Ein semi-quantitativer Ansatz, um die Biofilmbildung Mit Wrinkled Colony Entwicklung zu bewerten

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Veränderungen in der Biofilmbildung zu identifizieren und zu messen, indem die Entwicklung faltiger Koloniebildung über die Zeit bewertet wird. Dies wird erreicht, indem zunächst die interessierenden Bakterienstämme in flüssiger Kultur angezogen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Kulturen auf Nähragar aufzutragen.

Anschließend werden die Kolonien über einen bestimmten Zeitraum beobachtet, um den Zeitpunkt zu bestimmen, zu dem sie dreidimensionale Strukturen ausbilden, die auf den Beginn der Bildung faltiger Kolonien hinweisen. Die Entwicklung der Kolonienmorphologie wird so lange überwacht, bis keine weiteren Veränderungen mehr sichtbar sind. Letztendlich dient die Mikroskopie der Flecken dazu, Unterschiede in der Biofilmbildung im Zeitverlauf durch spezifische Stämme oder unter bestimmten Bedingungen auf semi-quantitative Weise darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden liegt darin, dass sie eine semiquantitative Analyse der bakteriellen Biofilmbildung durch die Entwicklung einer faltigen Kolonienmorphologie ermöglicht. Obwohl diese Methode Einblicke in die Biofilmbildung bei Vireo fishery ermöglichen kann, ist sie auch auf die Charakterisierung von Biofilm-Phänotypen in anderen bakteriellen Systemen wie basc, slus, pseudomonas osa und vial cholera anwendbar. Die Idee zu dieser Methode entstand erstmals, als wir bakterielle Mutanten identifizierten, die eine Verzögerung in der Entwicklung faltiger Kolonienbildung zeigten.

Die Biofilmbildung wird im Allgemeinen durch die Zelldichte und die Wachstumsrate beeinflusst. Daher sollten vor der Beurteilung der runzeligen Kolonie-Morphologie die Wachstumsrate und die Ausbeute der interessierenden Stämme bestimmt werden, um die Wachstumsrate zu ermitteln. Messen Sie den Anstieg der optischen Dichte oder OD jedes Stammes im Zeitverlauf und stellen Sie eine Wachstumskurve auf, um die Ausbeute oder die endgültige Zellzahl zu bestimmen.

Mithilfe eines Zellausstrich-Assays kann dies durchgeführt werden. Die interessierenden Bakterienstämme werden in flüssiger Kultur gezüchtet, und anschließend werden Verdünnungen der Kulturen auf Agarplatten ausgestrichen. Nach der Inkubation werden die Anzahl der lebensfähigen Zellen berechnet und grafisch wie hier gezeigt dargestellt.

Es ist ebenfalls wichtig, die besten Bedingungen für das Auftragen zu ermitteln, die die deutlichsten Unterschiede zwischen der Kontrolle und dem untersuchten Mutanten offenbaren. Um dies zu erreichen, sollten vor dem Auftragen Wachstumsstämme in Flüssigkultur unter verschiedenen Bedingungen – beispielsweise in unterschiedlichen Medien oder bei verschiedenen Temperaturen – sowie in verschiedenen Wachstumsphasen, wie beispielsweise exponentieller oder stationärer Phase, kultiviert werden. Anschließend 10 Mikroliter Kultur verschiedener Zelldichten auf das jeweils geeignete Medium auftragen und bei der gewünschten Temperatur inkubieren, bis die Kolonie-Morphologien sichtbar werden. Auf diese Weise kann ein optimaler Start-OD für einen bestimmten Satz von Stämmen oder Bedingungen ermittelt werden, um mit diesem Verfahren zu beginnen.

Inokulieren Sie v Fisher Augenzellen von Agarplatten in fünf Milliliter LB-Salz- oder LBS-Medium, das gegebenenfalls Antibiotika enthält; inkubieren Sie über Nacht bei 28 Grad Celsius unter Schütteln. Am folgenden Morgen überimpfen Sie die Zellen im Verdünnungsverhältnis 1:100 in fünf Milliliter frisches LBS-Medium und inkubieren unter denselben Bedingungen, bis die Zellen die gewünschte Extinktion bei 600 Nanometern erreicht haben. Für Vibrio fii werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn die Spots aus Kulturen mit einem OD von etwa 0,2 erzeugt werden. Danach pipettieren Sie ein Milliliter jeder Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren mit maximaler Drehzahl.

Entfernen Sie eine Minute lang das Überstand durch Aspiration und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter steriler, 70%iger künstlicher Meerwasserlösung oder einer SW-Zentrifuge. Dieser Waschschritt entfernt erneut restliche Medien und extrazelluläre Bestandteile. Nach der Zentrifugation entfernen Sie den Überstand und resuspendieren das gewaschene Pellet in einem Milliliter 70%iger A-SW, um sicherzustellen, dass jede Probe die durch die Extinktionsmessung bei 600 Nanometern geschätzte Anzahl an Zellen enthält.

Nehmen Sie erforderlichenfalls Anpassungen vor, indem Sie konzentriertere Proben mit zusätzlicher 70 % A SW-Auftragslösung verdünnen, jeweils 10 Mikroliter jeder Kultur auf LBS-Platten mit den erforderlichen Antibiotika auftragen. Achten Sie darauf, die Pipette mit dem Finger knapp über der Agaroberfläche zu führen und den Tropfen senkrecht, nicht schräg, aufzutragen. Drücken Sie die Flüssigkeit langsam aus, um eine gleichmäßige Verteilung des Auftrags zu gewährleisten, und führen Sie auf derselben Platte die entsprechenden positiven und negativen Kontrollen durch.

Bei der Beurteilung der faltigen Koloniebildung als geringfügige Merkmale kann die AFL-Variation die Biofilmbildung beeinflussen. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens besteht darin, den Beginn der faltigen Koloniebildung zu identifizieren. Manchmal wird dieser erst nach Einsetzen der Entwicklung deutlich.

Um den Beginn der Faltenkolonieentwicklung zu erfassen, nehmen wir stündliche Zeitpunkte innerhalb eines bestimmten Zeitraums auf. Dies ermöglicht es uns außerdem, rückwärtszugehen und Vergleiche vorzunehmen, nachdem die Entwicklung begonnen hat. Um sicherzustellen, dass die aufgetropfte Kultur gleichmäßig verteilt bleibt, lassen Sie den Tropfen vor dem Einbringen der Platte in den Inkubator trocknen, stellen die Platten umgedreht ein und inkubieren sie bei 28 Grad Celsius.

Eine Möglichkeit, die Morphologie der punktförmig ausgestrichenen Kulturen zu beurteilen, ist ein Endpunkt-Assay, bei dem die Bildung faltiger Kolonien zu einem vorbestimmten Zeitpunkt nach dem Auftragen bewertet wird. Dieses Ergebnis zeigt einen repräsentativen Endpunkt-Assay, bei dem die Bildung faltiger Kolonien untersucht wurde. 40 Stunden nach dem Auftragen ist auf der linken Seite ein nicht biofilmbildender Stamm von Vibrio FII dargestellt, auf der rechten Seite ein biofilmbildender Stamm.

Der Endpunkt-Test ist nützlich für Stämme, die schwere Defekte in der Biofilmbildung aufweisen oder bei denen solche Defekte vermutet werden. Ein weiterer Test zur Beurteilung der Kolonie-Morphologie ist ein Zeitverlaufs-Test, bei dem die Bildung faltiger Kolonien über einen bestimmten Zeitraum nach dem Auftragen beurteilt wird, um den Zeitpunkt nach dem Auftragen einfach verfolgen zu können. Stellen Sie einen Timer so ein, dass er die vergangene Zeit anzeigt.

In dieser Demonstration wird die Morphologie des wachsenden Kolonieflecks stündlich überwacht, beginnend 12 bis 15 Stunden nach dem Auftragen, mithilfe eines Auflichtmikroskops mit Kameraanbindung sowie Bildaufnahme- und Bildanalysesoftware. Mit Hilfe dieser Programme werden die Koloniemorphologie beobachtet und dokumentiert sowie der Beginn und die Entwicklung der Bildung faltiger Kolonien bewertet. Vor der Bildaufnahme der aufgetragenen Kulturen wird der Deckel der Petrischale in der Regel entfernt, um ein möglichst klares Bild zu erhalten.

Hier werden die Kolonien von unten über eine transparente Glasplatte mit einer Kaltlichtquelle beleuchtet, während die Bilder von oben aufgenommen werden. Dieser Aufbau ist optimal für die Abbildung der Entwicklung faltiger Kolonien, da Vibrio fischeri-Kolonien durchscheinend sind. Um die Entwicklung faltiger Kolonien am besten sichtbar zu machen, sollten sowohl die Lichtintensität als auch der Reflexionswinkel unterhalb der bakteriellen Kolonien so eingestellt werden, dass die dreidimensionale Morphologie der wachsenden Biofilme erkannt werden kann.

Bestimmen Sie die optimalen Beleuchtungsbedingungen, die den stärksten Kontrast zwischen der punktförmigen Kolonie und dem umgebenden Agar-Untergrund gewährleisten. Es ist wichtig, während des gesamten Experiments die gleiche Vergrößerung zu verwenden, die über den Hebel an der Rückseite der Kamera eingestellt wird; schalten Sie die Ansicht vom Okular des Mikroskops auf den Computerbildschirm um, passen Sie die Ansicht entsprechend an, fokussieren Sie und nehmen Sie dann das Bild auf. Erfassen Sie geeignete Aufnahmen, um den Beginn und die Entwicklung der Bildung faltiger Kolonien zu dokumentieren. Das Ende des Experiments tritt ein, wenn keine weitere Entwicklung des Biofilms mehr zu beobachten ist.

Am Ende der durchgeführten Experimente werden die aufgezeichneten Bilder zu Abbildungen zusammengefasst, um die Musterentwicklung im Zeitverlauf für jeden Stamm bzw. jede Bedingung zu veranschaulichen. Beachten Sie, wie viel Zeit zwischen dem Zeitpunkt der Inokulation und dem Zeitpunkt vergeht, zu dem die Bildung von faltigen Kolonien beginnt. Der Beginn der faltigen Kolonienbildung wird als der Zeitpunkt definiert, zu dem die Ausbildung von Mustern und dreidimensionalen Strukturen erstmals erkennbar ist. In diesem Beispiel ist der Beginn der Biofilmbildung nach 12 Stunden bei einem biofilmbildungskompetenten Kontrollstamm von Vibrio FII, dargestellt im oberen Panel, erkennbar.

Im unteren Panel ist ein repräsentatives Bild eines Mutantenstamms von Vibrio FII dargestellt, der eine vierstündige Verzögerung beim Beginn der faltigen Koloniebildung über die Zeit aufweist, wobei die Biofilmbildung 16 Stunden nach der Inokulation einsetzt. Beachten Sie, dass zwar bei früheren Zeitpunkten, wie nach 40 Stunden, subtile Unterschiede zwischen diesen Stämmen beobachtet werden, die Stämme jedoch ab dem Beginn der faltigen Koloniebildung bei jeder nachfolgenden Zeitpunkten hinsichtlich Intensität und Musterung der Biofilmbildung ähnlich erscheinen. Das Muster der Entwicklung faltiger Kolonien sollte beachtet werden.

Die Architektur kann sich von außen nach innen entwickeln, wie in Panel A veranschaulicht, oder von innen nach außen, wie in Panel B dargestellt. Diese Beurteilung bietet einen Mechanismus, um Biofilme zu unterscheiden, die von verschiedenen Stämmen oder unter unterschiedlichen Bedingungen gebildet werden. Ein zweites halbquantitatives Maß für die Biofilmbildung nutzt die zeitliche Änderung des Koloniedurchmessers der wachsenden Kolonie. Wie im oberen Panel gezeigt, bildet ein repräsentativer Biofilm-kompetenter Stamm Kolonien, die an Komplexität und Durchmesser zunehmen.

Im Gegensatz dazu bildet ein weiterer Stamm, der im unteren Panel gezeigt wird, keine Biofilme. Schließlich zeigt diese Abbildung eine grafische Darstellung der Zunahme des Koloniedurchmessers über die Zeit. Für dieselben beiden Stämme wird der Biofilm-kompetente Stamm durch weiße Kreise dargestellt.

Während der Stamm, der keine Biofilme bildet, durch schwarze Quadrate dargestellt wird. Diese Analyse zeigte, dass die Größe der biofilmbildenden Kolonien stärker ansteigt als die der biofilmnegativen Kolonien, und zum Endzeitpunkt unterschieden sich beide um fast den doppelten Faktor. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, jeden Stamm sorgfältig aufzutragen und die Ausbildung der ursprünglichen runzeligen Kolonien für jeden Stamm zu dokumentieren.

Nach diesem Protokoll können andere Methoden wie ein iCal-Assay oder eine kristallweite Färbung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu den beteiligten Prozessen und der Biofilmbildung zu beantworten.