Maus-Modell der Intraluminal MCAO: Hirninfarkt Evaluation durch Cresylviolett Staining

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen nachzuahmen. Zunächst wird die Arteria carotis communis vorübergehend ligiert, während die Arteria carotis externa so distal wie möglich dauerhaft ligiert wird. Eine weitere vorübergehende Naht, die leicht straff angelegt wird, wird oberhalb der Bifurkation an der ECA platziert.

Der zweite Schritt besteht darin, die Arteria carotis interna mit einer Pinzette mit umgekehrter Wirkung zu klemmen, um Blutungen zu vermeiden. Anschließend wird die A. carotis externa zwischen der permanenten und der vorübergehenden Ligatur durchtrennt. Danach wird das silikonbeschichtete Monofil eingeführt in die A. carotis externa.

Anschließend wird die ECA umgekehrt, um das Monofilament in die A. cerebri interna einzuführen, bis die Basis der Arteria cerebri media erreicht ist. Eine Stunde später wird der Blutfluss durch Entfernen des Monofilaments wiederhergestellt, um die Wiederherstellung des Blutflusses nach der Lyse eines thromboembolischen Klumpens beim Menschen zu simulieren. Letztendlich kann die neurologische Defizitbewertung, die den Erfolg des T-M-C-A-O und die Schwere des Infarkts widerspiegelt, unmittelbar nach der Reperfusion sowie zu verschiedenen Zeitpunkten danach durchgeführt werden.

Die Cyan-Image-Software des NIH wird verwendet, um das Infarctvolumen auf repräsentativen Gehirnschnitten zu berechnen, die mit Cresylviolett gefärbt wurden. Einer der Hauptvorteile der transitorischen Okklusion der mittleren Hirnarterie mittels intraluminaler Fadenmethode besteht darin, dass sie den ischämischen Schlaganfall beim Patienten nachahmt, bei dem die Durchblutung wiederhergestellt wird; die Entwicklung dieses Verfahrens bei Mäusen ermöglicht zudem den Einsatz genetischer Markierungswerkzeuge, um die Rolle eines Zielproteins zu bestimmen. Bei Schlaganfall wird die transitorische Okklusion der mittleren Hirnarterie an zwei bis drei Monate alten männlichen C57BL/6-Mäusen mit einem Gewicht zwischen 22 und 28 Gramm durchgeführt.

Dieses Protokoll wurde vom Bioethik-Ausschuss des IRCM genehmigt, um die Reproduzierbarkeit des Infarctvolumens zu erhöhen. Wir verwenden wiederverwendbare, 12 Millimeter lange, mit sechs Ohm Silizium beschichtete Monofile von der Doco Corporation. Zwei Stunden vor der Operation.

Spritzen Sie einer Maus Buprenorphin intraperitoneal in einer Dosis von 0,03 Milligramm pro Kilogramm. Um das Verfahren zu beginnen, betäuben Sie die Mäuse mit 5 % Isofluran und führen die Narkose mit 2,5 % Isofluran fort. Verwenden Sie eine Heizplatte, um die Körpertemperatur der Maus während des Eingriffs konstant zu halten. Desinfizieren Sie die Fellhaut der Maus mit 70 %igem Ethanol oder Betadine. Führen Sie dann einen medianen Hautschnitt im Halsbereich durch und trennen Sie das darunterliegende Weichgewebe unter dem Stereomikroskop.

Präparieren Sie den Nacken der Maus stumpf, um die Luftröhre freizulegen. Ziehen Sie anschließend die Muskulatur zurück, um die A. carotis zu lokalisieren. Präparieren Sie die linke Arteria carotis communis vorsichtig vom umgebenden Gewebe ab.

Legen Sie eine vorübergehende Seidennaht (5-0), die in 20 mm lange Abschnitte geschnitten wurde, um die Arterie. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu beschädigen. Trennen Sie danach die Aufteilung der linken inneren gemeinsamen Carotis (Arteria carotis communis interna, ICA) und der äußeren gemeinsamen Carotis (Arteria carotis communis externa, ECA). Legen Sie eine dauerhafte Naht so weit distal wie möglich um die ECA.

Und eine weitere vorübergehende Naht an der A. carotis externa oberhalb der Bifurcatio. Dann die linke A. carotis interna mit einer Pinzette mit Umkehrmechanismus abklemmen, um Blutungen zu vermeiden. Auch hier unbedingt darauf achten, den Nervus vagus nicht zu verletzen.

Schneiden Sie ein kleines Loch in die A. carotis externa (ECA), bevor sie sich in die A. carotis externa und die A. carotis interna (ICA) aufteilt, und zwischen den zuvor platzierten permanenten und temporären Nähten. Führen Sie anschließend eine zwölf Millimeter lange, mit Silikon beschichtete, sechsfach gefaltete Monofile-Naht in die vollständig durchtrennte A. carotis externa ein und invertieren Sie das Monofil in die A. carotis interna. Knoten Sie die Naht fest, um Blutungen zu verhindern, und entfernen Sie die Reverse-Action-Pinzette.

Danach wird das Monofilament in die Arteria cerebri media bis zum Verschluss der Basis der A. cerebri media im Kreis von Willis eingeführt. Die Einführung erfolgt etwa neun bis zehn Millimeter jenseits der Bifurkation der A. carotis externa und der A. carotis communis. In der Regel wird das Monofilament blockiert und kann sich nicht weiter bewegen.

Beachten Sie, die Arteria tegumentalis palatina nicht zu durchbohren. Knoten Sie die Naht an der A. carotis externa fest, um den Faden in Position zu fixieren. Schließen Sie nun die Haut mit einem automatischen Clip-Wundverschlusssystem.

Injizieren Sie ein Milliliter Kochsalzlösung subkutan und stellen Sie die Mäuse während der Nach-Okklusionsphase, die 60 Minuten beträgt, unter eine Infrarot-Heizlampe. Betäuben Sie die Mäuse wie zuvor und entfernen Sie die Autoklammern, öffnen Sie die Naht an der A. carotis externa leicht, um dem Monofilament zu ermöglichen, sich zurückzuziehen, und um die Wiederdurchblutung des Blutes zu erlauben. Danach binden Sie die vorübergehende Naht an der A. carotis externa dauerhaft zu, um Blutverlust zu verhindern.

Eine Stunde nach dem Schlaganfall das Monofilament zurückziehen und für die Wiederverwendung aufbewahren. Anschließend die vorübergehende Naht an der A. carotis communis entfernen, um die Wiederdurchblutung zu ermöglichen. Die Wunde verschließen und subkutan nähen.

Injizieren Sie ein weiteres Milliliter Kochsalzlösung in die Mäuse. Stellen Sie sicher, dass das Tier seine Beweglichkeit zurückgewinnt, setzen Sie es dann zurück in seinen Käfig und platzieren Sie die Hälfte des Käfigs auf der Heizplatte, damit die Mäuse ihren Aufenthaltsort wählen können. Zwölf Stunden nach der Operation erhalten die Mäuse eine weitere Dosis Buprenorphin für alle Scheinoperationen.

Alle Verfahren sind identisch, mit der Ausnahme, dass das Monofilament nach der Operation nicht eingeführt wird. Die neurologische Defizitbewertung dient zur Bestätigung des Erfolgs der T-M-C-A-O und zur Ermittlung ihrer Effizienzpunktzahl. Die neurologischen Defizite der Mäuse werden 1, 24, 48 und 72 Stunden nach der Perfusion auf einer sechspunktigen Skala wie folgt bewertet: null entspricht normal, eins entspricht leicht, Drehverhalten mit oder ohne inkonsistentes Zusammenrollen beim Aufheben am Schwanz. Mehr als 50 % der Versuche, sich zur kontralateralen Seite hinzukrümmen.

Zwei bedeutet eine milde, konsistente Krümmung bei über 50 % der Versuche, zur kontralateralen Seite zu krümmen. Drei bedeutet eine konsistente, starke und sofortige Krümmung. Die Maus hält eine gekrümmte Position länger als ein bis zwei Sekunden.

mit der Nase fast bis zur Schwanzspitze. Vier bedeutet starke Krümmung. Fortschreitend in Richtung Verlust des Geh- oder Schreibreflexes; fünf entspricht Koma oder Haufenbildung.

Nach der Perfusion mit PBS-Lösung die Gehirne schnell in Isopentan abkühlen und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Beachten Sie, dass Mausgehirne je nach geplanten immunhistochemischen Untersuchungen auch mit 4 % Paraformaldehyd perfundiert werden können. Anschließend im Kryostat 17 µm dicke koronare Gehirnschnitte anfertigen, wobei 30 Objektträger verwendet werden.

Legen Sie jeweils einen Schnitt von je 30 auf dieselbe Objektträger. Färben Sie dann den ersten und den 15. Objektträger mit Cresylviolett. Zur genaueren Abschätzung des Verletzungsvolumens verwenden Sie ein Bildanalysesystem wie Scion Image des NIH, um die Läsionsgrenze, den Infarktbereich, der im linken und rechten Gehirnhemisphäre weiß erscheint, zu bewerten.

Wiederholen Sie diese D-Begrenzung für alle Gehirnschnitte. Berechnen Sie das Infarktvolumen in willkürlichen Einheiten und geben Sie es als Prozentsatz der kontralateralen, nicht geschädigten Fläche für jeden Schnitt an. Lagern Sie die übrigen Präparate bei minus 80 Grad Celsius für immunhistochemische Untersuchungen ein.

Die Bewertung des neurologischen Scores bestätigt den Erfolg der T-M-C-A-O bei meinen Versuchstieren, die dem intraluminalen Verfahren unterzogen wurden. Wie hier zu sehen ist, treten konsistente, starke und mittlere Einrollungen auf, wobei die Maus eine eingerollte Position länger als ein bis zwei Sekunden beibehält und ihre Nase dabei fast bis zum Schwanz reicht. In unserem Experiment zeigten alle Mäuse zumindest ein leichtes, konsistentes Einrollen, was während des gesamten Testzeitraums einem neurologischen Score von zwei entspricht.

Die Kressel-Violett-Färbung wurde durchgeführt, um das Ausmaß des Hirninfarkts zu beurteilen. Nach der hier gezeigten T-M-C-A-O sind repräsentative koronare Schnitte des Maushirns nach 72 Stunden post Reperfusion mit Kresselviolett gefärbt. Der Infarktbereich, hauptsächlich Striatum und Kortex sowie angrenzende Hirnareale, die markiert sind, erscheint weiß, da er nicht durch Kresselviolett angefärbt wird.

Violett dargestellt ist das Verletzungsvolumen, das den weißen Teil der rechten Hemisphäre als Prozentsatz des kontralateralen, nicht geschädigten Bereichs der linken Hemisphäre ausdrückt. Das Infarktvolumen bei männlichen C57BL/6-Mäusen nach ischämischem Schlaganfall beträgt etwa 70 % der nicht geschädigten Hemisphäre. Dieses Verfahren ermöglicht eine hohe Reproduzierbarkeit der Läsion.

Nachdem Sie dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen transitorischen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen durchführt. Außerdem bietet die Quiz-von-Ansatz-Methode zur Messung Ihres Hirninfarktvolumens den großen Vorteil, dass Sie über viel Material verfügen, um relevante Marker mittels Immunchemie zu testen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihrem Experiment.