Wholemount Immunhistochemie für die Aufdeckung von komplexen Gehirn Topographie
5. April 2012
Neuronale Schaltkreise sind topographisch in Funktionsräume mit spezifischen molekularen Profile organisiert. Hier bieten wir Ihnen die praktischen und technischen Schritte zur Aufdeckung globale Gehirn Topographie mit einem vielseitigen wholemount immunhistochemische Färbung Ansatz. Wir demonstrieren den Nutzen der Methode mit dem wohlverstandenen Zytoarchitektur und Schaltung des Kleinhirns.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, komplexe Muster der Genexpression in einer vollständigen, intakten Gehirnstruktur sichtbar zu machen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Tier perfundiert und das Gehirn entnommen wird. Anschließend wird das Kleinhirn präpariert und mithilfe des Whole-Mount-Färbeprotokolls weiterverarbeitet.
Der letzte Schritt besteht darin, die Genexpression mithilfe einer histochemischen Farbreaktion sichtbar zu machen. Abschließend wird die helle durchgeleuchtete Mikroskopie verwendet, um Oberflächenmuster der Genexpression abzubilden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber etablierten Methoden wie der immunhistochemischen Gewebeschnittanalyse liegt in der Fähigkeit, komplexe Muster dreidimensional darzustellen, ohne eine Rekonstruktion vornehmen zu müssen.
Den Ablauf demonstriert Joshua White, ein Doktorand aus meinem Labor. Nachdem das Tier getötet und das Gehirn aus dem Schädel entfernt wurde, trennen Sie das Kleinhirn vom restlichen Gehirn, indem Sie zunächst die Spitzen eines Pinzettenpaares in die Mitte der oberen und unteren Brücken (Calli) einführen. Anschließend lösen Sie mit einem zweiten Pinzettenpaar vorsichtig die Brücken und die Großhirnrinde vom Kleinhirn ab.
Orientieren Sie das Kleinhirn so, dass die vordere Seite nach unten zeigt und der Hirnstamm nach oben weist. Führen Sie nun die Pinzette in das vierte Ventrikel zwischen Hirnstamm und den Labialen neun und zehn des Kleinhirns ein. Durchtrennen Sie die Pedunke, indem Sie mit der Pinzette beidseitig zudrücken, und heben Sie anschließend vorsichtig das Kleinhirn vom Hirnstamm ab.
Fixieren Sie das Kleinhirn durch Einlegen in 4 % Paraldehyd bei vier Grad Celsius für mindestens 24 bis 48 Stunden. Das Kleinhirn kann über einen längeren Zeitraum in 4 % Paraldehyd aufbewahrt werden, während man in einem Abzug arbeitet. Gießen Sie die Paraldehydlösung vorsichtig ab und ersetzen Sie sie durch dichte Fixierungslösung.
Stellen Sie das Gefäß mit dem Kleinhirn und der Fixierungslösung auf einen Schüttler und schütteln Sie sanft sechs bis acht Stunden lang. Nach Ablauf der Inkubationszeit gießen Sie die konzentrierte Fixierlösung ab und ersetzen sie durch konzentrierte Bleichlauge. Inkubieren Sie das Kleinhirn über Nacht bei vier Grad Celsius unter Rühren am folgenden Tag.
Ersetzen Sie die Lösung im Reagenzglas durch 100 % Methanol. Stellen Sie das Reagenzglas auf den Mutor und schwenken Sie vorsichtig bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Nach Ablauf der Inkubationszeit ersetzen Sie die Lösung durch frisches 100 % Methanol und wiederholen Sie die Inkubation, um eine vollständige Dehydratisierung des Kleinhirns sicherzustellen.
Tiefgefrieren Sie das Gewebe nun in 100 % Methanol, indem Sie das Gefäß in einen Behälter mit Trockeneis geben und 30 Minuten lang einfrieren. Danach das Gefäß mit einer Pinzette aus dem Trockeneis entnehmen und 15 Minuten lang auf der Laborfläche auftauen lassen. Wiederholen Sie den Einfrier-Auftau-Vorgang mindestens viermal, um die Penetration der Färbemittel zu verbessern.
Nach dem endgültigen Auftauen das Gefäß über Nacht in einen Minus-80-Grad-Celsius-Gefrierschrank stellen. Das Gewebe kann über längere Zeiträume bei Minus 80 Grad Celsius gelagert werden, entweder unmittelbar vor oder nach den Einfrier-Auftau-Schritten. Andernfalls sollte das Protokoll fortgesetzt werden.
Am nächsten Tag. Rehydrieren Sie das Kleinhirn durch Einweichen unter Schütteln in 50 % Methanol, 50 % PBS, anschließend 15 % Methanol, 85 % PBS und dann 100 % PBS jeweils 60 bis 90 Minuten bei Raumtemperatur. Danach führen Sie bei erwachsenen Maus-Kleinhirnen eine enzymatische Verdauung mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Proteinase K in PBS für zwei bis drei Minuten bei Raumtemperatur unter Schütteln durch.
Dieser Verdauungsschritt ist nicht notwendig für Kleinhirne von Mäusen im Alter von P fünf oder jünger. Gießen Sie unmittelbar nach der Verdauung das Proteinase K ab und waschen Sie das Kleinhirn dreimal für jeweils 10 Minuten in PB S, um eine Überverdauung zu verhindern. Ersetzen Sie nach dem letzten Waschschritt die Lösung durch P-B-S-M-T und ROCK und lagern Sie die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius, um das Gewebe am folgenden Tag zu blockieren.
Geben Sie die PBSMT-Blockierungslösung ab und inkubieren Sie das Gewebe in primärer Antikörperlösung, die in PBSMT mit 5 % DMSO ergänzt wurde, 48 Stunden bei vier Grad Celsius unter Schütteln. Nach Ablauf der Inkubationszeit waschen Sie das Kleinhirn zwei bis drei Mal für jeweils zwei bis drei Stunden in PBSMT bei vier Grad Celsius unter Schütteln, um nicht gebundene primäre Antikörper zu entfernen.
Anschießend das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius in Sekundärantikörper in einer Lösung aus P-B-S-M-T mit 5 % DMSO inkubieren. Am nächsten Tag unter Schütteln das Kleinhirn wie zuvor in P-B-S-M-T waschen. Danach eine abschließende Wäsche in PBT für eine bis zwei Stunden unter Schütteln bei vier Grad Celsius durchführen.
Dieser Schritt entfernt überschüssige Milch und verbessert die Klarheit der Färbung. Inkubieren Sie das Gewebe abschließend in DAB-Lösung. Um die optimale Färbungsintensität zu erreichen, sollte DAB am besten im Dunkeln verwendet werden.
Da Licht die Ausfällung des Chromogens verursacht, was die Hintergrundanfärbung erhöhen kann. Das braune Reaktionsprodukt sollte innerhalb von 10 Minuten deutlich sichtbar sein, sobald die optimale Färbungsintensität erreicht ist. Beenden Sie die Reaktion, indem Sie das Kleinhirn in PBS mit 0,4 % Natriumazid legen.
Das Gewebe kann langfristig in dieser Lösung aufbewahrt werden. Ganzpräparat-gefärbtes Gewebe sollte unter Verwendung von PBS oder einem anderen Medium mit optimalem Brechungsindex eingetaucht abgebildet werden. Um das Ganzpräparat einfach für die Bildgebung positionieren zu können, stellen Sie ein 1 %iges Agarose-Gel in einer Plastik-Petri-Schale her.
Schneiden Sie anschließend kleine Löcher in das Gel und klemmen Sie das Kleinhirn in diese Löcher in der gewünschten Orientierung für die Bildgebung. Bedecken Sie das Kleinhirn mit PBS. Das gefärbte Gewebe ist nun bereit, mittels Lichtmikroskopie abgebildet zu werden. ZEIN zwei Adelaide c.
Die Immunhistochemie zeigt sagittale Bänder in Querschnitten des Kleinhirns. Die Labiale vier, fünf und drei sind in der Abbildung beschriftet. Zur Orientierung entspricht die Maßstabsleiste 500 Mikrometer.
ZEIN zwei. Adelaides C wird ausschließlich in Teilmengen von Kinji-Zell-Sata und Dendriten exprimiert. In diesem Bild repräsentiert die Maßstabsleiste 150 Mikrometer.
Dieses Bild zeigt ein Ganzpräparat des Kleinhirns, das für Zein zwei, Adela C gefärbt ist, wobei Bikini-Zellstreifen in Abbildungen der anterioren, zentralen und posterioren Zone des Kleinhirns sichtbar sind. Die römischen Ziffern bezeichnen die Kleinhirnlappen. LS ist der Lobus simplex.
PML steht für das paramediane Labial. COP bezeichnet die kopularen Parameter und die Beschriftungen. Kruste eins und Kruste zwei bezeichnen die Namen zweier hemisphärischer LOEs, die Bezeichnungen P eins und P drei basieren auf einer Standardnomenklatur, die verwendet wird, um spezifische BR-zwei-Streifen anzugeben.
Weitere Einzelheiten finden sich bei Sillitoe und Hawks 2002. Die Maßstabsleiste entspricht einem Millimeter. Hier wurde das Kleinhirn mit einem Antikörper gegen das durch Kokain und Amphetamin regulierte Transkript-Peptid immungefärbt.
Es ist ersichtlich, dass Cart in Teilmengen von Kletterfasern exprimiert wird, die durch die als PCL gekennzeichnete Bikini-Zellschicht verlaufen und in der als ml bezeichneten molekularen Schicht enden. Hier entspricht die Maßstabsleiste 100 Mikrometer.
Es ist in diesem Bild zu erkennen, dass die Cart-positiven Fasern Streifen aus Bikini-Zeltdendriten in der molekularen Schicht der Cerebellar-Rinde projizieren, einschließlich Regionen wie das als PFL gekennzeichnete Oculus und das als fl gekennzeichnete Oculus. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, das Kleinhirn nicht zu verletzen. Jede äußere Schädigung würde die Sichtbarkeit komplexer Färbemuster beeinträchtigen.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie komplexe und interessante Muster der Genexpression in Neuronen und in den Fasern, die sie im intakten Gehirn kontaktieren, sichtbar gemacht werden können.
Sehen Sie sich das vollständige Transkript an und erhalten Sie Zugang zu Tausenden wissenschaftlicher Videos
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Darstellung der globalen Gehirn-Topographie mittels immunhistochemischer Färbung an Ganzpräparaten vor. Die Technik ermöglicht die Visualisierung komplexer Genexpressionsmuster in drei Dimensionen, speziell am Kleinhirn angewendet.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Immunhistochemie
- Hirn-Topographie
Hintergrund
- Neuronale Schaltkreise sind in funktionale Kompartimente organisiert.
- Das Verständnis der Gehirntopographie ist entscheidend für die Neurowissenschaftsforschung.
- Herkömmliche Methoden können komplexe Muster möglicherweise nicht effektiv visualisieren.
- Die Ganzpräparat-Färbung bietet einen neuartigen Ansatz zur Untersuchung von Gehirnstrukturen.
Zweck der Studie
- Um komplexe Muster der Genexpression in intakten Hirnstrukturen sichtbar zu machen.
- Um die Nützlichkeit der Ganzpräparat-Immunhistochemie zu demonstrieren.
- Um Genexpressionsmuster in drei Dimensionen zu visualisieren.
Verwendete Methoden
- Perfusion des Tieres und Entfernung des Gehirns.
- Dissektion des Kleinhirns.
- Anwendung des Ganzpräparat-Färbeprotokolls.
- Sichtbarmachung der Genexpression mittels histochenischer Farbreaktionen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung von Oberflächen-Genexpressionsmustern.
- Nachweis der Vorteile der Methode gegenüber der Immunhistochemie an Gewebeschnitten.
- Möglichkeit, komplexe Muster ohne Rekonstruktion zu beobachten.
Schlussfolgerungen
- Die Ganzpräparat-Färbungstechnik eignet sich zur Untersuchung der Gehirntopographie.
- Diese Methode vertieft das Verständnis der Organisation neuronaler Schaltkreise.
- Sie stellt ein wertvolles Werkzeug für zukünftige neurowissenschaftliche Forschung dar.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die Immunhistochemie an Ganzpräparaten ermöglicht die direkte Visualisierung komplexer Proteinexpressionsmuster in intakten Hirnstrukturen und bietet eine dreidimensionale Ansicht der molekularen Topographie ohne Rekonstruktionsartefakte. Dieser Ansatz unterstützt die Zielvalidierung, indem er räumlich aufgelöste Verteilungen von Biomarkern in krankheitsrelevanten neuronalen Schaltkreisen aufzeigt und somit das Vorhersagevertrauen in präklinischen Modellen erhöht. Die Methode ist besonders wertvoll für die Risikominimierung zentralnervensystemwirksamer Wirkstoffprogramme, da sie anatomisch-funktionelle Zusammenhänge früh im Entdeckungsprozess klärt.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem die Proteinausprägung in der nativen dreidimensionalen Gehirnarchitektur abgebildet wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die funktionelle Zielvalidierung durch direkte Beobachtung der molekularen Kompartimentierung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem die Lokalisation von Biomarkern in zerebellären und afferenten Bahnen geklärt wird.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem die intakte Gewebetopologie erhalten bleibt.
- Operativer Wert: Trägt durch reproduzierbare Ganzpräparat-Färbeprotokolle zur Standardisierung von Assays bei.
- Skalierbarkeit: Unterstreicht die Wiederverwendbarkeit der Plattform für vergleichende Studien über verschiedene Arten und Entwicklungsstadien hinweg.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Erläutert die Krankheitsrelevanz durch Visualisierung afferenter Projektionen und molekularer Topographie.
- Vorklinische Übereinstimmung: Beschreibt den Zusammenhang von der Entdeckung bis zur vorklinischen Validierung am Beispiel des Biomarkers ZebrinII/AldolaseC.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Konzentriert sich auf die prädiktive Risikominimierung durch Aufdeckung komplexer Muster in der nativen Konformation.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung bis hin zur Identifizierung von Wirkstoffkandidaten und unterstützt die biologische Risikominderung sowie die Aufklärung von Signalwegen in der CNS-Forschung.
- Entdeckungsbiologie: Erläutert, wie die Methode die Hypothesenprüfung unterstützt, indem sie Genexpressionsmuster in intakten Kleinhirnlappen und -zonen aufzeigt.
- Screening: Beschreibt die Bereitschaft des Assays anhand standardisierter Färbung und dreidimensionaler Bildgebung der oberflächlichen Genexpression.
- Analytik: Betont quantitative Auswertungen aus histochemischen Farbreaktionen, die den Vergleich der Expressionsintensität unter verschiedenen Bedingungen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Methode mit der präklinischen Kontinuität durch Visualisierung afferenter Faserprojektionen und ihrer Endfelder in den molekularen Schichten.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Stellt die Methode als wiederverwendbare Fähigkeit für vergleichende topografische Studien über Nagetiermodelle und Hirnregionen hinweg dar.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit, Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten bei der Abbildung neuronaler Schaltkreise.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit der Ganzpräparat-Färbung für die hochdurchsatzfähige Analyse von Mustern.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitalwirtschaftlichkeit und verringertes biologisches Risiko in fortgeschrittenen Entwicklungsstadien bei der Arzneimittelentwicklung für das zentrale Nervensystem.
- Portfolio-Wirkung: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Voranbringungsentscheidungen basierend auf räumlich aufgelösten Biomarkerdaten.
Durchführungsüberlegungen
- Notwendige wissenschaftliche Fachkenntnisse in Neuroanatomie, Immunhistochemie und Mikroskopie.
- Erforderliche Instrumentierung und analytische Infrastruktur, einschließlich Mikrotome, Schüttler, Gefrierschränke und Hellfeldmikroskope.
- Anforderungen an die Standardisierung zwischen Teams hinsichtlich Fixierung, Dehydrierung, Blockierung und Antikörperinkubationsprotokollen.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Modellsysteme, einschließlich Maus- und Rattenkleinhirn sowie unterschiedliche Entwicklungsstadien.
- Praktische Einschränkungen, die durch die Quellen belegt sind, wie beispielsweise die Vermeidung mechanischer Schäden während der Dissektion, um die Färbeklarheit zu bewahren.
