Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die Kinetik und den Verlauf des Zellzyklus zu messen. Die ersten Zellen werden mit Romo, Desoxy, Uridin oder BRDU markiert, das anstelle von Thymidin in die DNA der Zelle eingebaut wird. Anschließend werden die Zellen mit Antikörpern gegen BRDU immungefärbt und unmittelbar nach der Färbung mittels Durchflusszytometrie analysiert.

Nur Zellen in der S-Phase werden markiert, während die markierten Zellen den Zellzyklus bis G zwei durchlaufen. Es wird festgestellt, dass sie nach der Mitose einen Gehalt von vier NDNA haben. Der DNA-Gehalt wird auf zwei N reduziert.Somit kann die Analyse der durch die Durchflusszytometrie erzeugten Fluoreszenzprofile zur Bestimmung der Kinetik der Zellzyklusprogression verwendet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber anderen Protokollen, die Chemikalien für die Zellsynchronisation verwenden, besteht darin, dass es keine physiologischen Störungen gibt, die die Zellteilungsmaschinerie versehentlich beeinflussen könnten. Wir haben diese Methode zum ersten Mal verwendet, als unsere Versuche, die Progressionsrate des Zellzyklus mithilfe chemischer Synchronisation zu untersuchen, uns unerwartete Ergebnisse lieferten, die unsere Analyse beeinträchtigten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Zellbiologie zu beantworten.

Was ist zum Beispiel die Grundlage für unterschiedliche Wachstumsraten zwischen verschiedenen Zelltypen? Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Zellen mit BRDU markieren, um dies zu tun. Beginnen Sie damit, eine 10-Zentimeter-Platte für jeden Zeitpunkt und eine für jedes der folgenden Steuerelemente zu beschriften.

BRDU nur PI nur BRDU negativ PI negativ Seed jede Platte mit fünf mal 10 bis zur fünften. MCF sieben Zellen in supplementiertem DMEM inkubieren die Platten für 24 bis 48 Stunden, damit sich die Zellen erholen und anheften können. Sobald die Zellen eine Fluenz von 60 % conf erreicht haben, ersetzen Sie das Medium durch frisches DMEM mit 10 Mikromolaren

BRDU inkubiert die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2, um den Einbau von BRDU in die DNA zu ermöglichen. Achten Sie darauf, eine Platte unbehandelt zu lassen, um nach einer Stunde als Negativkontrolle oder Nullpunkt zu fungieren. Entfernen Sie das Impulsmarkierungsmedium und spülen Sie die Zellen kurz mit PBS bis zu den Zeitpunkten von zwei bis acht Stunden.

Fügen Sie frisches Wachstumsmedium hinzu und legen Sie es zurück in den Inkubator. Ernten Sie dann sofort die Null- und Ein-Stunden-Zeitpunktplatten, wie im nächsten Abschnitt beschrieben. Um die Zellen zu ernten, saugen Sie das Medium an und spülen Sie die Platte.

Einmal mit PBS, dann Trypsin untersucht die Zellen, um sie von der Platte zu lösen und sie in der DMEM-Zentrifuge bei drei 90 mal G für fünf Minuten zu sammeln. Entsorgen Sie den Überstand. Spülen Sie dann die Zellen in einer eiskalten PBS-Zentrifuge von ein bis fünf Millilitern bei drei 90 G für fünf Minuten nach dem Schleudern, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in hundert Mikrolitern Eis.

Kaltes PBS mit 1%FBS. Das FBS hilft, Zellverklumpungen zu verhindern. Einer der wichtigsten Aspekte dieses Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass Sie eine Einzelzellsuspension aus Ihren geernteten Zellen haben.

Für Fakten. Um dies zu erreichen, können Sie Ihre Zellen Tropfen für Tropfen direkt zum Ethanol hinzufügen. Dies ist entscheidend Um die Zellen zu fixieren, verwenden Sie die Pipette, um die Zellen tropfenweise zu fünf Millilitern Eiscode hinzuzufügen.

70% Ethanol in einem konischen 15-Milliliter-Rohr. Inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten auf Eis oder lagern Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Dies ist ein idealer Schritt, um die Entnahme von Proben zu den verschiedenen Zeitpunkten zu stoppen, die Proben können mehrere Tage in Ethanol belassen werden, so dass sie gleichzeitig durch den Rest des Protokolls verarbeitet werden können, um BRDU- und Propidiumiodid-Färbungen durchzuführen.

Entnehmen Sie die Zellen aus vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie sie bei drei 90 mal G für fünf Minuten. Nach dem Schleudern wird der größte Teil des Fixiermittels aspiriert, wobei etwa 50 Mikroliter übrig bleiben. Dann wirbeln.

Um das Pellet zu lösen, um die DNA beim Vortexen zu denaturieren. Geben Sie langsam einen Milliliter von zwei normalen HCL Triton X 100 tropfenweise hinzu und inkubieren Sie die Proben 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Pelletzellen werden durch Zentrifugieren der Proben fünf Minuten lang bei drei 90 mal G aspiriert, anschließend aspiriert und verworfen.

Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter 0,1 molaren Natriumtetraborat. Nach dem Zentrifugieren aspirieren die Zellen erneut und verwerfen den Überstand. Anschließend resuspendieren Sie das Zellpellet in 75 Mikrolitern BRDU-Färbung.

Mischen, nach der Inkubation bei Raumtemperatur 45 Minuten lang lichtgeschützt inkubieren. Die Zellen werden wie zuvor durch Zentrifugation pelletiert und das Zellpellet in einem Milliliter PBS resuspendiert, der fünf Mikrogramm pro Milliliter pro Perdiumiodid enthält. Wenn Sie die PI-positive Probe durch das Durchflusszytometer laufen lassen, erstellen Sie ein Vorwärtsstreudiagramm gegen ein Seitenstreudiagramm, um die richtige Größenverteilung der Zellen sicherzustellen.

Beide Parameter sollten auf einer linearen Skala dargestellt werden. Betrachten Sie gleichzeitig ein Diagramm von FL drei H gegen FL zwei W, um die PI-Färbung im Vergleich zur Fluoreszenzpulsbreite zu betrachten. Dieses Diagramm wird verwendet, um einen Gang zu erstellen, um die Fraktion der Zellen zu isolieren, von denen angenommen wird, dass sie sich innerhalb des normalen Verteilungsmusters des Zellzyklus befinden.

Im Allgemeinen ist dieses Verteilungsmuster durch zwei Zellcluster aus dem Zwei-N- und Vier-NDNA-Gehalt der PI-Färbung gekennzeichnet, die die G-Eins- bzw. G-Zwei-Phasen des Zellzyklus repräsentieren. Ein Zellstring, der sich zwischen diesen beiden Clustern befindet, ist repräsentativ für die laufende DNA-Replikation, die in der S-Phase des Zellzyklus stattfindet. Erstellen Sie ein Diagramm, in dem die abgegrenzten Zellen mit FL, eins, H oder FITC auf einer logarithmischen Skala auf der Y-Achse und PI auf einer linearen Skala auf der X-Achse angezeigt werden.

Dieses Diagramm wird verwendet, um die verbleibenden Parameter mit den verschiedenen Steuerelementen einzustellen und Daten zu sammeln. Platzieren Sie zur Analyse die PI-Only-Färbeprobe in der Ladeöffnung des Durchflusszytometers und stellen Sie die Verstärkung so ein, dass G eins bei etwa 200 auf der x-Achse platziert wird. Dies wird in einem Histogrammdiagramm des PI-Farbstoffs leichter zu visualisieren sein.

Legen Sie anschließend die BRDU-Probe in die Ladeöffnung und führen Sie sie aus. Passen Sie die Verstärkung so an, dass die beiden Zellpopulationen, BRDU positiv und BRDU negativ, im Diagramm angezeigt werden. Im Idealfall werden die BRDU-negativen Zellen knapp bei oder unter 10 zu der eins positioniert.

Die letzte Kontrolle ist die BDU-Slash-PI-Negativprobe. Führen Sie diese Negativkontrolle durch, um sicherzustellen, dass die Zellen nicht in einem der oberen oder rechten Quadranten angezeigt werden. Sobald die Parameter der verschiedenen Plots eingestellt sind, ist das Durchflusszytometer kalibriert und bereit für die Verarbeitung von BRDU und PI. Gefärbte Zellen sammeln Daten von mindestens 10.000 PI-Gated-Zellen für jede Probe.

Erstellen Sie dann mit Software wie FlowJo oder Fax diva ein Diagramm von FITC versus PI mit Zellen, die als PI-positiv aus dem PI versus FL Zwei-W-Diagramm abgegrenzt werden. Zur Unterscheidung der radfahrenden Bevölkerung. Generieren Sie als Nächstes ein zweites Gate, um die BRDU-positive Population zu isolieren.

Um dann den zeitlichen Verlauf der Zellzyklusprogression zu verfolgen, stellen Sie die Anzahl der BRDU-positiven Zellen mit G eins oder G zwei Gehalt als Funktion der Zeit dar, um den Zellzyklus der Progression zu vergleichen. Kinetik zwischen zwei kolorektalen Zelllinien HT 29 und LS 180. Die Zellen wurden acht Stunden lang stündlich nach der Entfernung des A-B-R-D-U-Impulses entnommen.

Vergleicht man die Kinetik der beiden Profile, so ist das Auftreten eines G eins-Peaks bei t gleich vier Stunden nach BRDU in den LS 180-Zellen offensichtlich, verglichen mit dem entsprechenden Zeitpunkt für die HT 29-Zelllinie, der dieser Peak fehlt. Dies deutet auf eine beschleunigte Zellzyklusprogression durch die G-Zwei-Phase des Zellzyklus hin. In der kolorektalen Zelllinie LS 180 zur Erstellung eines Zyklusprofils der Brustkrebszelllinie.

MC sieben Zellen wurden acht Stunden lang stündlich gesammelt. Nach der Entfernung des BRDU-Impulses. Die immunmarkierten und DNA-Gegenfärbezellen wurden dann anhand ihrer Fluoreszenzsignale sortiert.

Wie hier zu sehen ist, zyklierten CF-Zellen sieben Zellen signifikant langsamer als eine der beiden getesteten kolorektalen Zelllinien. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die metabolische Markierung von DNA in Verbindung mit der Zeitpunktentnahme es Ihnen ermöglicht, die Kinetik des Zellzyklus zu verfolgen.