paket enthält auch Funktionen zur Qualitätskontrolle. Randkolonien werden aufgrund der größeren Verfügbarkeit von Nährstoffen an den Plattenrändern und der Schwierigkeit der Bildanalyse verworfen.

In der Nähe von Plattenwänden und Kulturen, die die SGA nicht bestanden haben, und Genotypen, die eine Verknüpfung mit screenspezifischen Markergenen aufweisen, werden aus der Analyse entfernt. Für jede Kultur werden mehrere quantitative Fitnessmaße aus logistischen Populationsmodellparametern abgeleitet. Dazu gehören die maximalen Verdopplungsraten der Population und die Anzahl der Divisionen von der Impfung bis zur Sättigung für jeden Satz von Replikatkulturen und für jede Fitnessdefinition.

Mehrere zusammenfassende Statistiken von Fitnessschätzungen werden für die mittlere und mittlere Fitness, die Fitness-Standardabweichung und die Anzahl der beobachteten Replikate berechnet. Die zusammenfassenden Statistiken werden zur weiteren Analyse in die QFA-Fitness-Zusammenfassungsdateien FT acht, Tabelle eins ausgegeben. Zum Beispiel bewerten Berechnungen der genetischen Interaktion FT neun Tabelle eins.

Diese Abbildung zeigt eine typische Wachstumskurve auf einer logarithmischen Waage OUTTA 384 QFA. Kulturen, die bei 20 Grad Celsius auf festem Agar wachsen, wie vom Kolonisator quantifiziert, mit einer Zunahme der Zelldichte, die erst nach etwa zwei Tagen nachweisbar ist. Diese Verzögerung ist wahrscheinlich ein kombinierter Effekt einer Kulturverzögerungsphase nach der Inokulation auf festem Medium und einer niedrigeren Nachweisgrenze für die Zelldichte.

Hier wurden 308 ähnliche Wachstumskurven von einer einzigen Platte erfasst. Beachten Sie, dass Stämme, die eine flache Linie erzeugten, sehr krank oder tot waren. Diese Abbildung zeigt den Vergleich von zwei genomweiten QFA-Screenings, um auf die Stärken der genetischen Interaktion zu schließen.

Das QFAR-Paket enthält auch Funktionen zur Erstellung der vorherigen Wachstumskurve und zur Ausgabe von Ranglisten der untersuchten Genotypen und Schätzungen der Stärke genetischer Interaktionen. Zusammen mit einem Q-Wert für die Signifikanz des beobachteten GIS Once beherrschte er eine vollständige genomweite QF mit vier Replikaten. Ein Experiment kann innerhalb von drei Wochen abgeschlossen werden. Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, bei der Nachverfolgung und Benennung aller Platten und Bilder organisiert zu sein.

Alle Platten müssen geimpft und in der richtigen Ausrichtung und Reihenfolge weiter gefleckt sein. Die Datenanalyse beruht auf der Richtigkeit der vom experimentellen Wissenschaftler erstellten Hilfstextdateien. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Fitness von Tausenden von unabhängigen mikrobiellen Kulturen abschätzen können.

Die Fitness wird geschätzt, indem wiederholt gefleckte Kulturen fotografiert, auf festen Agarplatten wachsen, die aufgenommenen Bilder in Schätzungen der Zelldichte umgewandelt und Wachstumskurven erstellt werden. Die mathematische Modellierung von Wachstumskurven liefert quantitative Fitnessschätzungen, die dann verwendet werden können, um funktionelle Beziehungen zwischen Genprodukten auf einer genomweiten Skala abzuleiten.