Name: A Quantitative Analysis Fitness-Workflow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Erfahren Sie Quantitative Fitness Analysis (QFA) zur genauen Hochdurchsatz-Messung mikrobieller Fitness auf genomweiter Ebene. Diese computergestützte Methode nutzt automatisierte Bildgebung und mathematische Modellierung von Wachstumskurven.

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Wir danken allen Mitgliedern unseres Labors und dem Zentrum für Integrierte System-Biologie des Alterns und Ernährung (CISBAN) für die Unterstützung und hilfreiche Diskussionen. Diese Studie wurde vom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) (BB/C008200/1) und des Wellcome Trust (075294, 093088) unterstützt.

<ol><li>Addinall, S. G., Holstein, E., Lawless, C., Yu, M., Chapman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Fitness+Analysis+shows+that+NMD+proteins+and+many+other+protein+complexes+suppress+or+enhance+distinct+telomere+cap+defects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative Fitness Analysis shows that NMD proteins and many other protein complexes suppress or enhance distinct telomere cap defects.</a> PLoS Genetics. 7 (4), e1001362(2011).</li>
<li>Addinall, S. G., Downey, M., Yu, M., Zubko, M. K., Dewar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomewide+suppressor+and+enhancer+analysis+of+cdc13-1+reveals+varied+cellular+processes+influencing+telomere+capping+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genomewide suppressor and enhancer analysis of cdc13-1 reveals varied cellular processes influencing telomere capping in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 180, 2251-2266 (2008).</li>
<li>Lawless, C., Wilkinson, D., Young, A., Addinall, S., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonyzer%3A+automated+quantification+of+micro-organism+growth+characteristics+on+solid+agar%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Colonyzer: automated quantification of micro-organism growth characteristics on solid agar.</a> BMC Bioinformatics. 11, 287-28 (2010).</li>
<li>Colonyzer - Image analysis software [Internet]. , Newcastle University. Newcastle, UK. Available from:
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<li>Tong, A. H., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+genetic+analysis+with+ordered+arrays+of+yeast+deletion+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants.</a> Science. 294, 2364-2368 (2001).</li>
<li>Costanzo, M., Baryshnikova, A., Bellay, J., Kim, Y., Spear, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327, 425-431 (2010).</li>
<li>qfa - An R Package for Quantiative Fitness Analysis [Internet]. , University of Vienna. Vienna, Austria. Available from:
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<li>Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+growth+rate+in+high-throughput+growth+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Measuring growth rate in high-throughput growth phenotyping.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22 (1), 94-102 (2011).</li>
<li>Maringele, L., Lydall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXO1-dependent+single-stranded+DNA+at+telomeres+activates+subsets+of+DNA+damage+and+spindle+checkpoint+pathways+in+budding+yeast+yku70%CE%94mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Dev%22%5BJournal%5D)">EXO1-dependent single-stranded DNA at telomeres activates subsets of DNA damage and spindle checkpoint pathways in budding yeast yku70Δmutants.</a> Genes and Dev. 16 (15), 1919-1933 (2002).</li>
<li>Warringer, J., Blomberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+in+environmental+arrays+allows+analysis+of+quantitative+phenotypic+profiles+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Automated screening in environmental arrays allows analysis of quantitative phenotypic profiles in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20, 53-67 (2003).</li>
<li>Hillenmeyer, M., Fung, E., Wildenhain, J., Pierce, S., Hoon, S., Lee, W., Proctor, M., St. Onge, R., Tyers, M., Koller, D., Altman, R., Davis, R., Nislow, C., Giaever, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemical+genomic+portrait+of+yeast%3A+uncovering+a+phenotype+for+all+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes.</a> Science. 320 (5874), 362-365 (2008).</li>
<li>Smith, A. M., Durbic, T., Oh, J., Urbanus, M., Proctor, M., Heisler, L. E., Giaever, G., Nislow, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competitive+Genomic+Screens+of+Barcoded+Yeast+Libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Competitive Genomic Screens of Barcoded Yeast Libraries.</a> J. Vis. Exp. (54), e2864(2011).</li>
<li>Lederberg, J., Lederberg, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).</li>
<li>Queller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+ecology%3A+The+social+side+of+wild+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Behavioural ecology: The social side of wild yeast.</a> Nature. 456, 589-590 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

QFA ist in vielerlei Hinsicht ein direkter Nachkomme von drei etablierten Labormaßstab mikrobiologischen Techniken: Kultur Verdünnungsreihe Stichproben 9, Wachstumskurve Bestimmung in belüfteten Flüssigkulturen 9 und 13 Replica-Plating. Diese drei Methoden werden zusammengefasst und verglichen mit QFA und andere High-Throughput-Techniken, die in Tabelle 2. Während Verdünnungsreihe Stichproben definieren, einem Stamm der Fitness als seine Fähigkeit, Kolonien in einer Reihe von Kulturen aus einer Reihe von Verdünnungen Inokulum gewachsen zu bilden, um QFA Maßnahmen Belastung Fitness durch wiederholte Beobachtungen einer einzigen Kultur konstruieren eine Wachstumskurve. Die Quantifizierung der Fitness von einzelnen Kulturen ermöglicht viele weitere Stämme gleichzeitig untersucht werden, unter identischen Bedingungen. Replizieren von Arrays der Kulturen ermöglicht wiederholtes Testen von Stammsammlungen, am sinnvollsten bei der Prüfung für Kultur Fitness Unterschiede in verschiedenen Umgebungen oder genetischen Hintergründen. Die QFA Protokoll vorgestellthier verwendet teure Roboter-Anlagen zu replizieren, beimpfen, inkubieren und Bild-Agar-Platten, geeignet für die Beobachtung Wachstum von Tausenden von unabhängigen Kulturen (Roboter QFA, Tabelle 2). Da jedoch QFA auf etablierten, traditionellen Labor-Techniken basiert, kann es auch viel billiger werden durch das Ersetzen Roboter mit Hilfe manueller Schritte (manuelle QFA, Tabelle 2) durchgeführt. Manuelle QFA beinhaltet Replikation und Inokulation der Kulturen auf Agarplatten mit einem manuellen Stiftwerkzeug und der manuellen Übertragung von Platten zu und von einem Inkubator für Fotografie. Das gleiche rechnerische Analyse Workflow angewendet werden, um Wachstumskurven von beiden experimentellen Design zu generieren. QFA Fitness Schätzungen zu sein scheinen vergleichsweise präzise. In Abbildung 4 sind die mittlere Fitness der vier Beispiel-Cluster von funktionell verwandten Gen-Deletionen hervorgehoben. Die räumliche Nähe der Mitglieder jeder funktionell verwandten Gen-Klasse in zwei unabhängigeHNO genetischen Hintergründen (ura3Δ und CDC13-1) zeigt die Reproduzierbarkeit der QFA Fitness-Schätzungen. Zum Beispiel, trennen nur 3 Gendeletionen (von möglichen 4300) die drei Mitglieder der konservierten MRX-Komplex. High-Throughput-Alternativen zu QFA zum Testen Wachstumseigenschaften mikrobielle Stämme umfassen SGA 5,6, Wettbewerb Bildschirme in Strichcode-Bibliotheken 11,12 und Bildschirme aufnehmenden optischen Dichte Kinetik spektrophotometrische Plattenleser 10, die in Tabelle 2 zusammengefasst sind, und an anderer Stelle ausführlicher beschrieben 8 . QFA und SGA-Platten, wo Kulturen wachsen auf Agar-Oberflächen (Agar-basierten Methoden, Tabelle 2) können schnell und einfach per Roboter behandelt werden. Solide Agaroberfläche Kulturen sind gut belüftet und das Wachstum im gesamten Zellen können in festen Kulturen wachsen, so gesellig Mikroben in einer Gemeinschaft zu 14 wachsen. Intakt gelassen, mikrobieller Gemeinschaften einUSWIRKUNG eigenen Mikroumgebung, sezernierenden Toxine, wie Ethanol, und möglicherweise Signalisierung zwischen Zellen. Allerdings kontinuierliches Mischen von flüssigen Kulturen, notwendig, um ausreichende Belüftung zu erreichen, künstlich stört mikrobieller Gemeinschaften und deren Mikro-Umgebungen, die ihre Funktionsweise Wachstum beeinträchtigen können. Cross-Kontamination ist weniger ein Problem in festen Agar-Methoden, da es weniger Gelegenheit für Flüssigkeitsspritzern tragenden Zellen zwischen den Kulturen. Wenn Kontamination durch fremde luftgetragenen Mikroben in festen Agar-Assays, kann es oft durch visuelle Inspektion von festen Agar-Platten erkannt werden und machten oder entfernt werden. QFA Durchsatz erheblich höher als die der Flüssigkeit parallel Verfahren auf zwei Arten. Zunächst auf QFA (und SGA)-Platten, inokuliert Kulturen zusammen dichter gepackt, so dass mehrere unabhängige Kulturen pro Platte. In QFA gibt es typischerweise 308 Kulturen, nicht mitgerechnet nicht-experimentellen Rand Kulturen (Abbildung 1) comVergleich zu flüssigen Kulturen mit 96 oder 100 Kulturen pro Platte parallel. Zweitens kann QFA Versuche zu einer viel größeren Anzahl von Platten skaliert werden. Während die Anzahl der Platten in einem einzigen Experiment analysiert QFA nur durch den verfügbaren Raum in einem Inkubator oder warmen Raum, der minimal zulässige Bilderfassungsvorrichtung Frequenz und der maximal erreichbaren Capture Frequenz beschränkt ist, ist die Anzahl von Platten in einem flüssigen Wachstumsmedium Experiment stark eingeschränkt durch die Kapazität der Platten-Lesegerät (typischerweise ein oder zwei Platten) oder der Ablage an der Platten-Lesegerät (typischer Wert von 25-50 Platten). Wir haben vor kurzem eine vollautomatische QFA Experiment auf 123 Platten mit je 308 experimentellen Kulturen durchgeführt, so dass 37.884 gleichzeitigen Kulturen. Wir schätzen, dass die maximal erreichbare Anzahl von unabhängigen Kulturen wachsen in flüssiger 96 (Kulturen / Platte) ist x 50 (Platten / Stapler) = 4800, die um das Zehnfache kleiner als unsere QFA Durchsatz ist. Eine Alternative für flüssige Kultur-Bildschirme ist für viele automatisierte gro nutzenwth Geräte parallel (Tabelle 1 aus der Bewertung von Blomberg 8), jede mit einer Kapazität von einem oder zwei Platten. Temperaturregelung in jedem Gerät ist unabhängig, und so Bedingungen sind nicht identisch, aber davon aus, dass sie sind, würde dies Workflow benötigen mindestens 190 solcher Geräte zu QFA Durchsatz (unter der Annahme 200 Flüssigkulturen pro Gerät) entsprechen. Zusammenfassend ist QFA eine hochwertige Workflow, sinnvoll angewendet werden kann, um quantitatives Wachstum Phänotypen in beiden Kleinen fokussiert Experimente und High-Throughput-Screens sammeln. Es ist flexibel genug, um effektiv mit unterschiedlichen Anforderungen an die Roboter-Anlagen angewendet werden. Die rechnerische Komponente der QFA Workflow basiert auf frei verfügbarer Open-Source-Code basiert.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> 96 Pin manuelle pintool mit 1/8 &quot;Durchmesser Stifte </td></tr><tr><td> Mischen Sie Mate- </td><td> Eppendorf </td><td> 5353 000.014 </td><td></td></tr><tr><td> Biomek FX </td><td> Beckman </td><td> A31842 </td><td></td></tr><tr><td> TELESHAKE </td><td> Thermo Scientific </td><td> 50095890 </td><td> Installiert auf Biomek FX </td></tr><tr><td> BM3-SC </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> BM3-SC </td><td> 192 Regal drehenden Karussell </td></tr><tr><td> spImager </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> spImager </td><td> Hochauflösende Bildgebung manuelle </td></tr><tr><td> spImager mit Cytombei </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Brauch </td><td> Temperaturgeführte automatisierte hochauflösende Bildgebung </td></tr><tr><td> Cytomat 6001 mit Wärmetauscher </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51022222 </td><td> An spImager </td></tr><tr><td> Ecoline RE207 </td><td> Lauda </td><td> RE207 </td><td> An Cytomat </td></tr><tr><td> spImager mit Karussell </td><td> S &amp; P Robotics Inc </td><td> Brauch </td><td> Automatisierte hochauflösende Bildgebung </td></tr><tr><td> Roboter Pin Werkzeugaufnahme für FP12pins </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> AFIX96FP12 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 x FP12 Stifte </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> FP12 </td><td> 50,4 mm lang, 17 mm Stiftlänge ausgesetzt </td></tr><tr><td> Docking Station für Pin Tool </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> Docking-Station Basis entfernt, um Fan Trocknung von Nadeln kann </td></tr><tr><td>Pin-Reinigungsbürste </td><td> V &amp; P Scientific </td><td> VP425 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Replica Plater </td><td> Sigma </td><td> R-2508 </td><td> Manuelle Pin-Werkzeug </td></tr><tr><td> Nunc OmniTray mit Deckel </td><td> Nunc </td><td> 734-0490 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96-Well-sterile Polystyrol-Platten </td><td> Greiner BioOne </td><td> 655161 </td><td> N / A </td></tr><tr><td> 96 Well Polystyrol sterilen Deckeln </td><td> Greiner BioOne </td><td> 656171 </td><td> N / A </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. Reagenzien und Geräte.

a quantitative analysis fitness-workflow

A Quantitative Fitness Analysis Workflow

Quantitative Analyse Fitness (QFA) ist ein experimenteller und rechnerischer Workflow für den Vergleich von Fitness der mikrobiellen Kulturen parallel 1,2,3,4 gewachsen. QFA können fokussierten Beobachtungen der einzelnen Kulturen angewandt werden, sondern ist sehr nützlich für genomweite genetische Interaktion oder Drogen-Bildschirme der Untersuchung bis zu Tausenden von unabhängigen Kulturen. Die zentrale experimentelle Methode ist die Impfung von unabhängigen, verdünnte Flüssigkeit mikrobiellen Kulturen auf festen Agar-Platten, die bebrütet und werden regelmäßig fotografiert. Fotos von jedem Zeit-Punkt analysiert, Erstellung von quantitativen Zelldichte Schätzungen, die verwendet werden, um Wachstumskurven zu konstruieren, so dass quantitative Fitness-Maßnahmen abgeleitet werden. Kultur Fitnesswerte kann im Vergleich zu quantifizieren und zu zählen genetische Interaktion Stärken oder Drogen-Empfindlichkeiten werden. Die Auswirkungen auf die Kultur von den Behandlungen Fitness Hinzugefuegt in Substrat-Agar (z. B. kleine Moleküle, Antibiotika oder Nährstoffe) oder aufgebracht auf externen Plattenly (zB UV-Einstrahlung, Temperatur) kann durch QFA quantifiziert werden. Die QFA Workflow erzeugt Wachstum schätzt analog zu den durch spektrophotometrische Messung der parallelen flüssigen Kulturen in 96-Well oder 200-Well-Platte Software erhalten. Wichtig ist, daß QFA deutlich höheren Durchsatz im Vergleich mit solchen Methoden. QFA Kulturen wachsen auf einem festen Agar-Oberfläche und werden daher auch während des Wachstums ohne Rühren oder Schütteln belüftet. QFA Durchsatz ist nicht so hoch wie die einiger synthetischer Genetic Array (SGA) Screening-Verfahren 5,6. Da jedoch QFA Kulturen stark, bevor sie auf Agar geimpft verdünnt werden, können QFA erfassen vollständigere Wachstumskurven, einschließlich Exponential-und Sättigungs-Phasen 3. Zum Beispiel ermöglichen Wachstumskurve Beobachtungen Kultur Verdoppelungszeiten direkt mit hoher Genauigkeit geschätzt werden, wie zuvor diskutiert 1. Hier präsentieren wir einspezifische QFA-Protokoll angewandt, um Tausende von S. cerevisiae Kulturen, die automatisch durch Roboter sind während der Inokulation, Inkubation und Imaging behandelt. Jeder dieser Schritte kann automatisiert durch ein gleichwertiges, manuelle Verfahren ersetzt werden, mit einer zugehörigen Reduzierung der Durchlaufzeit, und wir präsentieren auch einen geringeren Durchsatz manuelle Protokoll. Die gleichen QFA Software-Tools, um Bilder in entweder Workflow erfasst angewendet werden. Wir haben umfangreiche Erfahrungen auf die Anwendung QFA Kulturen der Bäckerhefe S. cerevisiae, aber wir erwarten, dass QFA erweisen wird ebenso nützlich für die Prüfung Kulturen der Spalthefe S. pombe und Bakterienkulturen.

Quantitative Analyse Fitness (QFA) ist eine ergänzende Reihe von experimentellen und rechnerischen Methoden zur Schätzung der mikrobiellen Kultur Fitnesswerte. QFA schätzt den Effekt genetischer Mutationen, Medikamente oder andere Behandlungen angewandt auf Mikrobenwachstum. Experimente Skalierung von fokussierten Analyse der einzelnen Kulturen zu Tausenden von parallelen Kulturen ausgelegt werden kann.

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

Die Quantitative Fitness-Analyse (QFA) ist ein experimenteller und computergestützter Workflow zum Vergleich der Fitness von parallel gezüchteten mikrobiellen Kulturen1,2,3,4. ...

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, quantitativ die Fitness von Mikrobenkulturen parallel auf genomweiter Ebene präzise und mit hoher Durchsatzkapazität zu erfassen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine geordnete Bibliothek mikrobieller Kolonien in 96-Loch-Platten hergestellt und die Kultur bis zur Sättigung wachsen gelassen wird. Anschließend werden die gesättigten Kulturen in Wasser verdünnt und auf feste Agarplatten aufgeimpft.Anschließend werden die festen Agarplatten in regelmäßigen Abständen fotografiert, bis das Wachstum der mikrobiellen Kolonie gesättigt ist. Schließlich werden die zeitlich aufeinanderfolgenden Aufnahmen des Wachstums jeder Kultur in quantitative Maße der Zelldichte umgewandelt, und die beobachteten Wachstumskurven werden mit Wachstumsmodellen verglichen, um quantitative Parameter der mikrobiellen Fitness zusammenzufassen. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die Hinweise auf genetische Interaktionen liefern, indem gezeigt wird, dass mikrobielle Stämme unterschiedliche Fitnesswerte aufweisen, entweder in Kombination mit verschiedenen Mutationen oder beim Wachstum unter verschiedenen Bedingungen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie hochdichten Pinning-Methoden, beispielsweise SGA, oder Barcode-Konkurrenzexperimenten liegt darin, dass die Fitness-Messungen genauer sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der Krebsmedikamentenentwicklung zu beantworten, etwa welche Gene und Prozesse bei der Antwort auf DNA-Schäden und der Kontrolle des Zellzyklus wichtig sind, und dabei unterstützen, solche Forschungsergebnisse anhand grundlegender Mikroorganismen als potenzielle Wirkstoffziele in menschlichen Krebszellen zu verstehen und umzusetzen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Telomerfunktion und visi ermöglichen kann.Sie kann auch auf andere Bereiche der Hefebiologie oder tatsächlich auf jeden Bereich angewendet werden, in dem Fitness-Phänotypen Einblicke in die Mikrobiologie ermöglichen. Wir hoffen, dass die QFA auf viele andere mikrobielle Organismen angewendet werden kann, für die Array-Bibliotheken existieren. Zum Beispiel povi e coli, orilla surplus Ausgehend von gesättigten Übernachtkulturen wurden bis zu 96 unabhängige Hefestämme in 200 Mikroliter Volumina reichhaltigen flüssigen Medium aufgespielt.In einer 96-Loch-Kulturschale sterilisieren Sie einen 96er-Pin, einen manuellen Replikator mit einem Durchmesser von einem Achtel Zoll, indem Sie ihn zuerst in 100 % Ethanol eintauchen, dann abbrennen und abkühlen lassen. Geben Sie 200 Mikroliter sterilem Wasser in die Vertiefungen einer 96-Loch-Platte. Vortexen Sie die gesättigten Hefekulturen und verdünnen Sie sie, indem Sie das sterilisierte Pin-Werkzeug dreimal in die Stämme eintauchen, dann einmal in die Platte mit Wasser. Sterilisieren Sie das Pin-Werkzeug erneut und lassen Sie es abkühlen, bevor Sie es dreimal in die verdünnten Kulturen eintauchen. Übertragen Sie anschließend den Pin auf eine feste Agarplatte.Nach der Inkubation der Agarplatten verwenden Sie einen s und p robotics SP-Bilderzeuger, um sie manuell zur automatisierten Kultivierung abzubilden. Beginnen Sie mit einem rechteckigen Array unabhängiger Hefe-Stämme, die auf festem Agar gezüchtet wurden. In diesem Beispiel sind die Ausgangsstämme das Ergebnis einer Kreuzung einer temperatursensitiven Untersuchungsmutation mit der Hefe-Deletionskollektion.1.536 Kulturen, die vier Wiederholungen von 384 unabhängigen Hefe-Stämmen darstellen, werden auf SGA-Platten mithilfe eines Roboters mit einem sterilen Pin-Tool mit 96 Pins und einem Pin-Durchmesser von einem Millimeter angezüchtet, wobei 384 der 1.536 Stämme in vier 96-Well-Kulturplatten mit jeweils 200 µL selektivem Medium übertragen werden. Die Kulturen werden bei 20 °C bis zur Sättigung inkubiert. Um die gesättigten Hefe-Kulturen aufzutragen, überführen Sie diese zunächst auf einen Flüssigkeits-Handhabungsroboter und resuspendieren sie auf einem magnetischen Schüttler. Verdünnen Sie die Kulturen anschließend durch Auftrag mit einem sterilen 96-Pin-Roboter-Pin-Tool in 200 µL steriles Wasser auf etwa 1:70.Nach der Reinigung und Sterilisation des Pin-Tools werden die verdünnten Kulturen auf Agarplatten aufgetragen. In einem 384-Loch-Format werden die Platten in einen temperaturgesteuerten, befeuchteten Inkubator mit automatischem Karussell und Zugangsöffnung transferiert. Zur Bildaufnahme der Kulturen wird ein robotischer, automatisierter Bildanalysesystem verwendet, das die Platten wiederholt aus dem Inkubator entnimmt, die Deckel abhebt, sie in einen gleichmäßig beleuchteten Bereich unter einer 35-Millimeter-Kamera positioniert und ein Bild mit einer Auflösung von 5.184 mal 3.456 aufnimmt.Die Pixelauflösung setzt den Deckel wieder auf, danach werden die Platten zurück in die Inkubatorkarussell gegeben, um die Positionen der Kulturen auf den Platten sowie die jeweils angewendeten Behandlungen nachverfolgen zu können. Die Platten werden automatisch anhand des Inkubatornamens, der Temperatur, einer eindeutigen fortlaufenden Batch-Nummer und der Position im Inkubator codiert. Die Bildnamen ergeben sich aus der Verkettung des Platten-Namens mit einem Zeitstempel und werden automatisch beim Erfassen des Bildes generiert.Platten werden häufig auch manuell beschriftet, um sicherzustellen, dass sie bei der Übertragung zwischen Roboterkarussells in der gleichen Reihenfolge bleiben. Die Metadatendateien sind tabulatorgetrennte Textdateien, die manuell erstellt werden. Die Datei mit der Versuchsbeschreibung FT zwei.Tabelle eins ist für jedes Experiment eindeutig, aber die Bibliotheksbeschreibung FT drei, Tabelle eins kann umfangreich wiederverwendet werden. Nach der Erstellung wird das Experiment in der experimentellen Beschreibungsdatei FT zwei, Tabelle eins beschrieben, die Spalten für Barcode oder automatisch generierten Plattenname, Experimentstart-Zeitstempel, Plattenbehandlung, Inhalt des festen Agars, Bildschirmname, Bibliotheksplattennummer für Bibliotheken mit mehreren Platten und eine Wiederholungsquadrantnummer für die Skalierung von einem 1.536-Loch-Format auf ein 384-Loch-Format enthält. Die e-Stammbibliothek wird mit einer Bibliotheksbeschreibungsdatei FT drei, Tabelle eins beschrieben, die das Genotyp angibt, das an jedem Kulturort angezüchtet wurde.In jeder Platte einer Bibliothek sind die Spalten vier, Bibliotheksname, ORF, Plattennummer, Zeilen- und Spaltenposition der Platte sowie eine optionale Notizspalte enthalten. Optional kann eine Datei mit standardisierten Genbezeichnungen bereitgestellt werden (FT vier, Tabelle eins), die den jeweils zugeordneten standardisierten Genname für jede systematische ORFY-Nummer auflistet und so die identifizierten Stämme beschreibt, die untersucht werden. Diese Datei enthält zwei Spalten: ORF und Genname zur Analyse der Daten.Der QFA-rechnergestützte Arbeitsablauf erfordert Zugriff auf eine leistungsfähige Mehrkern-Computerarbeitsstation, auf der das Colonizer-Bildanalyse-Softwaretool und das QFAR-Paket installiert sind. Beide Werkzeuge sind online dokumentiert, kostenlos verfügbar und laufen auf einer Reihe unterschiedlicher Betriebssysteme. Führen Sie Colonizer mit jeweils einem der erfassten Plattenbilder als Eingabe aus, wodurch pro aufgenommenem Bild eine Colonizer-Ausgabedatei FT5, Tabelle 1 generiert wird. Diese Colonizer-Ausgabedateien enthalten Angaben zu Schätzwerten der Kultur-Dichte, Kulturfläche, -form und -farbe.Für jede der 384 Positionen auf der Bildplatte wird automatisch ein Ausgabedateiname aus dem Quelldateinamen der Bildakte übernommen. Das QFAR-Paket enthält Funktionen, um Dichtewahlen über die Zeit für jede Kultur durchzuführen, um verallgemeinerte logistische Populationsmodelle an die Beobachtungen anzupassen und diese abzubilden. Siehe Abbildung zwei und drei für Beispiele.Die angepassten Parameterwerte werden in QFA-logistische Parameterdateien geschrieben. Das QFAR-Paket enthält außerdem Funktionen zur Qualitätskontrolle. Randkolonien werden verworfen, da am Rand der Platte mehr Nährstoffe verfügbar sind und die Bildanalyse schwieriger ist.In der Nähe von Plattenrändern und Kulturen, bei denen der SGA fehlschlug, sowie Genotypen mit Verknüpfung zu spezifischen Markergenen der Bildschirmung, werden von der Analyse ausgeschlossen. Verschiedene quantitative Fitnessmaße werden aus den Parametern des logistischen Populationsmodells für jede Kultur abgeleitet. Dazu gehören die maximale Populationsverdopplungsrate sowie die Anzahl der Teilungen von der Inokulation bis zur Sättigung für jeden Satz von replizierten Kulturen und für jede Fitnessdefinition.Mehrere Zusammenfassungsstatistiken der Fitnessschätzungen werden berechnet: Mittelwert und Median der Fitness, Standardabweichung der Fitness sowie Anzahl der beobachteten Replikate. Die Zusammenfassungsstatistiken werden in QFA-Fitness-Zusammenfassungsdateien FT acht, Tabelle eins zur weiteren Analyse ausgegeben. Beispielsweise Berechnungen von genetischen Interaktionsscores FT neun, Tabelle eins.Diese Abbildung zeigt eine typische Wachstumskurve auf logarithmischer Skala aus 384 QFA. Kulturen, die bei 20 Grad Celsius auf festem Agar wachsen, wurden mittels Colonizer quantifiziert; ein Anstieg der Zelldichte ist erstmals nach etwa zwei Tagen nachweisbar. Diese Verzögerung ist wahrscheinlich eine kombinierte Wirkung einer Anlaufphase nach der Inokulation auf dem festen Medium und einer unteren Nachweisgrenze für die Zelldichte. Hier wurden 308 ähnliche Wachstumskurven von einer einzigen Platte erfasst. Beachten Sie, dass Stämme, die eine flache Linie zeigten, sehr krank oder tot waren. Diese Abbildung zeigt den Vergleich zweier genomweiter QFA-Screens zur Ableitung der Stärke genetischer Interaktionen.Das QFAR-Paket beinhaltet außerdem Funktionen zur Erstellung der vorherigen Wachstumskurvenabbildung sowie zur Ausgabe von Ranglisten untersuchter Genotypen und Schätzungen der genetischen Interaktionsstärke. Zusammen mit einem Q-Wert für die Signifikanz der beobachteten GIS ermöglicht es, sobald die Methode beherrscht ist, ein vollständiges genomweites QF.A-Experiment mit vier Wiederholungen innerhalb von drei Wochen abzuschließen. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, bei der Verfolgung und Benennung aller Platten und Bilder organisiert vorzugehen.Alle Platten müssen korrekt orientiert und in der richtigen Reihenfolge beimpft und aufgetragen werden. Die Datenanalyse hängt von der Richtigkeit der durch den experimentellen Wissenschaftler erstellten Hilfstextdateien ab. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Fitness von Tausenden unabhängiger mikrobieller Kulturen schätzen kann.Die Fitness wird geschätzt, indem bepunktete Kulturen, die auf festen Agarplatten wachsen, wiederholt fotografiert, die aufgezeichneten Bilder in Schätzungen der Zelldichte umgewandelt und Wachstumskurven erstellt werden. Durch mathematische Modellierung der Wachstumskurven erhält man quantitative Fitnessschätzungen, die anschließend verwendet werden können, um funktionelle Beziehungen zwischen Genprodukten im genomweiten Maßstab abzuleiten.

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Forschung

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Biology

Biologie

Wir stellen ein Protokoll für die funktionelle Bewertung umfassender single-site Sättigungsmutagenese Bibliotheken von Proteinen Hochdurchsatz-Sequenzierung verwendet. Wichtig ist, nutzt dieser Ansatz orthogonalen Primerpaare Bibliothek Konstruktion und Sequenzierung zu multiplexen. Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung von TEM-1 β-Lactamase in klinisch relevanter Dosierung von Ampicillin ausgewählt werden bereitgestellt.

Ein Protokoll für Functional Assessment of Whole-Protein Sättigungsmutagenese-Bibliotheken mit Hilfe von High-Throughput Sequencing

Eine effiziente und einfache Methode für die computergestützte Analyse von Nematoden Schwimmverhalten in Flüssigkeit beschrieben. Das Verfahren erfordert keine Investitionen für C. elegans Laboratorien wenig. Die verwendete Hardware ist Standard, und der Computer-Software für die Verhaltensanalyse (CELEST) ist eine Open Source ein.

Automatische Analyse von<em&gt; C. elegans</em&gt; Swim Verhalten mit CELEST Software

Dieser molekulare Ansatz zur Bestimmung der bakteriellen Fitness ermöglicht die präzise und genaue Detektion von Mikroorganismen mithilfe einzigartiger genomischer DNA-Barcodes, die über digitale PCR quantifiziert werden. Das Protokoll beschreibt die  Berechnung des Wettbewerbsindex für Salmonellenstämme; Die Technologie ist jedoch leicht an Protokolle anpassbar, die eine absolute Quantifizierung jedes genetisch verformbaren Organismus erfordern.

Digitaler PCR-basierter Wettbewerbsindex für High-Throughput-Analyse der Fitness bei Salmonellen

Das eVOLVER-Framework ermöglicht eine durchgängige mikrobielle Kultur mit hoher Auflösung und dynamischer Kontrolle über experimentelle Parameter. Dieses Protokoll zeigt, wie man das System für ein komplexes Fitness-Experiment einsetzt, das die Anwender bei der Programmierung automatisierter Kontrolle über viele einzelne Kulturen, das Messen, Sammeln und Interagieren mit experimentellen Daten in Echtzeit führt.

Die Entwicklung automatisierter, durchsatzer, kontinuierlicher Zellwachstumsexperimente mit eVOLVER

Das vorliegende Protokoll bietet eine praktische Lösung, die die Messung von Apoptose, mitochondrialem Membranpotenzial und DNA-Schäden in menschlichen Spermien mit einem einzigen Zytometer ermöglicht.

Durchflusszytometrische Analyse von Biomarkern zum Nachweis von Funktionsdefekten menschlicher Spermien

Dieses Protokoll beschreibt, wie das Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) durch die Durchführung seiner täglichen Transfers und regelmäßigen Einfrierungen aufrechterhalten werden kann und wie Wettbewerbstests durchgeführt werden, um Fitnessverbesserungen bei evolutionären Bakterien zu messen. Diese Verfahren können als Vorlage für Forscher dienen, die ihre eigenen Experimente zur mikrobiellen Evolution starten.

Tägliche Transfers, Archivierung von Populationen und Fitnessmessung im Langzeit-Evolutionsexperiment mit Escherichia coli

Wir präsentieren einen flexiblen, erweiterbaren Jupyter-Lab-basierten Workflow für die unüberwachte Analyse komplexer Multi-Omics-Datensätze, der verschiedene Vorverarbeitungsschritte, die Schätzung des Multi-Omics-Faktorenanalysemodells und mehrere nachgelagerte Analysen kombiniert.

Anwendung der unüberwachten Multi-Omik-Faktorenanalyse zur Aufdeckung von Variationsmustern und molekularen Prozessen im Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen

Die tragbare Technologie ist kostengünstig und bietet eine bequeme Überwachung physiologischer Daten. Die Genauigkeit und Zuverlässigkeit dieser Geräte erfordert jedoch eine sorgfältige Bewertung, um ihre Wirksamkeit und Sicherheit für die Benutzer zu gewährleisten. Dieser Bericht beschreibt den Validierungsprozess einer kommerziellen Smartwatch bei der Überwachung physiologischer Daten und körperlicher Aktivität.

Bewertung der Genauigkeit von Fitness-Smartwatch-Daten für die Überwachung von Herz-Kreislauf- und körperlicher Aktivität: Eine Validierungsstudie im Bereich Digital Health

Xenopus embryonalen Epithelien sind ein ideales Modellsystem, um die Zelle Verhaltensweisen wie Polarität Entwicklung und Formänderung beim epithelialen Morphogenese zu studieren. Traditionelle Histologie des festen Proben wird zunehmend durch Live-Cell-konfokale Bildgebung ergänzt. Hier zeigen wir Methoden, um Frosch Gewebe zu isolieren und zu visualisieren leben Epithelzellen und deren Zytoskelett mit Live-cell konfokalen Mikroskopie.

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Quantitative Live Cell Fluoreszenz-Mikroskopie Analyse von Fission Yeast

Erfahren Sie Quantitative Fitness Analysis (QFA) zur genauen Hochdurchsatz-Messung mikrobieller Fitness auf genomweiter Ebene. Diese computergestützte Methode nutzt automatisierte Bildgebung und mathematische Modellierung von Wachstumskurven.

A Quantitative Analysis Fitness-Workflow

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