Ein semi-quantitativer Ansatz, um die Biofilmbildung Mit Wrinkled Colony Entwicklung zu bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Veränderungen in der Biofilmbildung zu identifizieren und zu messen, indem die Entwicklung der Faltenkoloniebildung im Laufe der Zeit bewertet wird. Dies wird erreicht, indem zunächst Bakterienstämme, die für sie interessant sind, in Flüssigkulturen gezüchtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Kulturen auf Nähragar zu bringen.

Anschließend werden die Flecken im Laufe der Zeit überwacht, um den Zeitpunkt zu identifizieren, an dem sie beginnen, dreidimensionale Strukturen zu entwickeln, die auf den Beginn der Bildung faltiger Kolonien hinweisen. Die Entwicklung der Koloniemorphologie wird so lange überwacht, bis keine weiteren Veränderungen mehr sichtbar sind. Letztendlich wird die Mikroskopie der Spots verwendet, um Unterschiede in der Biofilmentwicklung im Laufe der Zeit durch bestimmte Stämme oder unter bestimmten Bedingungen semi-quantitativ darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass sie eine semiquantitative Analyse der Bildung von bakteriellen Biofilmen unter Verwendung der Entwicklung der Morphologie der faltigen Kolonie ermöglicht. Obwohl diese Methode Einblicke in die Biofilmbildung in der Vireo-Fischerei geben kann, kann sie auch auf die Charakterisierung von Biofilm-Phänotypen in anderen bakteriellen Systemen wie Basc, SLUS, Pseudomonas osa und Fläschchencholera angewendet werden. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir bakterielle Mutanten identifizierten, die eine Verzögerung der Entwicklung der Faltenkoloniebildung aufwiesen.

Die Bildung von Biofilmen wird im Allgemeinen von der Zelldichte und der Wachstumsrate beeinflusst. Daher sollten vor der Beurteilung der Morphologie der runzeligen Kolonie die Wachstumsrate und der Ertrag der interessierenden Stämme bestimmt werden, um die Wachstumsrate zu bestimmen. Messen Sie die Zunahme der optischen Dichte oder OD jedes Stammes im Laufe der Zeit und zeichnen Sie eine Wachstumskurve, um die Ausbeute oder die endgültige Zellzahl zu bestimmen.

Es kann ein Zellplattierungsassay verwendet werden. Die interessierenden Bakterienstämme werden in Flüssigkulturen gezüchtet, und dann werden Verdünnungen der Kulturen auf Agarplatten plattiert. Nach der Inkubation wird die Anzahl der lebensfähigen Zellen berechnet und grafisch dargestellt, wie hier gezeigt.

Es ist auch wichtig, die besten Bedingungen für die Erkennung von Bedingungen zu identifizieren, die die deutlichsten Unterschiede zwischen der Kontrolle und der interessierenden Mutante aufweisen. Um dies vor dem Erkennen von Wachstumsstämmen in Flüssigkulturen unter verschiedenen Bedingungen, wie z. B. unterschiedlichen Medien oder Temperaturen, und in verschiedenen Wachstumsstadien, wie exponentieller oder stationärer Phase, zu erreichen, werden 10 Mikroliter Kultur mit unterschiedlichen Zelldichten auf das geeignete Medium aufgesetzt und bei der gewünschten Temperatur inkubiert, bis Koloniemorphologien sichtbar werden. Auf diese Weise kann ein optimaler Start-OD für einen gegebenen Satz von Dehnungen oder Bedingungen bestimmt werden, um dieses Verfahren zu beginnen.

Inokulieren v Fisher-Augenzellen aus Agarplatten in fünf Milliliter LB-Salz oder LBS-Medium, das alle erforderlichen Antibiotika enthält, inkubieren unter Schütteln bei 28 Grad Celsius über Nacht am folgenden Morgen, inkubieren die Zellen mit einer Verdünnung von 1 bis 100 in fünf Milliliter frisches LBS-Medium, inkubieren unter den gleichen Bedingungen, bis die Zellen den gewünschten OD bei 600 Nanometern erreicht haben. Für Vibrio fii werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn Flecken aus Kulturen mit einem OD von etwa 0,2 erzeugt werden. Anschließend einen Milliliter jeder Kultur in ein Mikrofuge-Röhrchen pipettieren und bei maximaler Geschwindigkeit zentrifugieren.

Entfernen Sie eine Minute lang das Supinat durch Aspiration und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter sterilem, 70%igem künstlichem Meerwasser oder einer SW-Zentrifuge. Die Zellen werden in diesem Waschschritt wieder Medienreste und extrazelluläre Bestandteile entfernt. Entfernen Sie nach der Zentrifugation das Supinat und resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in einem Milliliter 70%A SW, um sicherzustellen, dass jede Probe die Anzahl der Zellen enthält, die auf den OD.At 600 Nanometer geschätzt wird.

Nehmen Sie alle erforderlichen Anpassungen vor, indem Sie konzentriertere Proben mit zusätzlichem 70%A SW-Spot, 10 Mikroliter jeder Kultur, auf LBS-Platten verdünnen, die alle erforderlichen Antibiotika enthalten. Stellen Sie sicher, dass Sie die Pipette mit dem Finger direkt über der Agaroberfläche untersuchen und vertikal und nicht schräg platzieren. Stoßen Sie die Flüssigkeit langsam aus, um eine gleichmäßige Verteilung des Flecks zu gewährleisten, und fügen Sie die entsprechenden Positiv- und Negativkontrollen auf derselben Platte hinzu.

Bei der Beurteilung der Bildung faltiger Kolonien als kleinere Platten kann die AFL-Variation die Biofilmentwicklung beeinflussen. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Identifizierung des Beginns der Bildung faltiger Kolonien. Manchmal zeigt es sich erst nach der Entwicklung.

Um den Beginn der Entwicklung der Faltenkolonie zu erfassen, nehmen wir stündliche Zeitpunkte innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens. Dies ermöglicht es uns auch, zurückzugehen und Vergleiche anzustellen, nachdem die Entwicklung begonnen hat. Um sicherzustellen, dass die Fleckenkultur gleichmäßig verteilt bleibt, lassen Sie den Fleck trocknen, bevor Sie die Platte in den Inkubator stellen, drehen Sie die Platten um und inkubieren Sie sie bei 28 Grad Celsius.

Eine Möglichkeit, die Morphologie der gefleckten Kulturen zu beurteilen, ist ein Endpunkt-Assay, bei dem die Bildung einer faltigen Kolonie und ein vorher festgelegter Zeitpunkt nach der Schmierblutung beurteilt werden. Dies ist ein repräsentatives Ergebnis eines Endpunkt-Assays, in dem die Bildung von faltigen Kolonien beurteilt wurde. 40 Stunden nach der Schmierblutung ist links ein nicht biofilmbildender Stamm von Vibrio FII und rechts ein biofilmbildender Stamm zu sehen.

Der Endpunkt-Assay ist nützlich für Stämme, die schwere Defekte bei der Biofilmbildung aufweisen oder aufweisen sollen. Ein weiterer Assay zur Beurteilung der Koloniemorphologie ist ein Zeitverlaufs-Assay, bei dem die Bildung faltiger Kolonien über einen Zeitraum nach der Schmierblutung beurteilt wird, um die Zeit nach der Schmierblutung leicht im Auge zu behalten. Stellen Sie einen Timer ein, um hochzuzählen.

In dieser Demonstration wird die Morphologie des Wachstumsflecks stündlich, beginnend nach 12 bis 15 Stunden, mit einem Präparierfernrohr mit Kameraaufsatz sowie der Bildaufnahme und Bildanalyse überwacht. Softwareprogramme werden eingesetzt, um die Morphologie der Kolonie zu beobachten und zu dokumentieren und den Beginn und das Fortschreiten der Faltenkoloniebildung zu beurteilen. Vor der Abbildung von Fleckenkulturen wird in der Regel der Deckel der Petriplatte entfernt, um ein möglichst klares Bild zu erhalten.

Dabei werden die Spots von unten durch eine transparente Glasbühne mit einer Kaltlichtquelle beleuchtet, während die Bilder von oben aufgenommen werden. Dieser Aufbau ist optimal für die Darstellung der Entwicklung faltiger Kolonien, da Vibrio-Fischauge-Kolonien durchscheinend sind. Um die Entwicklung faltiger Kolonien am besten sichtbar zu machen, passen Sie sowohl die Beleuchtungsintensität als auch den Reflexionswinkel unter den Bakterienkolonien so an, dass die dreidimensionale Morphologie der sich entwickelnden Biofilme erkennbar ist.

Bestimmen Sie die optimalen Lichtverhältnisse, die den stärksten Kontrast zwischen der gefleckten Kolonie und dem umgebenden Agar-Hintergrund bieten. Es ist wichtig, die gleiche Vergrößerung zu verwenden, wenn Sie während des gesamten Experiments Bilder mit dem Hebel auf der Rückseite der Kamera aufnehmen, den Blick vom Okular des Mikroskops auf den Computerbildschirm umschalten, die Ansicht anpassen, entsprechend fokussieren und dann das Bild aufnehmen, geeignete Bilder aufnehmen, um den Beginn und die Entwicklung der faltenförmigen Koloniebildung zu dokumentieren. Das Ende des Versuchs ist da, wenn sich der Biofilm nicht weiter entwickelt.

Am Ende der aufgenommenen Experimente werden die Bilder zu Zahlen zusammengefasst, um die Musterentwicklung im Laufe der Zeit für jede Dehnung oder jeden Zustand zu visualisieren. Beachten Sie, wie viel Zeit zwischen dem Zeitpunkt der Inokulation und dem Zeitpunkt, an dem die Bildung einer faltigen Kolonie den Beginn der Bildung einer faltigen Kolonie einleitet, zu dem Zeitpunkt vergeht, an dem die Bildung von Musterungen und 3D-Strukturen zum ersten Mal sichtbar wird. In diesem Beispiel ist die Initiierung der Biofilmbildung nach 12 Stunden für einen biofilmkompetenten Kontrollstamm von Vibrio FII offensichtlich, der im oberen Bild dargestellt ist.

Im unteren Bild sehen Sie ein repräsentatives Bild eines mutierten Stammes von Vibrio FII, der im Laufe der Zeit eine vierstündige Verzögerung beim Beginn der Bildung faltiger Kolonien aufweist, wobei die Biofilmbildung 16 Stunden nach der Inokulation beginnt. Beachten Sie, dass zwar subtile Unterschiede zwischen diesen Stämmen zu den früheren Zeitpunkten nach 40 Stunden beobachtet werden, die Stämme jedoch in der Intensität und Musterung der Biofilmbildung zu jedem Zeitpunkt nach dem Beginn der Bildung faltiger Kolonien ähnlich aussehen. Zu beachten ist das Muster der Entwicklung einer faltigen Kolonie.

Die Architektur kann sich von außen nach innen entwickeln, wie in Panel A dargestellt, oder sie kann sich von innen nach außen entwickeln, wie in Panel B dargestellt. Diese Bewertung bietet einen Mechanismus zur Unterscheidung der Biofilme, die von verschiedenen Stämmen oder unter verschiedenen Bedingungen gebildet werden. Ein zweites semiquantitatives Maß für die Biofilmbildung nutzt den sich im Laufe der Zeit ändernden Koloniedurchmesser der sich entwickelnden Kolonie. Wie im oberen Bild gezeigt, bildet sich ein repräsentativer Biofilm-Kompetenzstamm, Kolonien, die an Komplexität und Durchmesser zunehmen.

Im Gegensatz dazu bildet ein anderer Stamm im unteren Bild keine Biofilme. Schließlich zeigt diese Abbildung eine grafische Darstellung der Zunahme des Koloniedurchmessers im Laufe der Zeit. Bei den gleichen beiden Stämmen wird der Biofilm-Kompetenzstamm durch weiße Kreise dargestellt.

Während der Stamm, der keine Biofilme bildet, durch schwarze Quadrate dargestellt wird. Diese Analyse zeigte, dass die Größe der Biofilm-kompetenten Kolonien stärker zunahm als die der Biofilm-negativen Kolonien, und zum Endzeitpunkt unterschieden sich die beiden um fast das Zweifache. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Stamm sorgfältig zu erkennen und die Bildung einer runzeligen Starterkolonie für jeden Stamm zu dokumentieren.

Im Anschluss an dieses Protokoll können weitere Methoden wie ein iCal-Assay oder eine kristallweite Färbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den Prozessen und der Biofilmbildung zu beantworten.