Sammlung Protokoll zur menschlichen Pankreas

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die menschliche Bauchspeicheldrüse so zu präparieren, dass die anatomische Ausrichtung beibehalten wird. Dies wird erreicht, indem der Zwölffingerdarm und die Milz aus der Bauchspeicheldrüse entfernt und dann überschüssiges Fett und Gefäße aus der Bauchspeicheldrüse entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die vordere Fläche mit blauer Tinte und die hintere Fläche mit schwarzer Tinte zu bemalen.

Als nächstes wird die Bauchspeicheldrüse in drei Regionen unterteilt. Jede Region wird dann quer in gleichmäßige Scheiben geschnitten und auf Paraffinkassetten oder OCT-Formen gelegt oder weiter zerkleinert und in Fläschchen gegeben. Letztendlich werden Proben aus allen drei Regionen der Bauchspeicheldrüse entnommen, während die korrekte anatomische Ausrichtung für die zukünftige Analyse beibehalten wird.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Typ-1-Diabetes-Forschung zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen, die dem Verlust von Betazellmasse oder -funktion zugrunde liegen, und die Art des Angriffs von Immunzellen. Die visuelle Demonstration der Pankreas-Verarbeitungsmethode ist von entscheidender Bedeutung, da die Aufrechterhaltung der In-vivo-Ausrichtung der Bauchspeicheldrüse Liebe zum Detail erfordert. Linda Snyder, Histotechnologin, und Emily Montgomery, Biowissenschaftlerin in meinem Labor, werden das Verfahren vorführen.

Beginnen Sie damit, alle für den Eingriff benötigten Materialien vorzubereiten. Beschriften Sie zunächst die Kassetten, in denen sich die Paraffinblöcke befinden, mit einer Donatorkennung, einem Probentyp, einer Aliquotnummer und zusätzlichen Informationen. Beschriften Sie als Nächstes die OCT-Formen auf die gleiche Weise.

Schneiden Sie genügend Stücke Alufolie ab, um jeden OCT-Block einzuwickeln, und legen Sie sie für die spätere Verwendung beiseite. Bereiten Sie alle Fläschchen vor, die für die Lagerung der frischen und gefrorenen Proben benötigt werden. Fügen Sie später RNA und ggf. RPMI-Medien hinzu.

Bereiten Sie anschließend die Arbeitsbereiche vor, legen Sie Sezierbretter, sterilisierte Instrumente und alle anderen für den Eingriff benötigten Materialien sowohl in eine Biosicherheitshaube als auch auf eine Arbeitsplatte. Lassen Sie alle Kassetten und OCT-Formen in der Reihenfolge ihrer Verwendung anordnen. Nah. Erstellen Sie ein Gefrierbad, indem Sie genügend Isop Pentan hinzufügen, um das Trockeneis auf dem Boden einer Styroporbox zu bedecken.

Um mit der Dissektion zu beginnen, entfernen Sie den Zwölffingerdarm und die Milz. Beginnen Sie mit der Trennung des Zwölffingerdarms und der Bauchspeicheldrüse an einem Ende und fahren Sie fort, bis sie vollständig gelöst sind. Die Milz ist locker anhaftend und lässt sich leicht aus dem Fett und der Bauchspeicheldrüse entfernen.

Reinigen Sie anschließend die Bauchspeicheldrüse von überflüssigen Fettgefäßen und Nerven mit einer Kombination aus stumpfer und scharfer Dissektion. Legen Sie das Fett und die Lymphknoten beiseite, um sie später zu verarbeiten. Legen Sie die Bauchspeicheldrüse nach der Reinigung auf ein Präparierbrett, das mit Papiertüchern bedeckt ist.

Die Aufrechterhaltung der korrekten Ausrichtung der Bauchspeicheldrüse ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Um das Gelingen zu gewährleisten, werden die Vorder- und Seitenflächen mit verschiedenfarbigen Farben bemalt. Tauchen Sie einen Applikator mit Wattespitze in blaue Tinte, verteilen Sie die Tinte auf der vorderen Oberfläche der Bauchspeicheldrüse und tupfen Sie den Überschuss ab.

Tauchen Sie anschließend einen neuen Applikator in schwarze Tinte und verteilen Sie ihn auf der hinteren Oberfläche der Bauchspeicheldrüse. Bringen Sie die Bauchspeicheldrüse wieder in ihre normale Ausrichtung. Mit der Frontfläche nach oben ist die Bauchspeicheldrüse nun bereit, in drei Abschnitte geschnitten zu werden.

Schneiden Sie zuerst die Verbindung zwischen Kopf und Körper ab. Teilen Sie als Nächstes den restlichen Teil in ungefähr gleiche Teile, um Körper und Schwanz zu trennen, und notieren Sie das Gewicht jeder Region der Bauchspeicheldrüse. Beginnend mit dem Kopfteil.

Unterteile jede Region in etwa 0,5 Zentimeter große Abschnitte, indem du quer schneidest, ähnlich wie beim Schneiden eines Brotlaibs. Sobald jede Region der Bauchspeicheldrüse durchtrennt wurde, entfernen Sie den letzten Abschnitt der Kopfregion, den Abschnitt der Kopfkörperverbindung, und legen Sie ihn auf ein separates Präparierbrett. Hacken Sie diesen Abschnitt in kleine Stücke und verteilen Sie die Stücke gleichmäßig auf beschriftete Kryo-Fläschchen mit und ohne RNA.

Später werden die Fläschchen dann eingefroren. Befolgen Sie Standardverfahren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Abschnitt der Rumpfschwanzverbindung.

Nach der Entnahme der zerkleinerten Proben werden alle Querquerschnitte nach rechts geneigt. Abwechselnde Abschnitte jeder Region werden entfernt. Bei Paraffin- und OCT-Blöcken entfernen Sie den ersten Abschnitt für die Paraffinblockierung.

Wenn ein Abschnitt zu groß ist, halbieren Sie ihn. Beschriften Sie die Kassetten mit A und B.Wenn das Stück immer noch zu groß ist, schneiden Sie jeden Abschnitt senkrecht zum vorherigen Schnitt ab und beschriften Sie dann die Kassetten A bis D im Uhrzeigersinn. Positionieren Sie die Kassette wie hier gezeigt, so dass sich das Etikett nach links befindet.

Legen Sie anschließend das Taschentuch in die Kassette und schließen Sie den Deckel. Füllen Sie die Kassette in einen Behälter mit neutral gepuffertem Formin um. Nummerieren Sie den Block sequenziell innerhalb jeder Region, beginnend mit dem medialsten Abschnitt für OCT-Blöcke.

Gießen Sie eine dünne Schicht OCT-Medium in eine vorbeschriftete Form. Bevor Sie das Gewebe einführen, bedecken Sie das Gewebe mit OCT-Medien und frieren Sie die Probe schnell für die spätere Verwendung ein, um sie in das Gewebe zurückzubringen, das Sie zuvor beiseite gelegt haben. Isolieren Sie die Lymphknoten der Bauchspeicheldrüse, indem Sie das Fett und das Bindegewebe, das die Knotenkapsel umgibt, abschneiden. Legen Sie die Knoten in eine sterile Schüssel mit DMEF und zerkleinern Sie große Knoten in Stücke, die nicht größer als 0,5 Zentimeter sind.

Sobald die Pankreaslymphknoten isoliert sind, teilen Sie das Gewebe für die weitere Verarbeitung auf die vorbereiteten Fläschchen und Kassetten auf. Nach Beendigung der Lymphknoten wird die Milz zerkleinert und auf ähnliche Weise gelagert. Um den Zwölffingerdarm zu bearbeiten, wischen Sie die Schleimhaut mit einem angefeuchteten Mullkissen vom Schleim ab, schneiden Sie die Schleimhaut ab und schneiden Sie sie dann in Abschnitte.

Teilen Sie die Schleimhautproben wie zuvor gezeigt. Mit diesem Verfahren werden repräsentative Proben jeder Region der Bauchspeicheldrüse entnommen, wie hier zu sehen. Die Gewichte der Kopf-, Körper- und Schwanzregion waren ungefähr gleich.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine menschliche Bauchspeicheldrüse in verschiedene Probentypen verarbeitet, insbesondere die Fähigkeit, die Ausrichtung beizubehalten, sowie wie man Lymphknoten aus dem peripankreatischen Fett isoliert