Maus-Modell der Intraluminal MCAO: Hirninfarkt Evaluation durch Cresylviolett Staining

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen nachzuahmen. Zunächst wird die Arteria carotis communis temporär ligiert, während die Arteria carotis externa so distal wie möglich dauerhaft ligiert wird. Eine weitere provisorische Naht, die etwas eng anliegt, wird oberhalb der Bifurkation auf dem ECA platziert.

Der zweite Schritt besteht darin, die Arteria carotis interna mit einer Pinzette mit umgekehrter Wirkung zu klemmen, um Blutungen zu vermeiden. Schneiden Sie dann die ECA zwischen den permanenten und temporären Ligaturen. Als nächstes wird das silikonbeschichtete Monofilament in die ECA eingebracht.

Dann wird die ECA invertiert, um das Monofilament in die ICA einzuführen, bis es die Basis der mittleren Hirnarterie umfasst. Eine Stunde später wird der Blutfluss durch Entfernen des Monofilaments wiederhergestellt, um die Wiederherstellung des Blutflusses nach der Lyse einer thromboembolischen Klaue beim Menschen nachzuahmen. Letztendlich kann das neurologische Defizit, das den Erfolg von T-M-C-A-O und die Schwere des Infarkts widerspiegelt, direkt nach der Reperfusion und zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Reperfusion beurteilt werden.

Die Cyan-Bildsoftware des NIH wird verwendet, um das Infarktvolumen auf repräsentativen Hirnschnitten zu berechnen, die mit krestalem Violett gefärbt sind. Einer der Hauptvorteile des vorübergehenden Verschlusses der mittleren Hirnarterie unter Verwendung der intraluminalen Filamenttechnik besteht darin, dass er einen ischämischen Schlaganfall beim Patienten mit der Wiederherstellung des Blutflusses nachahmt, und die Entwicklung dieses Verfahrens bei Mäusen bietet die Möglichkeit, ein markierungsgenetisches Werkzeug zu verwenden, um die Rolle eines Zielproteins zu identifizieren. Bei Schlaganfall wird ein vorübergehender Verschluss der mittleren Hirnarterie an zwei bis drei Monate alten männlichen C 57 schwarzen sechs Mäusen mit einem Gewicht zwischen 22 und 28 Gramm durchgeführt.

Dieses Protokoll wurde vom IRCM Bioethics Care Committee genehmigt, um die Reproduzierbarkeit des Infarktvolumens zu erhöhen. Wir verwenden wiederverwendbare 12 Millimeter lange, sechs oh silikonbeschichtete Monofilamente der Doco Corporation. Zwei Stunden vor der Operation.

Injizieren Sie einer Maus intraperitoneal Buprenorphin in einer Dosis von 0,03 Milligramm pro Kilogramm. Um den Eingriff zu beginnen, betäuben Sie die Mäuse mit 5 % Fluor und halten Sie die Anästhesie bei 2,5 % ISO-Fluor aufrecht. Verwenden Sie ein Heizkissen, um die Körpertemperatur der Maus während der Operation konstant zu halten, desinfizieren Sie die Farnhaut der Maus mit 70 % Ethanol oder Betadin. Machen Sie dann einen Mittellinienschnitt im Hals und ziehen Sie die Weichteile unter einem Stereomikroskop auseinander.

Präparieren Sie den Maushals stumpf, um die Luftröhre freizulegen. Als nächstes ziehen Sie die Muskeln zurück, um die Halsschlagader zu lokalisieren. Präparieren Sie vorsichtig die linke Arteria carotis communis aus dem umgebenden Gewebe.

Legen Sie eine provisorische Fünf-Oh-Seidennaht, die in 20-Millimeter-Segmente geschnitten ist, um die Arterie herum. Achten Sie darauf, den Vagusnerv nicht zu beschädigen. Trennen Sie als Nächstes die Bifurkation der linken Arteria carotis communis (ICA) interna und der Arteria carotis externa (ECA) und legen Sie eine dauerhafte Naht um die ECA so distal wie möglich.

Und eine weitere provisorische Naht auf dem ECA oberhalb der Bifurkation. Schneiden Sie dann den linken ICA mit einer Pinzette ab, um ein Ausbluten zu vermeiden. Auch hier gilt: Seien Sie sehr vorsichtig, um den Vagusnerv nicht zu schädigen.

Schneiden Sie ein kleines Loch in die ECA vor der Bifurkation zur ECA und zur ICA und zwischen den zuvor platzierten dauerhaften und temporären Nähten. Führen Sie als Nächstes ein 12 Millimeter langes, sechs oh silikonbeschichtetes Monofilament-Nahtmaterial in die ECA ein, schneiden Sie die ECA vollständig ab und invertieren Sie das Monofilament in die ICA. Binden Sie die Naht fest, um Blutungen zu vermeiden, und entfernen Sie die Pinzette mit umgekehrter Wirkung.

Führen Sie dann das Monofilament in den Kreis von Willis ein, bis das Monofilament die Basis des MCA-Anschlags verdeckt. Seine Insertion etwa neun bis 10 Millimeter hinter der Bifurkation von ECA und CCA. In der Regel wird das Monofilament blockiert und kann sich nicht mehr bewegen.

Achten Sie darauf, nicht in die Arteria tego palatin einzudringen. Binden Sie die Naht fest an den ECA, um das Filament in Position zu bringen. Nun verschließen Sie die Haut mit einem Auto-Clip-Wundverschlusssystem.

Injizieren Sie einen Milliliter Kochsalzlösung subkutan und legen Sie die Mäuse während der Zeit nach der Okklusion, die 60 Minuten beträgt, unter eine Infrarot-Heizlampe. Betäuben Sie die Mäuse wie zuvor und entfernen Sie die Autoclips, öffnen Sie leicht die Naht am ECA, damit sich das Monofilament zurückziehen und das Blut wieder perfundieren kann. Binden Sie dann die provisorische Naht an der ECA dauerhaft ab, um Blutverlust zu vermeiden.

Eine Stunde nach dem Streichen das Monofilament herausziehen und zur Wiederverwendung aufbewahren. Entfernen Sie anschließend die provisorische Naht am CCA, damit das Blut zirkulieren kann. Verschließen Sie die Wunde und subkutan.

Injizieren Sie den Mäusen einen weiteren Milliliter Kochsalzlösung. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass das Tier wieder mobil ist, setzen Sie es zurück in seinen Käfig und legen Sie die Hälfte des Käfigs auf das Heizkissen, damit die Mäuse ihre Umgebung wählen können. 12 Stunden nach der Operation erhalten die Mäuse eine weitere Dosis Buprenorphin für alle Scheinoperationen.

Alle Verfahren sind identisch, außer dass das Monofilament nach der Operation nicht eingesetzt wird. Das neurologische Defizit wird bewertet, um den Erfolg des T-M-C-A-O zu bestätigen und seine Effizienz zu bestimmen. Die neurologischen Defizite der Mäuse nach 1, 24, 48 und 72 Stunden nach der Perfusion auf einer Sechs-Punkte-Skala wie folgt: Null ist normal und eins ist mild, dreht sich mit oder ohne inkonsistente Kräuselung, wenn es am Schwanz aufgenommen wird. Mehr als 50% versuchen, sich zur kontralateralen Seite zu kräuseln.

Zwei entspricht einer milden, gleichmäßigen Lockenbildung von über 50% Versuchen, sich zur kontralateralen Seite zu kräuseln. Drei steht für gleichmäßiges, starkes und sofortiges Locken. Die Maus hält eine gerollte Position für mehr als ein bis zwei Sekunden.

Mit der Nase, die fast bis zum Schwanz reicht. Vier bedeutet starkes Curling. Das Fortschreiten in das Fassen, Verlust des Geh- oder Schreibreflexes fünf ist gleichbedeutend mit Koma oder Hügel.

Nach der Perfusion mit PBS-Lösung das Gehirn schnell in Isop Pentan einreiben und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Es ist zu beachten, dass Mäusegehirne je nach den geplanten immunhistochemischen Studien auch mit 4%-Paraformaldehyd perfundiert werden können. Als nächstes schneiden Sie mit einem Kryostaten 17 Mikrometer große koronale Hirnschnitte mit 30 Objektträgern.

Platzieren Sie einen Abschnitt von 30 auf derselben Folie. Dann färben Sie die erste und die 15. Dias mit krestalem Violett. Für eine genauere Schätzung des Verletzungsvolumens verwenden Sie ein Bildanalysesystem wie Scion Image von NIH, um das Läsionsdeli zu bewerten, den Infarktbereich, der in der linken und rechten Gehirnhälfte weiß erscheint.

Wiederholen Sie diese D-Begrenzung auf allen Hirnschnitten. Berechnen Sie das Infarktvolumen in beliebigen Einheiten und drücken Sie es als Prozentsatz der kontralateralen nicht läsionierten Fläche für jeden Abschnitt aus. Bewahren Sie die anderen Objektträger für immunhistochemische Untersuchungen bei minus 80 Grad Celsius auf.

Die Auswertung des Neuro-Scores bestätigt den Erfolg von T-M-C-A-O bei der intraluminalen Prozedur. Wie hier zu sehen ist, wird ein konsistentes, starkes und intermediäres Kräuseln beobachtet und die Maus hält eine gekrümmte Position für mehr als ein bis zwei Sekunden, wobei ihre Nase fast bis zum Schwanz reicht. In unserem Experiment zeigten alle Mäuse zumindest eine leichte gleichmäßige Curling-Bewegung, was einem Neuro-Score von zwei über den gesamten Testzeitraum entspricht.

Die Kresselviolett-Färbung wurde durchgeführt, um das Ausmaß des Hirninfarkts zu beurteilen. Im Anschluss an T-M-C-A-O hier ein repräsentativer koronaler Schnitt des Mausgehirns, der 72 Stunden nach der Reperfusion mit Kammviolett gefärbt wurde. Das Infarktgebiet, hauptsächlich das Striatum und die Rinde sowie die angrenzenden Hirnareale, die beschriftet sind, erscheinen weiß, da es nicht durch einen Kamm gefärbt ist.

Violett ist hier das Verletzungsvolumen, d. h. der weiße Teil der rechten Hemisphäre, ausgedrückt als Prozentsatz des kontralateralen nicht läsionierten Bereichs auf der linken Hemisphäre. Das Infarktvolumen bei C 57 schwarzen sechs männlichen Mäusen nach ischämischem Schlaganfall entspricht etwa 70 % der nicht angeleinten Hemisphäre. Dieses Verfahren bietet eine starke Reproduzierbarkeit der Läsion.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen transitorischen ischämischen Schlaganfall bei Mäusen durchführt. Darüber hinaus bietet Ihnen der Quiz-Viol-Ansatz, um Ihr Gehirn tatsächlich zu messen, den großen Vorteil, dass Sie über viele Materialien verfügen, um relevante Marker durch Immunchemie zu testen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihrem Experiment.