Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die DNA-Methylierung in einer einzigen Eizelle zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Kumuluszellen und Seifen-Palita aus den gesammelten Eizellen entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Eizelle in eine Zwei-zu-Eins-Lyselösung einzubetten, um die kleinste Menge an DNA vor Verlust oder Abbau zu schützen.

Als nächstes wird eine Bi-Sulfit-Mutagenese durchgeführt, gefolgt von einer Amplifikation durch verschachtelte Polymerase-Kettenreaktion. Der letzte Schritt besteht darin, das PCR-Produkt zu ligieren und zu klonen. Die Klone werden dann ausgewählt, PCR-amplifiziert und zur Sequenzierung geschickt.

Letztendlich wird die Bi-Sulfit-Mutagenese und -Sequenzierung verwendet, um die DNA-Methylierung an Cytosinphosphatguinee oder CPG-Dinukleotiden einer Region von Interesse in einer einzelnen Eizelle zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Bi-Sulfit-Mutagenese großer Zellzahlen besteht darin, dass Daten aus einer einzigen Eizelle gewonnen werden können, ohne dass Zyten gepoolt, PCR-Verzerrung und Chemozellkontamination erforderlich sind. Bereiten Sie am Tag der Eizellentnahme die im schriftlichen Protokoll aufgeführten Lösungen frisch vor, wenn Sie Lösungen herstellen, um die Wahrscheinlichkeit einer DNA-Kontamination zu verringern, indem Sie häufig die Handschuhe wechseln und die Verwendung von Filterspitzen auch bei geöffneten Röhrchen abgewinkelt halten und alle Röhrchen bei Nichtgebrauch wieder verschließen.

Beginnen Sie die OSI-Sammlung, indem Sie die präparierten Maus-Ovadukte in M zwei Medien legen und die M-Riemenscheibe aufreißen, um den Kumuluszellkomplex zu extrahieren. Trennen Sie dann die Zyten vom Kumuluszellkomplex mit 0,3 Milligramm pro Milliliter Hyaluronidase-Lösung in einem 30-Mikroliter-Tropfen M zwei Medien. Bewahren Sie die Zyten nur so lange in Lösung auf, wie es dauert, die Kumuluszellen zu entfernen, da sie bei längerer Exposition geschädigt werden können.

Waschen Sie die Eizellen in 30 Mikrolitern M zwei Medien, indem Sie die Eizellen von Tropfen zu Tropfen übertragen. Entfernen Sie die Kumuluszellen regelmäßig für insgesamt drei Wäschen. Entfernen Sie das Z von LUCITA mit saurer Tyrolösung.

Legen Sie die Eizellen zuerst in einen 30-Mikroliter-Tropfen Lösung und geben Sie sie dann in einen weiteren 30-Mikroliter-Tropfen. Denn jedes mitgeführte Medium verdünnt die Säure und verringert ihre Effizienz. Bewahren Sie die Zyten nur so lange in Lösung auf, wie es dauert, die Zona zu entfernen, da eine längere Exposition sie beschädigen kann.

Nach der Entnahme der Zona die Zyten erneut in einem 30-Mikroliter-Tropfen M zwei Medien waschen, um die Agros-Einbettung durchzuführen und zuerst die Lyselösung auf einen 70 Grad Celsius heißen Block zu legen. Geben Sie den vorgewärmten niedrigen Schmelzpunkt oder LMP Agros in die Lyselösung, um eine AGROS-zu-Lyselösung von zwei zu eins herzustellen. Legen Sie dann eine einzelne Eizelle auf einen sauberen Objektträger in mindestens M zwei Medien.

Der nächste Schritt besteht darin, den einzelnen Cyten in die Agros- und Lyselösung einzubetten. Dies muss schnell geschehen, da das Agros bei Temperaturen unter 65 Grad Celsius aushärtet. Nehmen Sie 10 Mikroliter der Agros-Lyselösung unter dem Mikroskop in eine Pipettenspitze auf.

Etwa einen Mikroliter oder weniger der Agrolyselösung vorsichtig auf den Objektträger ausstoßen, damit sie sich mit dem minimalen Medium vermischen kann. Nehmen Sie die Eizelle vorsichtig in die Pipettenspitze auf. Geben Sie dann alle 10 Mikroliter in ein Einor-Röhrchen mit 300 Mikrolitern Mineralöl, so dass die resultierende Perle eine kugelförmige Form annimmt.

Inkubieren Sie das Röhrchen 10 Minuten lang auf Eis, um die Lyse durchzuführen. Entfernen Sie die 300 Mikroliter Mineralöl und fügen Sie 500 Mikroliter des SDS-Lysepuffers hinzu. Inkubieren Sie die Probe am zweiten Tag über Nacht in einem Wasserbad bei 50 Grad Celsius.

Die Bisulfid-Mutageneselösungen werden frisch hergestellt, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Beginnen Sie mit der Mutagenese, indem Sie die 500 Mikroliter SDS-Lysepuffer vollständig entfernen. Denken Sie daran, dass der verbleibende Lysepuffer das Agros beim Erhitzen verdünnt und die Perle anfälliger dafür ist, sich in den nachfolgenden Schritten aufzulösen.

Nach vollständiger Entfernung des Lysepuffers werden 300 Mikroliter Mineralöl zugegeben. Inkubieren Sie die Probe zweieinhalb Minuten lang auf einem 90 Grad Celsius heißen Heizblock. Nehmen Sie Karat zum Mischen oder Rühren, Verlängern oder Schwanken der Temperatur.

Nach zweieinhalb Minuten. Inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis. Um eine Denaturierung durchzuführen, entfernen Sie das Mineralöl und geben Sie einen Milliliter 0,1 molares Natriumhydroxid in die Tube und drehen Sie die Tube fünf- bis sechsmal um.

Inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang. In einem auf 37 Grad Celsius eingestellten Wasserbad, das sich alle drei bis vier Minuten umdreht, sollte die Perle im Natriumhydroxid schwimmen. Beachten Sie, dass sich die Perle nicht mehr am Boden des Rohrs befindet.

Um eine Sulfitbehandlung durchzuführen, drehen Sie das Rohr zunächst vorsichtig, nachdem Sie das Natriumhydroxid entfernt haben. Fügen Sie 300 Mikroliter Mineralöl und 500 Mikroliter BIS-Sulfitlösung hinzu. Achten Sie darauf, dass Sie nicht mit Licht in Berührung kommen, und inkubieren Sie die Röhre dreieinhalb Stunden lang in einem 50 Grad warmen Wasserbad.

Führen Sie nun die Desination durch. Inkubieren Sie die Probe zunächst drei Minuten lang auf Eis, bevor Sie das Mineralöl und die BIS-Sulfitlösung entfernen. Nach einem sanften Schleudern fügen Sie einen Milliliter 0,3 molare Natronlauge hinzu und drehen Sie das Röhrchen fünf- bis sechsmal um.

Inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang. In einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad, das sich alle drei bis vier Minuten umdreht, sollte die Perle vor Beginn der PCR wieder im Natriumhydroxid schwimmen. Waschen Sie die Proben, indem Sie sie zuerst vorsichtig schleudern.

Entfernen Sie dann das Natriumhydroxid und fügen Sie einen Milliliter eines xte pH 7,5 hinzu. Fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur schütteln. Nach einer zweiten sanften Drehung den XTE entfernen.

Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal. Fügen Sie dann einen Milliliter Autoklav, doppelt destilliertes Wasser, hinzu. Fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur schütteln, ein drittes Mal leicht schleudern und das Wasser entfernen.

Wiederholen Sie die doppelte Wäsche mit destilliertem Wasser zweimal. Entfernen Sie zum Schluss alle Überstände, so dass nur die Aros-Perle übrig bleibt. Prüfen Sie, ob der pH-Wert des Überstands 5,0 beträgt.

Wenn der Überstand noch zu basisch ist, waschen Sie die Kügelchen erneut mit doppelt destilliertem Wasser. Geben Sie in der Zwischenzeit die erste runde PCR-Mischung in das PCR-Röhrchen, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Schieben Sie den soliden Agro Speed an den Rand des Einor-Rohres.

Übertragen Sie dann vorsichtig die Agro-Geschwindigkeit auf das PCR-Röhrchen, erhitzen Sie es eine Minute lang auf 70 Grad Celsius und mischen Sie es dann, um es zu amplifizieren, wird im schriftlichen Protokoll empfohlen. Bereiten Sie nach der Amplifikation in der ersten Runde die PCR-Reaktion der zweiten Runde vor, wobei Sie fünf Mikroliter des Produkts der ersten Runde als Vorlage verwenden. Achten Sie darauf, dass Sie unter der Mineralölschicht bipa sind.

Fahren Sie fort, die zweite Amplifikationsrunde wie im Text angegeben als diagnostischen Test durchzuführen. Proben der zweiten Runde können mit einem Restriktionsenzym, d.h. einer Methylierungs- oder Stamm-spezifischen Elektrophorese, geschnitten werden, wobei die Aufschlussprodukte auf einem 8%igen Acrylamidgel aufgebracht werden. Alle heterogenen Banden, die sich daraus ergeben, repräsentieren mehr als eine Sequenz, um das zweite runde Produkt zu klonen, in den Vektor zu ligieren und die TA-Klonierung durchzuführen, wie in dem Manuskript beschrieben, das diesem Video beigefügt ist. Nach der TA-Klonierungsplatte wird die gesamte Reaktion auf einen Agar und eine LB-Platte gemischt, ergänzt mit Ampicillin, ex gal und IPTG, und die Platte wird über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Geben Sie dann den Kolonie-PCR-Mastermix in das PCR-Röhrchen, wie im schriftlichen Protokoll aufgeführt. Nehmen Sie mit einer Pipettenspitze eine weiße Bakterienkolonie von der Platte und schwenken Sie sie in 35 Mikroliter des Kolonie-PCR-Mastermixes in einem PCR-Röhrchen. Fahren Sie mit der Amplifikation der Suspension fort, wie im Text beschrieben, nach der PCR-Amplifikationselektrophorese vier Mikroliter des PCR-Produkts auf einem 1,5%igen AGROS-Gel.

Senden Sie schließlich etwa 30 Mikroliter des PCR-Produkts zur Sequenzierung von fünf Kolonie-PCRs pro Zyt. Sobald die Sequenzierungsergebnisse vorliegen, können die Methylierungsmuster abgelesen werden, wobei jedes ursprüngliche Cytosinguanin, das als solches methyliert übrig geblieben ist, abgelesen werden kann. Umgekehrt wurde jedes ursprüngliche Cytosin-Guanin, das jetzt ein Thiamin-Guanin ist, nach einer verschachtelten PCR-Amplifikation unter Verwendung von Bi-Sulfit-umgewandelten Primern unmethyliert.

Es ist möglich, eine erfolgreiche Umwandlung zu bestätigen, indem eine korrekte Fragmentgröße auf einer individuellen Metaphase des Arous-Gels visualisiert wird. Zwei Eizellen repräsentieren ein elterliches Allel und haben theoretisch ein geprägtes Methylierungsmuster als solches. PCR-Produkte der zweiten Runde können auf unbeabsichtigte Kontamination getestet werden.

Ein Restriktionsenzym, das empfindlich auf DNA-Methylierung reagiert, kann verwendet werden, um das PCR-Produkt der zweiten Runde zu verdauen, um zu beurteilen, ob es ein methyliertes oder unmethyliertes Allel enthält. Hierbei wird ein methyliertes Cytosin innerhalb der Enzymerkennungssequenz gespalten. Während ein unmethyliertes Cytosin, das in Thymin umgewandelt wird, vom Enzym nicht mehr erkannt wird und ungeschnitten wird, sollte jede Eizellprobe der Metaphase, die sowohl methylierte als auch unmethylierte Allele enthält, verworfen werden, da sie auf eine Kontamination der Kumuluszellen oder einen Polkörpereinschluss nach Ligation und Transformation hinweist.

Eine erfolgreiche Kolonie-PCR-Amplifikation kann auf einem AROS-Gel visualisiert werden, um sicherzustellen, dass Proben mit der richtigen Produktgröße zur Sequenzierung geschickt werden. In diesem Beispiel beträgt die erwartete Amplikongröße nach der Ligation hundert 56 Basenpaare. Hier hat Klon fünf eine falsche Amplikongröße und sollte nicht zur Sequenzierung eingeschickt werden.

Die Sequenz von fünf einzelnen Klonen aus einer Metaphase-2-Eizelle sollte fünf identische Methylierungsmuster und identische Nicht-CPG-Konversionsraten erzeugen. Alle Proben, die mehr als ein Muster enthalten, sollten verworfen werden. Da zwei Zyten in der ovulierten Metaphase zwei Chromosomenkopien oder einen angehängten Polkörper haben, besteht die Möglichkeit, zwei ähnliche Sequenzmuster zu erhalten.

Die Daten von Zyten, die sehr unterschiedliche Methylierungsmuster aufweisen, sollten verworfen werden. Da eine Kontamination mit Kumuluszellen nicht ausgeschlossen werden kann, ist es wichtig, dass Sie bei diesem Verfahren zuerst daran denken, die Eizellen mehrmals in frischem Medium zu waschen und dann nach der HI IDE-Behandlung so viele Kumulzellen wie möglich zu entfernen. Zweitens härtet das Agros mit niedrigem Schmelzpunkt bei Temperaturen unter 65 Grad Celsius aus, also arbeiten Sie vorsichtig, aber schnell.

Und schließlich sind Natriumbissulfat und Hydrochinon lichtempfindlich, daher sollten Reaktionsgefäße und Lösungen in Folie eingewickelt werden.