Die Induktion von Adhäsions-abhängigen Signale mit geringer Intensität Ultraschall

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die molekularen Mechanismen zu verstehen, durch die gepulster Ultraschall oder Lipo mit geringer Intensität die Zellmigration beeinflusst und dadurch die Gewebereparatur beschleunigt. Dies wird erreicht, indem die Zellen zunächst zwei Stunden lang mit Cycloheide behandelt werden, um eine de novo Proteinexpression und damit eine Autostimulation der Zellen zu verhindern. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die abgelösten Zellen zwei Stunden lang auf Oberflächen zu verteilen, die mit einem sorgfältig definierten Matrixliganden beschichtet wurden.

Der dritte Schritt besteht darin, die Zellen mit Ultraschall zu stimulieren, indem die Zellkulturplatten mit den Ultraschallstrahlern gekoppelt werden. Die Ergebnisse können Veränderungen in der fokalen Adhäsionsbildung aufgrund von Ultraschallstimulation durch Färben von Zellen für Cullin und Aktin sowie zeitliche Veränderungen der Rack-Eins-Aktivierung durch aktives RAC One, Pull-Down-Assay und anschließende westliche Blüte zeigen. Diese Methode kann uns helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Adhäsionssignale zu beantworten, wie z.B. kann die physikalische Manipulation von Zellen chemische Reize wie Wachstumsfaktoren oder Fibrinaktin ersetzen?

Und wie löst diese physische Manipulation die Zellmigration aus? Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie chronischer Wunden, denn durch das Verständnis, wie Ultraschall das Zellverhalten beeinflussen kann, können wir möglicherweise Behandlungen verfeinern, um den Wundverschluss bei Personen mit Wundheilungsstörungen wie älteren oder diabetischen Patienten zu beschleunigen. Für biochemische Assays beschichten Sie die Vertiefungen von 3,5 Zentimeter großen Kunststoffplatten direkt mit Integrin-Liganden.

Für die Immunfluoreszenz wird die Abdeckung aus gekochtem Glas dreimal in Milli Q Wasser eingelegt. Positionieren Sie dann vier Deckgläser in jeder 3,5 Zentimeter dicken Platte, derivatisieren Sie die Glasdeckgläser, um eine effiziente Ligandenbeschichtung zu gewährleisten, indem Sie jeweils zwei Milliliter A und ein millimolares Sulfa-MBS hinzufügen, lassen Sie die Reaktion 30 Minuten lang bei Raumtemperatur ablaufen, und waschen Sie dann die derivatisierten Oberflächen dreimal mit PBS. Beschichten Sie nun das derivatisierte Glas mit zwei Millilitern Integrin-Liganden.

Geben Sie den Liganden in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius, bereiten Sie monopartikuläres BSA vor, indem Sie 1 %BSA, gelöst in PBS, 13 Minuten lang auf 85 Grad Celsius erhitzen. Abkühlen lassen und dann durch einen 0,45-Mikron-Filter passieren. Waschen Sie zuerst die mit Liganden beschichteten Oberflächen dreimal mit PBS und blockieren Sie die Oberflächen dann 30 Minuten lang mit dem vorbereiteten Monopartikel-BSA.

Um die Matrixumgebung während des gesamten Experiments zu kontrollieren, sollte die Proteinsynthese durch eine Zugabe von 25 Mikrogramm pro Milliliter Cycloheide zu 80 % konfluenten Fibroblasten für zwei Stunden blockiert werden. Spülen Sie die mit Cycloheide behandelten Zellen mit PBS, trise die Zellen und pelletieren Sie die Zellen. Die Zellen werden in A-D-M-E-M-Lösung bei einer Endkonzentration von 10.000 Zellen pro Milliliter mit Hilfe eines Hämozytometers wieder suspendiert.

Inkubieren Sie nun die resuspendierten Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten. Spülen Sie dann die Platten dreimal mit PBS aus, bevor Sie jeweils zwei Milliliter der Zellsuspension aussäen. Lassen Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid ausbreiten, indem Sie das Ultraschall-Emitter-Array und das Kopplungsgel erwärmen.

Tragen Sie nach dem Erwärmen einen erbsengroßen Klecks Kupplungsgel auf jeden Emittertest auf, um sicherzustellen, dass jeder Emitter funktionsfähig ist. Lassen Sie das Gel mit einem Ultraschall-Diodendetektor den Emitter an den Detektor koppeln. Wenn der Emitter funktionsfähig ist, leuchtet der DDE auf.

Das Gerät verfügt über feste Einstellungen und liefert Ultraschall mit 1,5 Megahertz, gepulst mit einem Kilohertz, was einer Intensität von 30 Milliwatt pro Quadratzentimeter entspricht. Das Gerät schaltet sich nach 20 Minuten automatisch aus. Platzieren Sie die Vertiefungen auf dem Emitter-Array, stellen Sie das Array wieder in einen Inkubator und lassen Sie die Temperatur 10 Minuten lang ausgleichen, schalten Sie das Ultraschallsignal an der Stromversorgung ein.

Das Ultraschallsignal wird nach 20 Minuten deaktiviert. Nachahmung des therapeutischen Regimes, wenn kürzere Stimulationszeiten erforderlich sind. Die Platten können zu gegebener Zeit aus dem Array entfernt werden.

Punkte für längere Stimulationszeiten Platten sollten auf dem Array belassen und sich entwickeln lassen. Der Emitter konnte neu gestartet werden, aber wir haben keinen zusätzlichen Nutzen gesehen, als wir dies getan haben. In allen Fällen sollten unstimulierte Platten als Negativkontrolle verwendet werden.

Zur Analyse der fokalen Adhäsionsbildung wird ein 20-minütiges Ultraschallsignal an S-beschichtete Deckgläser angelegt und dann weitere 40 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert. Dadurch können sich die fokalen Adhäsionen entwickeln. Saugen Sie als Nächstes das Medium ab.

Tragen Sie zwei Milliliter Fixiermittel auf und warten Sie 14 Minuten. Entfernen Sie das Fixiermittel durch Aspiration und spülen Sie die Zellen vorsichtig dreimal vorsichtig mit PBS aus. Tragen Sie das PBS entlang des Kantons der Vertiefung auf und quellen Sie die Lösung vorsichtig auf.

Übertragen Sie nach dem Reinspülen jedes Deckglas aus der 3,5-Zentimeter-Vertiefung auf eine 24-Well-Platte, um anschließend Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen. Nach der gewünschten Stimulationszeit aspirieren Sie das Medium und spülen die Zellen mit PBS auf Eis-Lysa-Zellen in den entsprechenden Lysepuffer für Ihren bevorzugten biochemischen Assay. In der Regel analysieren wir eine Aktivierung durch Effektor-Pulldown-Assay.

Insbesondere könnte diese Methode für die biochemische Analyse eines beliebigen Signalwegs verwendet werden. In diesem Protokoll beschreiben wir die Induktion von vinky und gefärbten fokalen Adhäsionen und die RAC one Aktivität mittels Ultraschall für die fokalen Adhäsionsexperimente. Die Ausgangsposition ist, dass Fibroblasten, die sich auf einem Liganden von alpha fünf beta eins Integrin ausbreiten, keine Finkel und Adhäsionen enthalten, es sei denn, ein zweites Fibroin, das das Rezeptorsyndikat vier verbindet, wird durch Zugabe eines löslichen Liganden aktiviert.

Die Stimulation mit Ultraschall induziert jedoch die fokale Adhäsionsbildung im gleichen Ausmaß wie die Aktivierung von syncom four, was darauf hindeutet, dass die Ultraschallstimulation bestimmte Komponenten des Signalwegs zur Unabhängigkeit des Fibrinhalses ersetzen kann. Als Weiterentwicklung des Basisassays zeigen wir das gleiche Experiment, das mit Fibroblasten ohne INDICUM four wiederholt wird. Diese Fibroblasten sprechen immer noch auf Ultraschall an, aber nicht auf den INDICUM Vier-Liganden.

Dies zeigt, dass Ultraschall tatsächlich den Bedarf an bestimmten Faser-Andum-Rezeptoren umgehen kann. Für das biochemische Experiment zeigen wir, dass Ultraschall die Aktivierung von RAC one induzieren kann, indem wir einen Pulldown-Assay verwenden. Die Ausfällung von aktivem RAC 1 0 10, 30 und 60 Minuten nach Beginn der Ultraschallstimulation zeigt, dass die RAC one-Aktivität 10 bis 30 Minuten vor der Rückkehr zur Ausgangslinie ihren Höhepunkt erreicht. Bloss-Rohlysate für Cullin sorgen für eine gleichwertige Belastung zwischen den Zeitpunkten.

Das Ergebnis ähnelt der Aktivierung von RAC eins durch Einbindung des Syndikats vier, ist aber etwas länger als die Aktivierung durch Fibronektin. Daher sind in der Regel acht bis 10 Wiederholungen erforderlich, um signifikante Daten zu erhalten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, zusätzliche STU-Stimuli zu eliminieren, indem die Proteinsynthese mit Cycloheide vollständig blockiert wird, die Kontamination von Kulturmedien im Experiment vermieden wird und eine Überfüllung der Zellen vermieden wird, die zu Zellkontakten führt.

Andere Methoden wie Scratch-Wound-Assays können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zu stellen, wie z. B. wie Ultraschall die Zellmigration einleitet.