A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Das Ziel dieses Verfahrens besteht darin, quantitative mikrobielle Kulturfitnesswerte parallel und genomweite sowie präzise und hochdurchsatzfähig zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Anordnungsbibliothek mikrobieller Kolonien in 96-Loch-Platten hergestellt und die Kultur bis zur Sättigung angezogen wird. Anschließend werden die gesättigten Kulturen in Wasser verdünnt und dann auf festen Agarplatten aufgebracht.

Dann werden die festen Agarplatten regelmäßig fotografiert, bis das Wachstum der mikrobiellen Kolonie gesättigt ist. Schließlich werden die zeitlichen Verläufe der Aufnahmen des Wachstums jeder Kultur in quantitative Maße der Zelldichte umgewandelt, und die beobachteten Wachstumskurven werden mit Wachstumsmodellen analysiert, um quantitative Maße der mikrobiellen Fitness zusammenzufassen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Hinweise auf genetische Interaktionen liefern, indem gezeigt wird, dass mikrobielle Stämme unterschiedliche Fitnesswerte aufweisen, entweder in Kombination mit verschiedenen Mutationen oder unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie hochdichten Pinning-Methoden, beispielsweise SGA, oder Barcode-Konkurrenzexperimenten liegt darin, dass die Fitness-Messungen genauer sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsmedikamentenentwicklung zu beantworten, etwa welche Gene und Prozesse bei der Antwort auf DNA-Schäden und der Kontrolle des Zellzyklus wichtig sind, und dabei unterstützen, solche Forschungsergebnisse anhand grundlegender Mikroorganismen zu verstehen und auf mögliche Wirkstoffziele in menschlichen Krebszellen zu übertragen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Telomerfunktion und Visi ermöglichen kann.

Es kann auch auf andere Bereiche der Hefebiologie oder tatsächlich auf jeden Bereich angewendet werden, in dem Fitness-Phänotypen Einblicke in die Mikrobiologie liefern können. Wir hoffen, dass die QFA auf viele andere mikrobielle Organismen angewendet werden kann, für die Array-Bibliotheken existieren. Zum Beispiel, povi e coli, orilla surplus Ausgehend von gesättigten Übernachtkulturen wurden bis zu 96 unabhängige Hefestämme in 200 Mikroliter Volumina reichhaltigen flüssigen Mediums aufgespielt.

In einer 96-Loch-Kulturschale sterilisieren Sie einen 96er-Pin, einen manuellen Replikator mit einem Durchmesser von einem Achtel Zoll, indem Sie ihn zuerst in 100 % Ethanol tauchen, dann abbrennen und abkühlen lassen. Geben Sie 200 µL sterilem Wasser in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Vortexen Sie gesättigte Hefekulturen und verdünnen Sie diese, indem Sie das sterilisierte Pin-Werkzeug dreimal in die Stämme tauchen. Danach einmal in die Platte mit dem Wasser. Sterilisieren Sie das Pin-Werkzeug erneut und lassen Sie es abkühlen, bevor Sie es dreimal in die verdünnten Kulturen tauchen. Übertragen Sie anschließend den Pin auf eine feste Agarplatte.

Nach der Inkubation der Agarplatten verwenden Sie einen s und p robotics SP-Imager, um diese manuell für die automatisierte Kultivierung abzubilden. Beginnen Sie mit einem rechteckigen Array unabhängiger Hefe-Stämme, die auf festem Agar gezüchtet wurden. In diesem Beispiel sind die Ausgangsstämme das Ergebnis einer Kreuzung einer temperatursensitiven Query-Mutation mit der Hefe-Deletionskollektion.

1.536 Kulturen, die vier Wiederholungen von 384 unabhängigen Hefestämmen repräsentieren, werden auf SGA-Platten mithilfe eines Roboters mit einem sterilen Pin-Transferwerkzeug mit 96 Pins und einem Pin-Durchmesser von einem Millimeter angezogen, wobei 384 der 1.536 Stämme in vier 96-Well-Kulturplatten mit jeweils 200 Mikrolitern selektivem Medium übertragen werden; die Kulturen werden bei 20 Grad Celsius bis zur Sättigung inkubiert. Um die gesättigten Hefekulturen aufzutragen, überführen Sie diese zunächst auf einen Flüssigkeits-Handhabungsroboter und resuspendieren sie auf einem magnetischen Schüttler; verdünnen Sie die Kulturen anschließend auf etwa ein zu 70, indem Sie mithilfe eines sterilen 96-Pin-robotischen Pin-Werkzeugs in 200 Mikroliter sterilem Wasser ansetzen.

Nach der Reinigung und Sterilisation des Pin-Tools werden die verdünnten Kulturen auf Agarplatten aufgebracht. In 384-Well-Format werden die Platten in einen temperaturgeregelten, befeuchteten Inkubator mit automatischem Karussell und Zugangsluke transferiert. Zur Abbildung der Kulturen wird ein robotergestützter, automatisierter Bildanalysesystem verwendet, das die Platten wiederholt aus dem Inkubator entnimmt, die Deckel abhebt, sie in einen gleichmäßig beleuchteten Bereich unterhalb einer 35-Millimeter-Kamera positioniert und ein Bild mit einer Auflösung von 5.184 mal 3.456 erfasst.

Die Pixelauflösung ersetzt den Deckel, danach werden die Platten auf das Inkubator-Karussell zurückgebracht, um die Kulturpositionen auf den Platten und die jeweils angewendeten Behandlungen nachzuverfolgen. Die Platten werden automatisch entsprechend dem Inkubatornamen, der Temperatur, einer eindeutigen fortlaufenden Batch-Nummer und der Position im Inkubator codiert. Die Bildnamen ergeben sich aus der Verkettung des Platten-Namens mit dem Zeitstempel und werden automatisch beim Erfassen der Bilder generiert.

Platten werden häufig auch manuell beschriftet, um sicherzustellen, dass sie bei der Übertragung zwischen Roboterkarussellen in der gleichen Reihenfolge bleiben. Die Metadatendateien sind tabulatorgetrennte Textdateien, die manuell erstellt werden. Die Datei mit der Versuchsbeschreibung FT zwei.

Tabelle eins ist für jedes Experiment eindeutig, aber die Bibliotheksbeschreibung FT drei, Tabelle eins kann umfangreich wiederverwendet werden. Nach der Erstellung wird das Experiment in der experimentellen Beschreibungsdatei FT zwei, Tabelle eins beschrieben, die Spalten für Barcode oder automatisch generierten Plattenamen, Experimentstart-Zeitstempel, Plattenbehandlung, Inhalt des festen Agarmediums, Bildschirmnamen, Bibliotheksplattennummer für Bibliotheken mit mehreren Platten und eine Wiederholungsquadrantnummer für die Skalierung von einem 1.536-Loch-Format auf ein 384-Loch-Format enthält. Die e-Stammbibliothek wird mit einer Bibliotheksbeschreibungsdatei FT drei, Tabelle eins beschrieben, die das Genotyp angibt, das an jedem Kulturort angezüchtet wurde.

In jeder Platte einer Bibliothek sind die Spalten vier, Bibliotheksname, ORF, Plattennummer, Zeilen- und Spaltenposition auf der Platte sowie eine optionale Notizspalte enthalten. Optional kann eine Datei mit standardisierten Genbezeichnungen bereitgestellt werden (FT vier, Tabelle eins), die den jeweils zugeordneten standardisierten Genname für jede systematische ORF-Nummer beschreibt und die zu untersuchenden Stämme identifiziert. Diese Datei enthält zwei Spalten: ORF und Genname zur Datenanalyse.

Der QFA-rechnergestützte Workflow erfordert Zugriff auf eine leistungsfähige Mehrkern-Computerarbeitsstation, auf der die Software installiert ist. Das Bildanalysetool Colonizer und das QFAR-Paket sind beide online dokumentiert, kostenlos verfügbar und laufen auf einer Reihe von Betriebssystemen. Führen Sie Colonizer mit jeweils einem der aufgenommenen Plattenbilder als Eingabe aus, wodurch für jedes aufgenommene Bild eine Colonizer-Ausgabedatei FT5, Tabelle 1 generiert wird. Diese Colonizer-Ausgabedateien enthalten Schätzungen der Kulturdichte, des Kulturareals, der Form und der Farbe.

Für jede der 384 Positionen auf der Bildplatte wird automatisch ein Ausgabedateiname aus dem Quelldateinamen der Bildakquisition übernommen. Das QFAR-Paket enthält Funktionen, mit denen Dichtewerte über die Zeit für jede Kultur ausgewählt werden können, um generalisierte logistische Populationsmodelle an die Beobachtungen anzupassen und grafisch darzustellen. Siehe Abbildung zwei und drei für Beispiele.

Die angepassten Parameterwerte werden in QFA-Logistik-Parameterdateien geschrieben. Das QFAR-Paket enthält außerdem Funktionen zur Qualitätskontrolle. Randkolonien werden verworfen, da an den Plattenrändern mehr Nährstoffe verfügbar sind und die Bildanalyse schwieriger ist.

In der Nähe von Plattenrändern und Kulturen, die den SGA nicht bestanden haben, sowie Genotypen mit Kopplung zu markergen-spezifischen Screen-Genen, werden von der Analyse ausgeschlossen. Mehrere quantitative Fitnessmaße werden aus den Parametern des logistischen Populationsmodells für jede Kultur abgeleitet. Dazu gehören maximale Populationsverdopplungsraten und die Anzahl der Teilungen von der Inokulation bis zur Sättigung für jeden Satz von Replikatkulturen und für jede Fitnessdefinition.

Mehrere Zusammenfassungsstatistiken der Fitnessschätzungen werden berechnet: mittlere und mediane Fitness, Standardabweichung der Fitness und Anzahl der beobachteten Replikate. Die Zusammenfassungsstatistiken werden in QFA-Fitness-Zusammenfassungsdateien FT acht, Tabelle eins zur weiteren Analyse ausgegeben. Beispielsweise Berechnungen von genetischen Interaktionsscores FT neun, Tabelle eins.

Diese Abbildung zeigt eine typische Wachstumskurve auf logarithmischer Skala AUS 384 QFA. Kulturen, die bei 20 Grad Celsius auf festem Agar wachsen, wurden mittels Colonizer quantifiziert, wobei ein Anstieg der Zelldichte erstmals nach etwa zwei Tagen nachweisbar ist. Diese Verzögerung ist wahrscheinlich eine kombinierte Wirkung einer Wachstumsverzögerungsphase (Lag-Phase) nach der Inokulation auf dem festen Medium und einer unteren Nachweisgrenze für die Zelldichte.

Hier wurden 308 ähnliche Wachstumskurven von einer einzigen Platte erfasst. Beachten Sie, dass Stämme, die eine flache Linie erzeugten, sehr krank oder tot waren. Diese Abbildung zeigt den Vergleich zweier genomweiter QFA-Analysen zur Ableitung der Stärke genetischer Interaktionen.

Das QFAR-Paket beinhaltet außerdem Funktionen zur Erstellung der vorherigen Wachstumskurvenabbildung sowie zur Ausgabe von Ranglisten untersuchter Genotypen und Schätzungen der genetischen Interaktionsstärke. Zusammen mit einem Q-Wert für die Signifikanz der beobachteten GIS kann nach Beherrschung des Verfahrens ein komplettes genomweites QF.A-Experiment mit vier Wiederholungen innerhalb von drei Wochen abgeschlossen werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, bei der Verfolgung und Benennung aller Platten und Bilder organisiert vorzugehen.

Alle Platten müssen korrekt orientiert und in der richtigen Reihenfolge beimpft und aufgetragen werden. Die Datenanalyse hängt von der Richtigkeit der vom experimentierenden Wissenschaftler erstellten Hilfstextdateien ab. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die Fitness von Tausenden unabhängiger mikrobieller Kulturen geschätzt werden kann.

Die Fitness wird geschätzt, indem bepunktete Kulturen, die auf festen Agarplatten wachsen, wiederholt fotografiert, die aufgenommenen Bilder in Schätzungen der Zelldichte umgewandelt und Wachstumskurven erstellt werden. Die mathematische Modellierung der Wachstumskurven liefert quantitative Fitnessschätzungen, die anschließend verwendet werden können, um funktionelle Zusammenhänge zwischen Genprodukten im genomweiten Maßstab abzuleiten.