Name: Sammlung Protokoll zur menschlichen Pankreas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Erfahren Sie die Präparation der menschlichen Bauchspeicheldrüse unter Erhalt der anatomischen Orientierung für Diabetesforschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Inselzell-Zusammensetzung und -Dichte.

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Die Autoren danken den Spendern die Familien und die Orgel Beschaffung Organisationen in diesem Forschungs-und Maria Martino und Irina Kusmartseva für ihre fachkundige Unterstützung beteiligt. Diese Arbeit wurde von der Juvenile Diabetes Research Foundation (MC-T., MA) zur Unterstützung des Network for Organ Donors mit Pankreas-Diabetes gefördert.

1. Set-up <ol><li> Label-Kassetten für Paraffin-Blöcke manuell mit einem Bleistift, oder automatisch mit einem Kassetten-Drucker. Fügen Sie den Geber-Kennung (CaseID), Probentyp, Aliquot-Nummer, und keine zusätzliche eindeutige Identifikation (Urteil Arbeitsblatt, <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Anhang 1</a> ). </li><li> Label-Oktober Formen wie für Kassetten mit einem wasserfesten Filzstift. Schneiden Sie 5-10 cm Rechtecke aus Aluminiumfolie. </li><li> Drucken oder manuell Etikett mit Edding alle Fläschchen und Tuben. Fügen Sie genug Fläschchen für Hackfleisch Snap gefrorenen Proben und Rohre mit RPMI-Medium für frische Sendungen. Für das Snap gefrorene Röhrchen mit RNAlater, 1 ml RNAlater jedem Kryoröhrchen. </li><li> Set-up Dissektionstische Biosicherheit in Kapuze und Theken mit sterilisierten Dissektion Instrumente (Zangen, Skalpelle, Klingen, Gazekompressen (4x4)) sowie Kassetten und Oktober Formen in der Reihenfolge ihrer Verwendung angeordnet. </li><li> Bereiten Sie eine Gefrierbad indemTrockeneis in einem mittelständischen Styropor-Box (10x10 cm) bis zu einer Tiefe von mindestens 3 cm und fügen Isopentan, bis das Trockeneis vollständig bedeckt ist. </li><li> Optional: Füllen Sie eine kleine Dewar Behälter mit flüssigem Stickstoff. </li><li> Wenn Bauchspeicheldrüse für Elektronenmikroskopie (EM) benötigt wird, vorzubereiten TAAB Fixativ, indem 1,25 ml 16% Paraformaldehyd, 1,25 ml 8% Glutaraldehyd und 7,5 ml 0,1 M PBS. Bereiten Lowicryl Fixativ durch Zugabe von 2,5 ml 16% Paraformaldehyd und 7,5 mL 0,1 M PBS. </li><li> Planen Lösungen zur Isolierung von Zellen verwendet. Zu 500 ml Flasche DMEF (mit Glutamin), folgen Sie aseptische Techniken beim Hinzufügen der folgenden Schritte aus: <ol><li> Fötalem Rinderserum (FBS): Dazu 50mL, final 10%. </li><li> Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep, 10.000 U / mL / 10000 ug / ml Stammlösung) - fügt man 5 ml Pen / Strep Lager zu RPMI für Endkonzentration von 100 U / ml / 100ug/mL. Auch mit 5 ml in einen 500 ml Flasche DPBS, wenn für das Halten Lymphknoten oder der Milz Proben verwendet. </li></ol></li></ol> 2. Personal <ol&gt; <li> Vorgehensweise wird optimal mit drei Mitarbeitern jedoch das Verfahren mit einem gut ausgebildeten einzelnen durchgeführt werden kann bewerkstelligt. Zwei Personen können in der Regel führen Sie das Verfahren in 90 Minuten. Tatsächliche Dauer ist abhängig von Anzahl von Geweben aufgenommen und Auffindbarkeit Lymphknoten an. Beispiele für die Zelle Isolierungen werden bei 4 ° C bis zur Vollendung der Gewebedissektion während Serumproben parallel verarbeitet werden. </li><li> Pathologe, Pathologie-Assistent, oder gleichwertig-ein erfahrener Mitarbeiter führt das Gewebe Handhabung und führt wichtige Dissektionen einschließlich Division (en) der Bauchspeicheldrüse Kopf und Ernte Lymphknoten an. Die ersten Bemühungen sind auf die Bauchspeicheldrüse durch die Prüfung der peri-pankreatische Fett für Lymphknoten gefolgt gerichtet. </li><li> Labor-Techniker oder gleichwertiger-Mitarbeiter im Gewebe ausgebildet Trimmen, deren primäre Aufgaben sind zu Pankreas-und Regionen-und Trimm-Gewebe für feste und gefrorene Blöcke und für Snap gefrorenen v wiegenIALS. Empfängt Duodenum und Milz aus der Pathologie Assistent und verarbeitet diese Organe während der Pathologie Assistent wird die Verarbeitung der Bauchspeicheldrüse. </li><li> Laborantin-Mitarbeiter, der den anderen hilft einschließlich Block und Fläschchen Etikettierung, Probe Hacken für Kryoröhrchen, und Serum-Verarbeitung. </li></ol> 3. Pankreas Dissection <ol><li> Entfernen Sie den Zwölffingerdarm und der Milz und reinigen Sie das Pankreas von Fremdwasser Fett, Gefäße und Nerven mit stumpfer und scharfer Dissektion </li><li> Setzen Sie den gereinigten Pankreas auf einem Seziertisch Board mit Papiertüchern abgedeckt. Tauchen Sie ein Wattestäbchen in blauer Tinte und Ausbreitung auf der Vorderfläche des Pankreas. Vorsichtiges Abtupfen der Exzess. </li><li> Optional: Tauchen Sie einen neuen Applikator in schwarzer Tinte und Verbreitung auf der hinteren Fläche der Bauchspeicheldrüse. Zurück zum normalen Pankreas Orientierung mit vorderen Oberfläche nach Prosektor. </li><li> Schneiden Sie das Pankreas in drei Regionen: Kopf, Körper und Schwanz (Abbildung 1). Schneiden Sie die Verbindung zwischen HEAd und Körper verteilen dann den restlichen Teil in ~ gleiche Portionen für Körper und Schwanz. </li><li> Wiegen Sie jede Region der Bauchspeicheldrüse und der Rekord Gewichte (Urteil Aufarbeitung Blatt ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Anhang 1</a> )). </li><li> Abschnitt (~ 0,5 cm) jede Region der Bauchspeicheldrüse in einer quer &quot;Brotlaib&quot; Weise (Abbildung 1). </li><li> Verwenden Sie die Abschnitte aus beiden Kreuzungen zwischen den Regionen für Hackfleisch-Proben. Je nach Größe Pankreas, kann eine Probe aus dem Körper-Schwanz Übergangsbereich schwierig sein, zu erhalten, in welchem ​​Fall die Anzahl der Paraffinblöcke verringert werden, um zerkleinerte Proben oder Proben nur aus dem Pankreas Kopf-Körper-Bereich zu erhalten, erhalten werden kann. Label-Kryoröhrchen nach wie Kopf-oder Körper zu proximalen Bereich an der Kreuzung zu bezeichnen. <ol><li> Mince Stücke teilen und gleichmäßig zwischen Kryoröhrchen (≥ 1 g pro Flasche). Schnell einfrieren, ohne RNAlater Fläschchen in flüssigem Stickstoff oder in Trockeneis - Isopentan Gülle übertragen Sie dann tOA -80 ° C Gefrierschrank. </li><li> Halten Fläschchen mit RNAlater bei Raumtemperatur für 30 Minuten bis zur Gleichgewichtseinstellung zu ermöglichen, Remix und schnell in flüssigem Stickstoff oder in der Trockeneis-Isopentan Gülle frieren dann zu einer -80 ° C Gefrierschrank zu übertragen. </li></ol></li><li> Entfernen Sie abwechselnden Abschnitten für Paraffin-und Oktober-Blöcke beginnend mit Paraffin (Abbildung 1). </li><li> Lehnen alle Querschnitte nach rechts. </li><li> Ort ~ 1,5 x 1,5 x 0,5 cm Abschnitte in den Kassetten. Wenn die Querschnitte zu groß sind, um die Hälfte (Abbildung 2b) zu schneiden. Label-Kassetten für blaue vordere Hälfte als &quot;A&quot; und hinteren Hälfte als &quot;B&quot;. </li><li> Wenn die Stücke immer noch zu groß sind, schneiden sich senkrecht zu dem vorigen Schnitt (Abbildung 2c). Etikettenkassetten AD im Uhrzeigersinn. RANDSTÜCKE weiter wie notwendig, um innerhalb von Kassetten passen. </li><li> Anzahl Blöcke sequentiell innerhalb der Region, beginnend mit dem mittleren Abschnitt. </li><li> Für Paraffin-Blöcke, Position Cassettes mit dem Etikett nach links und die Gewebeschnitte in die Kassette unter Beibehaltung der Orientierung. Schließen Kassettenfachdeckel und Transfer zu einem Behälter mit ~ 500 ml 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF). Starten Sie die Zeitnehmung Fixierung, wenn die letzte Kassette in Fixativ gelegt wird. </li><li> Für Oktober Blöcke, gießen Sie eine dünne Schicht von Oktober Medium in den prelabeled Schimmel lag dann das Gewebe in der Form sicher zu sein, um Orientierung zu erhalten und decken Gewebe mit Oktober Schnell tauchen die Formen Oktober in einem Trockeneis - Isopentan Gülle für ~ 1 Minute. Entfernen von Schlamm und auf Trockeneis für die temporäre Speicherung oder im Gefrierschrank -80 ° C für die langfristige Lagerung. </li><li> Erhalten ~ 0,5 x 0,5 cm dicke Scheiben von der Kopf-Körper-Knotenpunkt für Elektronenmikroskopie (EM). Eine Scheibe in der TAAB Fixativ und die andere Scheibe in der Lowicryl Fixativ. Bewahren Sie beide Arten von Fixativ mit Proben bei 4 ° C für mindestens 48 Stunden und / oder auf unbestimmte Zeit bis zur weiteren Verarbeitung zur EM. </li></ol> 4. Milz, Lymphknoten Zergen und Duodenalschleimhaut Dissektionen <ol><li> Isolieren Lymphknoten (PLN) aus Fett und schneiden alle Bindegewebe an den Knoten Kapsel. Platz in sterilen Zellkulturschale enthaltend DMEF. Je nach Gesamtzahl isoliert, teilen PLN in Aliquots für frische Lieferungen, kryokonservierten Zellen Isolationen, Paraffin und / oder Oktober Blöcke, und Vials. Hackfleisch großen Knoten in Stücke nicht größer als 0,5 cm. </li><li> Hackfleisch nicht Lymphknoten und Milz in kleine (ca. 0,5 cm) Würfel. Place in Fixativ, Oktober Medien und DMEM oder für frische Probe Sendungen oder kryokonservierten Zellen Isolierungen nach Mengen an Ausgangsmaterialien. </li><li> Öffnen Sie den Zwölffingerdarm und sanft über das Duodenalschleimhaut sauber von Schleim mit einem befeuchteten Gaze-Pad. Schneiden Sie Abschnitte der Schleimhaut für Paraffin und / oder gefrorene Blöcke Oktober und Hackfleisch-Proben für Vials, mit und ohne RNAlater. Frieren wie für die anderen Proben. </li></ol> 5. Wrap Oktober Blöcke in vorher beschriftete Aluminiumfolie und Oktober statt und Blöcke<html> Vials in Schachteln für die langfristige Lagerung bei -80 ° C 6. Submit fixierten Proben für Paraffin-Verarbeitung <ol><li> Fix Gewebe für 16 Stunden (zwischen 20 ± 4 Stunden) mit Hilfe eines automatischen Paraffin-Prozessor oder mit manuellen Timing. Verarbeiten, um Paraffin-Blöcke mit einem automatischen Prozessor ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix2.doc" target="_blank">Anhang 2</a> ). </li><li> Einbetten Abschnitte in der exakten Ausrichtung wie von der Prosektor mit der Kassette Etikett auf der linken Seite platziert. Betten Sie die Duodenalschleimhaut mit der Schnittfläche nach unten um die Prüfung der Schleimhaut senkrecht zur Submukosa zu ermöglichen. </li></ol> 7. Reinigen Sie Dissektion Bereichen und zu desinfizieren. Waschen Sie Dissektionsinstrumente und erneut sterilisieren. Platzieren Sie Überbleibsel menschlichen Geweben in Formalin Fixativ für die Lagerung wie biomedizinischen Abfällen. Entsorgen Sie biomedizinischen Abfällen nach den örtlichen Bestimmungen innerhalb eines Monats. 8. Aktualisieren Sie den Sample Inventory System ve_title &quot;&gt; 9. repräsentative Ergebnisse Dieses Verfahren wird eine intakte menschliche Bauchspeicheldrüse mit repräsentativen Stichproben im gesamten Organ einschließlich Abgrenzung der drei wichtigsten Regionen, nämlich Kopf, Körper und Schwanz innerhalb von 2 Stunden zu verarbeiten. Die hakenförmigen Bereich in der hinteren Kopfbereich gefunden wird, wird in den Kopf Dissektion enthalten. Das mittlere Gewicht der Bauchspeicheldrüse in Organspender ohne Diabetes war 82,4 Gramm (52,7 bis 139,0 Gramm). Pankreas regionalen Gewichte waren annähernd gleich (Abbildung 3). Dieses Verfahren kann auch für die Rekonstruktion des gesamten Pankreas mit gefärbten Schnitten sequentielle Paraffin und Oktober Blöcke ermöglichen. Mehrere Formate sind machbar was eine maximale Auslastung für aktuelle und zukünftige Technologien. Der aktuelle Fall nPOD Arbeitsblatt zur Verfügung gestellt ( <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4039/4039appendix1.doc" target="_blank">Anhang 1</a> ), die verwendet wird, um wieder Proben und anschließende proc dokumentierenEssing von aliquoten Arten und Mengen. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig1.jpg" /> Abbildung 1. Allgemeine Systematik des Verfahrens. Die gesamte Bauchspeicheldrüse verarbeitet wird unter Beibehaltung anatomischen Orientierungen. Der Kopfbereich, geht in der Superior-inferior-Achse aufgrund der Anwesenheit des ventralen Pankreas Keule in der hinteren Region, die die hakenförmigen Region umfasst. Schraffierte Fläche an Kreuzungen bezeichnen Regionen für Hackfleisch-Proben in Kryoröhrchen verwendet. P, Paraffin, O, Oktober <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig2.jpg" /> Abbildung 2. Lettering System für den Pankreas-Abschnitten. Transverse Bauchspeicheldrüse Scheiben lassen sich weiter in Hälften oder Viertel unterteilt und mit Buchstaben im Uhrzeigersinn. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4039/4039fig3.jpg" /> Abbildung 3. Bauchspeicheldrüse von Organspendern Gewichte ohne Diabetes. Dieintakten Bauchspeicheldrüse von erwachsenen Spendern (&gt; 17 Jahre) wurde dann aufgeteilt in Regionen und der regionalen Gewichte erhalten gewogen. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM (n = 15).

<ol><li>Brissova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> J. Histochem. Cytochem. 53, 1087-1097 (2005).</li>
<li>Rahier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreatic+polypeptide+cells+in+the+human+pancreas%3A+the+effects+of+age+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">The pancreatic polypeptide cells in the human pancreas: the effects of age and diabetes.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 56, 441-444 (1983).</li>
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<li>Gianani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+results+of+screening+of+nondiabetic+organ+donors+for+expression+of+islet+autoantibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Initial results of screening of nondiabetic organ donors for expression of islet autoantibodies.</a> J. Clin. Endocrinol. Metab. 91, 1855-1861 (2006).</li>
<li>Tauriainen, S., Salmela, K., Rantala, I., Knip, M., Hyöty, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collecting+high-quality+pancreatic+tissue+for+experimental+study+from+organ+donors+with+signs+of+%CE%B2-cell+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab.+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Collecting high-quality pancreatic tissue for experimental study from organ donors with signs of β-cell autoimmunity.</a> Diabetes Metab. Res. Rev. 26, 585-592 (2010).</li>
<li>In't Veld, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+insulitis+in+adult+autoantibody-positive+organ+donors%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Screening for insulitis in adult autoantibody-positive organ donors.</a> Diabetes. 56, 2400-2404 (2007).</li>
<li>Töns, H. A., Terpstra, O. T., Bouwman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+pancreata+in+perspective+of+the+isolation+of+the+islets+of+langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human pancreata in perspective of the isolation of the islets of langerhans.</a> Transplant Proc. 40, 367-369 (2008).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Standard, der Bauchspeicheldrüse Verarbeitung harmonisiert werden auf mehreren Sammelstellen können definieren und ermöglichen so einen Vergleich der Ergebnisse von verschiedenen Gruppen erhalten. Die Dissektion Methode basiert auf Standard-chirurgischen Pathologie Praxen mit zusätzlichen Schritten zur Annotation von großen Regionen der Bauchspeicheldrüse durch intra-regionalen Unterteilungen gefolgt basiert. Die Standardisierung der Bioprobe Verarbeitungsmethoden ist erforderlic...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Dissektionsinstrumente einschließlich Skalpelle mit 22 Klingen </td><td> Verschiedene </td><td> Verschiedene </td><td></td></tr><tr><td> Zentrifugenröhrchen (15 und 50 ml) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-539-5, 430828 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> Kryoröhrchen (1,8 ml) </td><td> VWR Nordamerika </td><td> 89004-300 </td><td> Sterile, Barcodes optional </td></tr><tr><td> RNAlater </td><td> Ambion </td><td> AM7021 </td><td></td></tr><tr><td> Klinische Pathologie Ink </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kassetten </td><td> Mercedes Medical </td><td> CAS ECO109 </td><td></td></tr><tr><td> 10% neutral gepuffertem Formalin </td><td> Fisher Scientific </td><td> 23-245-685 </td><td></td></tr><tr><td> Oktober Einfriermedien </td><td> TissueTek </td><td> 4583 </td><td></td></tr><tr><td> Schimmelpilze </td><td> ThermoScientific </td><td> 58952 </td><td> Verschiedene Größen </td></tr><tr><td> Isopentan </td><td> Fisher Scientific </td><td> O3551-4 </td><td> Oktober chilling Bad </td></tr><tr><td> Trockeneis </td><td></td><td></td><td> Oktober chilling Bad </td></tr><tr><td> Flüssiger Stickstoff im Dewar-Gefäß </td><td></td><td></td><td> Rasten Sie das Einfrieren Kryoröhrchen </td></tr><tr><td> Zellkulturschale (100mm) </td><td> Corning </td><td> 430167 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> Hyclone DMEF </td><td> ThermoScientific </td><td> SH30023.01 </td><td> Steril, kann gekühlt, enthalten Glutamin </td></tr><tr> &lt;td&gt; fötalem Rinderserum </td><td> Cellgro </td><td> 35-010-CV </td><td> Sterile, speichern gefrorenen Aliquots </td></tr><tr><td> Penicillin / Streptomycin / antimykotische </td><td> GIBCO </td><td> 15240-062 </td><td> Sterile, speichern gefrorenen Aliquots </td></tr><tr><td> Typ 9 Paraffin </td><td> Richard-Allan Scientific </td><td> 8337 </td><td></td></tr><tr><td> 1x D-PBS </td><td> GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> Steril </td></tr><tr><td> 16% Paraformaldehyd </td><td> EM Sciences </td><td> 15710 </td><td> Machen Sie frisch, gekühlt lagern </td></tr><tr><td> 8% Glutaraldehyd </td><td> EM Sciences </td><td> 16019 </td><td> Machen Sie frisch, gekühlt lagern </td></tr><tr><td> Biosafety Level 2 Haube </td><td> Verschiedene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultra-Low-Gefrierschrank </td><td> Verschiedene </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura Cassette Drucker </td><td> Sakura </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sakura VIP300 </td><td> Sakura </td><td></td><td> Automatische Paraffin-Prozessor </td></tr><tr><td> Paraffineinbettung Bahnhof </td><td> ThermoFisher </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Spezifischen Reagenzien und Geräte.

sammlung protokoll zur menschlichen pankreas

Collection Protocol for Human Pancreas

Diese Zergliederung und Probenahmeverfahren wurde für das Netzwerk für Pankreas-Organ Donors mit Diabetes (nPOD) Programm zur Vorbereitung der Bauchspeicheldrüse von Organspendern gewonnen Leichen zu standardisieren entwickelt. Die Bauchspeicheldrüse ist in 3 Regionen (Kopf, Körper, Schwanz) von seriellen Querschnitten der ganzen medial nach lateral Achse gefolgt aufgeteilt. Abwechselnd Abschnitte sind für Paraffin und frisch gefrorenen Blöcken und Überrest Proben verwendet werden, für Snap gefrorene Probe Präparate zerkleinert, entweder mit oder ohne RNAse-Inhibitoren für DNA, RNA oder Protein isoliert. Das übergeordnete Ziel der Bauchspeicheldrüse Dissektion Verfahrens ist es, die gesamte Bauchspeicheldrüse zu probieren und gleichzeitig anatomische Orientierung. Endokrine Zelle Heterogenität in Bezug auf die Inselzellen Zusammensetzung, Größe und Zahlen ist für den menschlichen Inseln im Vergleich zum Nagetier Inselchen 1 angegeben. Die Mehrheit der menschlichen Inselzellen aus der Bauchspeicheldrüse Kopf, Körper und Schwanz Regionen der Insulin-containin komponiertg β-Zellen durch geringere Anteile an gefolgt Glukagon-haltige α-Zellen und Somatostatin-haltigen δ-Zellen. Pankreaspolypeptid PP-haltige Zellen und Ghrelin-haltigen Epsilon Zellen sind auch vorhanden, aber in geringer Anzahl. Im Gegensatz dazu enthält das uncinatus Region Inseln, die vor allem von Pankreas-Polypeptid enthaltende PP-Zellen 2 zusammengesetzt sind. Diese regionalen Unterschiede ergeben sich aus Inselchen entwicklungsbedingte Unterschiede. Die Bauchspeicheldrüse entwickelt sich aus den ventralen und dorsalen Pankreas Knospen im Vorderdarm und nach der Drehung des Magens und des Duodenums, die Bauchlappen bewegt und verschmilzt mit der dorsalen 3. Die Bauchlappen bildet den hinteren Teil des Kopfes einschließlich der hakenförmigen durch, während der dorsalen Lappen führt zu dem Rest des Organs. Regionale Pankreas Variation ist auch mit der Heckbereich mit einer höheren Dichte Inselchen im Vergleich zu anderen Regionen und die dorsalen Lappen-abgeleiteten Komponenten durchlaufen selektive Atrophie bei Typ 1-Diabetes berichtet <sbis&gt; 4,5. Zusätzliche Organe und Gewebe werden oft von den Organspendern gewonnen und zählen Lymphknoten, Milz und nicht-Lymphknoten an. Diese Proben werden mit ähnlichen Formaten wie der Bauchspeicheldrüse unter Zusatz von Isolierung von kryokonservierten Zellen gewonnen. Wenn der proximalen Duodenum mit der Bauchspeicheldrüse ist im Preis inbegriffen, kann Duodenalschleimhaut für Paraffin und gefrorenen Blöcken und Hackfleisch Snap gefrorener Zubereitungen gesammelt werden.

Dieses Video zeigt eine Dissektion Verfahren zur Bearbeitung der menschlichen Bauchspeicheldrüse in mehrere Speicherformate. Anatomische Orientierung wird im Laufe der Bauchspeicheldrüse Regionen aufrechterhalten, um Definition von Regional-Inselchen Zusammensetzung und Dichte zu ermöglichen.

Sammlung Protokoll zur menschlichen Pankreas

Dieses Dissektions- und Probenahmeverfahren wurde für das Programm des Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) entwickelt, um die Präparation zu standardisieren ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Bauchspeicheldrüse so zu dissezieren, dass die anatomische Orientierung erhalten bleibt. Dies wird erreicht, indem man den Dünndarm und die Milz von der Bauchspeicheldrüse entfernt und anschließend überschüssiges Fettgewebe und Gefäße von der Bauchspeicheldrüse ablöst. Der zweite Schritt besteht darin, die vordere Fläche mit blauer Tinte und die hintere Fläche mit schwarzer Tinte zu markieren.Anschließend wird die Bauchspeicheldrüse in drei Regionen unterteilt. Jede Region wird dann quer in gleichmäßige Scheiben geschnitten und auf Paraffin-Kassetten, OCT-Formen gelegt oder weiter zerkleinert und in Röhrchen gegeben. Letztendlich werden Proben aus allen drei Regionen der Bauchspeicheldrüse gesammelt, wobei die korrekte anatomische Orientierung für die spätere Analyse erhalten bleibt.Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen in der Forschung zum Typ-1-Diabetes zu beantworten, wie beispielsweise die Mechanismen des Verlusts der Betazellmasse oder -funktion sowie die Art des Angriffs durch Immunzellen. Eine visuelle Demonstration der Pankreas-Verarbeitungsmethode ist entscheidend, da die Beibehaltung der in-vivo-Orientierung des Pankreas besondere Sorgfalt erfordert. Die Durchführung der Methode werden Linda Snyder, Histo-Technologin, und Emily Montgomery, Biologin, in meinem Labor demonstrieren.Bereiten Sie zunächst alle für das Verfahren benötigten Materialien vor. Beschriften Sie zuerst die Kassetten, die die Paraffinblöcke enthalten, mit einer Spenderkennung, Probentyp, Aliquotnummer und allen weiteren erforderlichen Angaben. Danach beschriften Sie die OCT-Formen auf dieselbe Weise.Schneiden Sie ausreichend Stücke Aluminiumfolie zu, um jeden OCT-Block einzeln einzuwickeln, und legen Sie diese für die spätere Verwendung beiseite. Bereiten Sie alle benötigten Gefäße zur Aufbewahrung der frischen und gefrorenen Proben vor. Fügen Sie gegebenenfalls später RNA und RPMI-Medium hinzu.Bereiten Sie anschließend die Arbeitsbereiche vor, indem Sie Schneidbretter, sterilisierte Instrumente und alle anderen für den Eingriff benötigten Materialien sowohl in einer Sicherheitswerkbank als auch auf einer Arbeitsfläche bereitstellen. Ordnen Sie alle Kassetten und OCT-Formen entsprechend ihrer Verwendung an. Stellen Sie in der Nähe ein Gefriermittel her, indem Sie so viel Isopentan hinzufügen, dass das Trockeneis am Boden eines Styroporbehälters bedeckt ist.Um die Dissektion zu beginnen, entfernen Sie Duodenum und Milz. Beginnen Sie damit, das Duodenum und die Bauchspeicheldrüse an einem Ende voneinander zu trennen, und setzen Sie dies fort, bis sie vollständig getrennt sind. Die Milz ist locker befestigt und lässt sich leicht vom Fettgewebe und der Bauchspeicheldrüse ablösen.Als Nächstes reinigen Sie das Pankreas von überschüssigen Fettgefäßen und Nerven durch eine Kombination aus stumpfer und scharfer Dissektion. Legen Sie das Fett und die Lymphknoten beiseite, um sie später zu bearbeiten. Stellen Sie das gereinigte Pankreas auf ein mit Papiertüchern bedecktes Präparierbrett.Die Beibehaltung der korrekten Orientierung der Bauchspeicheldrüse ist der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens. Um den Erfolg sicherzustellen, werden die vordere und hintere Oberfläche mit Tinte unterschiedlicher Farbe markiert. Tauchen Sie einen Wattestäbchenapplikator in blaue Tinte, verteilen Sie die Tinte auf der vorderen Oberfläche der Bauchspeicheldrüse und tupfen Sie den Überschuss ab.Als Nächstes tauchen Sie einen neuen Applikator in schwarze Tinte und verteilen diese auf der hinteren Oberfläche der Bauchspeicheldrüse. Bringen Sie die Bauchspeicheldrüse in ihre normale Orientierung zurück. Mit der vorderen Fläche nach oben ist die Bauchspeicheldrüse nun bereit, in drei Abschnitte geschnitten zu werden.Schneiden Sie zuerst die Verbindung zwischen Kopf und Körper durch. Teilen Sie danach den verbleibenden Teil in annähernd gleich große Abschnitte, um Körper und Schwanz voneinander zu trennen, und notieren Sie das Gewicht jedes Pankreasbereichs, beginnend mit dem Kopfbereich.Teilen Sie jeden Bereich durch queres Schneiden, ähnlich wie beim Schneiden eines Brotlaibs, in etwa 0,5 cm lange Abschnitte. Sobald jeder Bereich der Bauchspeicheldrüse geschnitten wurde, entfernen Sie den letzten Abschnitt des Kopfbereichs, also den Übergangsbereich zwischen Kopf und Körper, und legen Sie ihn auf ein separates Präparationsbrett. Zerkleinern Sie diesen Abschnitt in kleine Stücke und verteilen Sie die Stücke gleichmäßig auf beschriftete Kryoröhrchen mit und ohne RNA. Anschließend werden die Gefäße eingefroren. Gemäß den Standardverfahren. Wiederholen Sie diesen Vorgang für den Bereich des Übergangs von Körper zu Schwanz.Nachdem die zerkleinerten Proben gesammelt wurden, alle Querschnitte nach rechts kippen. Abwechselnd werden Schnitte aus jedem Bereich entfernt. Bei Paraffin- und OCT-Blöcken wird der erste Schnitt für die Paraffinblockierung entfernt.Wenn ein Abschnitt zu groß ist, halbieren Sie ihn. Beschriften Sie die Kassetten mit A und B. Wenn das Stück immer noch zu groß ist, schneiden Sie jeden Abschnitt senkrecht zum vorherigen Schnitt und beschriften Sie die Kassetten im Uhrzeigersinn mit A bis D. Wie hier gezeigt, positionieren Sie die Kassette so, dass sich das Etikett links befindet.Als Nächstes das Gewebe in die Kassette geben und den Deckel schließen. Die Kassette in einen Behälter mit neutral gepuffertem Formalin überführen. Nummerieren Sie den Block innerhalb jeder Region fortlaufend, beginnend mit dem medialsten Schnitt für OCT-Blöcke.Gießen Sie eine dünne Schicht OCT-Medium in eine vorbeschriftete Form. Bevor Sie das Gewebe einführen, bedecken Sie das Gewebe mit OCT-Medium und gefrieren die Probe schnell ein, um sie später zu verwenden, wobei Sie zu dem zuvor beiseitegelegten Gewebe zurückkehren. Isolieren Sie die pankreatischen Lymphknoten, indem Sie das Fett- und Bindegewebe um die Knotenkapsel herum abschneiden. Legen Sie die Knoten in eine sterile Schale, die DMEF enthält, und zerkleinern Sie große Knoten in Stücke von nicht mehr als 0,5 Zentimetern.Nachdem die Pankreas-Lymphknoten isoliert wurden, wird das Gewebe auf die vorbereiteten Gefäße und Kassetten zur weiteren Verarbeitung verteilt. Nach Abschluss der Lymphknoten wird die Milz zerkleinert und in ähnlicher Weise aufbewahrt. Um das Duodenum zu bearbeiten, verwenden Sie einen angefeuchteten Mulltupfer, um die Mukosa von Schleim zu befreien, schneiden Sie die Mukosa ab und teilen Sie sie anschließend in Abschnitte ein.Teilen Sie die Schleimhautproben wie zuvor gezeigt auf. Mit diesem Verfahren werden repräsentative Proben aus jedem Bereich der Bauchspeicheldrüse, wie hier dargestellt, gesammelt. Die Gewichte der Kopf-, Körper- und Schwanzregion waren annähernd gleich.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine humane Bauchspeicheldrüse in verschiedene Probentypen verarbeitet, insbesondere wie man die Orientierung beibehält sowie wie man Lymphknoten aus dem peripankreatischen Fettgewebe isoliert.

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Forschung

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Medizin

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe) mit einem modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part I: Verdauung und Sammlung von Pankreasgewebe

Das Erreichen hoher Qualität und ausreichender Menge menschlicher Inselchen ist einer der führenden Voraussetzungen für eine erfolgreiche Inseltransplantation. In diesem Video, beschreiben wir Schritt für Schritt die Verfahren für die menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation (Teil II: Reinigung und Kultur der menschlichen Inseln) mit einer modifizierten automatisierte Methode.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Die Versorgung von Typ-2-Diabetes Inseln für die Forschung ist nicht ausreichend. Hier teilen wir unser Protokoll zur Isolierung von Inseln aus Patienten partielle Pankreatektomie. Dieser Ansatz stellt einen einzigartigen Ort für den Erhalt von kleinen Inseln von Typ 2 Diabetes und klinisch abgestimmt nicht-diabetischen Patienten in ausreichender Zahl für die Grundlagenforschung und klinische Studien.

Isolierung humaner Inselzellen aus teilweise Pankreatektomierten

Dieses Video zeigt Verfahren zur Charakterisierung von humanen Langerhans-Inseln mit Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) und Immunhistochemie (IHC). Pankreas-Abschnitten von Kopf, Körper und Schwanz Regionen werden sowohl von H &amp; E und IHC gefärbt, um Inselzellen endokrinen Zusammensetzung (Insulin, Glukagon und pankreatische Polypeptid), Zell-Replikation (Ki67) und entzündlichen Infiltraten (H &amp; E, CD3) zu bestimmen. Die uncinatus Region lokalisiert ist mit IHC für pankreatische...

Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

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Kritische Herausforderungen für die Diabetesforschung Bereich sind die molekularen Mechanismen zu verstehen, die Insel β-Zellreplikation regulieren und β-Zellregeneration zur Stimulierung der Methoden zu entwickeln. Hierin ist ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung und der β-Zellreplikation fördernden Aktivität von kleinen Molekülen bewerten dargestellt.

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Hier präsentieren wir Ihnen einen Protokoll zum menschlichen Bauchspeicheldrüse Bildausschnitte in drei Dimensionen (3D) mit optimierten passiven clearing-Methoden. Diese Handschrift zeigt diese Verfahren für passive optische Clearing folgten mehrere Immunfluoreszenz Färbung um Schlüsselelemente der autonomen und sensorische neuronale Netze innervieren menschlichen Inselchen zu identifizieren.

Hochauflösende 3D Bildgebung des menschlichen Bauchspeicheldrüse Neuro-insularen Netzwerks

Dieses Inselisolierungsprotokoll beschrieb einen neuartigen Weg der Kollagenase-Injektion zur Verdauung des Exokringewebes und ein vereinfachtes Gradientenverfahren, um die Inseln von Mäusen zu reinigen. Es beinhaltet enzymatische Verdauung, Gradiententrennung/Reinigung und Islet-Handpicking. Eine erfolgreiche Isolierung kann 250–350 hochwertige und voll funktionsfähige Inselchen pro Maus ergeben.

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Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Maus pankreatische Inselzellen für das screening von ROS Induktionen durch die XENOBIOTIKA Ermittlung der potenziellen diabetogene XENOBIOTIKA Chemikalien zu isolieren.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur synchronen Erfassung und Co-Registrierung von intrazellulären Signalereignissen und der Sekretion von Insulin und Glukagon durch primäre humane Pseudoinseln unter Verwendung der adenoviralen Verabreichung eines zyklischen Adenosinmonophosphat (cAMP)-Biosensors, eines cAMP-Differenzdetektors in situ (cADDis) und eines Mikroperifusionssystems.

Humanes Pseudoislet-System zur synchronen Bestimmung der Dynamik fluoreszierender Biosensoren und Hormonsekretionsprofile

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Methode zur chirurgischen Entnahme, enzymatischen Verdauung und Dichtegradientenreinigung von Lewis-Rattenpankreasinseln, die ertragreiche, hochreine Präparate für den direkten Einsatz bei Transplantationen oder in vitro-Studien ermöglicht.

Isolierung und Reinigung von Pankreasinseln bei Lewis-Ratten mittels enzymatischer Verdauung und Dichtegradiententrennung

Erfahren Sie die Präparation der menschlichen Bauchspeicheldrüse unter Erhalt der anatomischen Orientierung für Diabetesforschung. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Inselzell-Zusammensetzung und -Dichte.

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