Name: Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Erfahren Sie die Bisulfit-Mutagenese an einzelnen Oozyten zur Analyse der DNA-Methylierung auf Einzelzellebene. Diese Methode ermöglicht epigenetische Studien in der Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde von der University of Western Ontario, der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie unterstützt, und einen Zuschuss ER06-02-188 aus dem Ministryof Forschung und Innovation, Early Researcher Award. MMD wurde von einem CIHR-Trainings-Programm in der Reproduktion, frühe Entwicklung und die Auswirkungen auf die Gesundheit (REDIH) Graduate Scholarship unterstützt.

TAG 1 Stellen Sie folgende Lösungen frisch auf den Tag der Eizellenentnahme mit sterilem, destilliertem Wasser wie GIBCO Wasser. Um die Möglichkeit von DNA-Kontamination zu verringern, die Handschuhe wechseln oft und Filterspitzen. Halten Röhrchen entfernt, wenn sie geöffnet abgewinkelt ist und Erinnerung alle Rohre, wenn nicht in Gebrauch ist. Wir empfehlen, dass Lösungen wie n +1 gemacht werden. 3% LMP-Agarose 30 mg niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose bis zu 1 ml H 2 O GIBCO lösen bei 70 ° C Lysis Solution 8 ul Lysispuffer 1 ul Proteinase K 1 ul 10% IGEPAL auf Eis bis zur Verwendung 2.01 Agarose: Lysis Solution (10 ul pro einzelne Eizelle, ist Betrag für 3 Oozyten) 20 ul 3% LMP-Agarose 10 pl Lysis Solution mischen bei 70 ° C SDS LySIS-Puffer (501 ul pro einzelnen Eizelle) <table border="0"><tbody><tr><td> 1x TE pH 7,5 </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> 50 pl </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td></td><td> 501 ul </td></tr></tbody></table> 1. Eizellenentnahme <ol><li> Legen Sie die Maus seziert Eileiter in M2-Medium, und reißen Sie die Ampullen, die Cumulus-Zell-Komplex zu extrahieren. </li><li> Trennen Sie die Eizellen aus dem Cumulus-Zell-Komplex mit 0,3 mg / ml Hyaluronidase-Lösung in einem 30 ul Tropfen M2-Medium. Halten Sie die Oozyten in Lösung nur solange, wie es um die Cumulus-Zellen zu entfernen dauert, wie lange Exposition beschädigen könnten. Waschen Sie die Oozyten 3x in 30 ul Tropfen M2-Medium, das Entfernen Kumuluszellen in regelmäßigen Abständen. </li><li> Entfernen Sie das Zona pellucida mittels saurer Tyrode-Lösung. Legen Sie die Eizellen in einem 30 ul Tropfen der Lösung zuerst, und dann auf einen anderen übertragen 30ul Tropfen, wie alle Medien mitgeführt wird die Säure zu verdünnen und seine Effizienz zu reduzieren. Halten der Oozyten in Lösung nur so lange wie es die Zona zu entfernen, wie lange Belichtungszeit beschädigen könnten erfolgt. Hinweis: eine erhöhte Konzentration von sauren Tyrode-Lösung oder Pronase kann für den menschlichen Proben verwendet werden, da das menschliche Zona pellucida ist gegenüber einer Behandlung mit sauren Tyrode-Lösung als die Maus. </li><li> Waschen Sie die Eizellen noch einmal in einem 30 ul Tropfen M2-Medium. </li></ol> 2. Agarose Embedding und Lysis <ol><li> Um Agarose Einbettung durchführen, legen Sie die Lyse-Lösung auf einem 70 ° C Heizblock. Fügen Sie den vorgeheizten LMP-Agarose zur Lyse-Lösung, wodurch ein 2:1 Agarose: Lyse-Lösung. </li><li> Legen Sie eine einzelne Eizelle auf einen sauberen Objektträger aus Glas in minimalen M2 Medien. Nehmen Sie bis 10 ul der Agarose: Lyse-Lösung in eine Pipettenspitze, und (unter dem Mikroskop) sanft pressen eine kleine Menge (ca. 1 mu l oder weniger) auf den Objektträger, so dass sie mit dem minim mischenal Medien. Vorsichtig holen die Eizelle in die Pipettenspitze und legen Sie alle 10 pl in ein Eppendorf-Röhrchen mit 300 ul Mineralöl so die Raupe einer Kugel bildet. Hinweis: Dieser Prozess muss ziemlich schnell als der Agarose geschehen wird hart, wenn die Temperatur sinkt so wenig wie 5 ° C unter 70 ° C. </li><li> Das Röhrchen auf Eis für 10 Minuten. Zur Lyse durchführen, entfernen Sie die 300 ul Mineralöl und fügen Sie 500 ul des SDS Lysepuffer. Inkubieren über Nacht in einem 50 ° C Wasserbad. Hinweis: Lyse-Lösung (Tabelle 1) kann auch für diesen Zweck verwendet werden. </li></ol> TAG 2 Stellen Sie folgende Lösungen frisch am Tag der Bisulfit-Mutagenese. Um die Chance der DNA-Kontamination zu verringern, die Handschuhe wechseln oft und Filterspitzen. Halten Röhrchen entfernt, wenn sie geöffnet abgewinkelt ist und Erinnerung alle Rohre, wenn nicht in Gebrauch ist. Wir empfehlen, dass Lösungen wie n +1 gemacht werden. <table border="0"><tbody><tr><td> 3 M NaOH </td> &lt;td&gt; 2,4 g NaOH in 20 ml autoklavierten ddH 2 O </td></tr><tr><td> 0,1 M NaOH </td><td> 0,5 ml 3M in 14,5 ml autoklavierten ddH 2 O </td></tr><tr><td> 0,3 M NaOH </td><td> 1,5 ml 3M in 13,5 ml autoklavierten ddH 2 O </td></tr></tbody></table> 2,5 M Bisulfit-Lösung <ol class="lalpha"><li> 3,8 g Natriumbisulfit 5,5 ml GIBCO destilliertem H 2 O 1 ml 3 M NaOH auflösen @ Raumtemperatur </li><li> 110 mg Hydrochinon 1 ml GIBCO destilliertem H 2 O aufzulösen bei 90 ° C (nur so lange wie es zu lösen hat, zu mischen regelmäßig) </li></ol> Wenn vollständig aufgelöst ist, zu mischen Lösung (a) und (b) * Fernhalten von Licht * 3. Bisulfit-Mutagenese <ol><li> Vollständig entfernen Sie die 500 ul SDS Lysepuffer und 300 ul Mineralöl (~ 20 Stunden). Jede Lysepuffer übrigen wird verdünnen the Agarose, wenn es erhitzt wird und der Wulst wird anfälliger für Auflösen in den nachfolgenden Schritten. Fahren Sie mit Bisulfit-Mutagenese sofort, oder bei -20 ° C für bis zu 5 Tage. </li><li> Entfernen Sie gegebenenfalls Oozyten aus dem Gefrierschrank und tauen (nur bis Agarosekugel relativ lichtdurchlässig ist). Inkubieren für 2,5 Minuten auf 90 ° C Heizblock, nach dem Inkubieren auf Eis für 10 Minuten. Hinweis: Verwenden Sie nicht gleichzeitig oder rühren, verlängern länger als 2,5 Minuten, oder schwanken Temperatur. </li><li> Zur Denaturierung durchführen, entfernen Sie die Mineralöl-und 1 ml 0,1 M NaOH in jedes Röhrchen, Flick und invertieren 5-6 mal. </li><li> Inkubation: 15 Minuten bei 37 ° C im Wasserbad, Invertieren alle 3-4 Minuten. Der Wulst sollte in der NaOH schweben. </li><li> Um Bisulfit-Behandlung durchzuführen, drehen Sie das Rohr vorsichtig, dann entfernen Sie die NaOH und 300 ul Mineralöl und 500 pl Bisulfit-Lösung. Das Röhrchen für 3,5 Stunden in einem 50 ° C im Wasserbad. * Fernhalten von Licht * </strong&gt; Hinweis: Die Länge der Inkubation Möglicherweise müssen empirisch für Gen von Interesse bestimmt werden. </li><li> Um Desulfonierung durchführen, Inkubation auf Eis für 3 Minuten, entfernen Sie dann die Mineralöl-und die Bisulfit-Lösung, spinnen sanft, und 1 ml 0,3 M NaOH. Flick und invertieren 5-6 mal. </li><li> Inkubation: 15 Minuten bei 37 ° C im Wasserbad, Invertieren alle 3-4 Minuten. Der Wulst sollte in der NaOH schweben. </li><li> Waschen Sie die Proben, indem Sie zunächst die Spinnerei sanft, dann entfernen Sie die NaOH und 1 ml 1x TE pH 7,5. Schütteln Sie für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur (auf einem Schüttler). Spin sanft wieder, dann entfernen Sie die 1x TE. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal Waschen. </li><li> 1 ml autoklavierten ddH 2 O. Schütteln Sie für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur (auf einem Schüttler). Spin sanft, dann entfernen Sie das H 2 O. Wiederholen Sie ddH 2 O Waschen zweimal. </li><li> Den pH-Wert des Überstands; sollte pH 5,0 sein. Wenn immer noch zu einfach, nachwaschen mit H 2 O. Entfernen Sie das gesamte Überstand, so dass nur die Agarose seinad. </li></ol> 4. 1. und 2. Runde PCR-Amplifikation <ol><li> Bereiten 1. Runde PCR-Mix ** beim Waschen ** </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 uM Primer vorderen äußeren </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 uM Primer Reverse-Outer </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 240 ng / ml tRNA </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 13 ul </td></tr></tbody></table> In den Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR Perlen Schieben Sie die feste Agarose-Kügelchen in die PCR-Röhrchen (~ 10 ul) Hitze bis 70 ° C und mischen In 25 ul Mineralöl Gesamt: 50 pl <ol start="2"><li> Verstärken Hinweis: Ein Beispiel-Bedingungen für Maus Snrpn ist Denaturierung 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 ° C, 1 Minute bei 50 ° C und 1Minute bei 68 ° C und eine endgültige 10 Minuten Verlängerungsschritt bei 68 ° C Glühtemperatur für 1. Runde PCR für Maus und Peg3 H19 beträgt 50 ° C. </li><li> Bereiten 2. Runde PCR-Mix </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 uM Primer vordere innere </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 uM Primer Reverse-Innere </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 19 ul </td></tr></tbody></table> In den Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR Perlen Geben Sie 5 ul 1. Runde Produkt als Vorlage. Erhitzen Sie die 1. Runde Produkt bis 70 ° C für 1 Minute, um die Agarose zu erweichen. Stellen Sie sicher, unter der Schicht aus Mineralöl pipettieren. In 25 ul Mineralöl Gesamt: 50 pl Hinweis: Verschachtelte Primersequenzen für Snrpn, H19 und Peg3 kann in Market-Urteil Velker et al 10 zu finden,12. <ol start="4"><li> Verstärken Hinweis: Die Zyklusbedingungen für Maus Snrpn ist Denaturierung 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 ° C, 1 Minute bei 50 ° C und 1 Minute bei 68 ° C und eine endgültige Dehnung 10 Minuten Schritt bei 68 ° C 10. Maus H19 und Peg3 eine 50 ° C Annealing-Temperatur für 2 Runde PCR. </li><li> Als eines diagnostischen Tests können zweiten Runde Proben mit einem Restriktionsenzym, das Methylierung oder Stamm-spezifische geschnitten werden. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2. Runde Produkt </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Restriktionsenzym </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Puffer </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 4 ul </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Elektrophorese die Verdauungsprodukte auf einem 8% igen Acrylamidgel. Etwaige heterogenen Banden repräsentieren mehr als eine sequence. </li></ol> 5. TA Cloning und Kolonie-PCR <ol><li> Um 2. Runde Produkt zunächst erwärmt auf 70 klonen ° C für 1 Minute, um die Agarose, dann Ligat in den Vektor unter Verwendung des Promega pGEM-T Vektor-System (Fisher Scientific Cat # A1360) zu erweichen. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2. Runde PCR </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> pGEMT-easy-Vektor </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Ligase </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> 2x Ligationspuffer </td><td> 5 ul </td></tr></tbody></table> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C in PCR-Maschine. <ol start="2"><li> Auftauen kompetente E. coli Zellen auf Eis für 15 Minuten (Zymo Research Corp Cat # T3009). In 3 ul Ligationsreaktion zu 8 ul E. coli und inkubieren Ligation auf Eis für 15 Minuten. </li><li> Hitzeschock für 40 Sekunden in einem 42 ° C im Wasserbad,und auf Eis für 2 Minuten inkubiert. In 60 ul SOC-Medium und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde (im Shaker). </li><li> Legen Sie alle der Reaktionsmischung auf eine LB / Agar / IPTG / X-Gal / Amp-Platte und inkubieren Platte bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Bereiten Kolonie-PCR-Mix </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 20 uM M13 Vorwärts-Primer </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> 20 uM M13 Reverse Primer </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> 5X Grüne Go Taq-Puffer </td><td> 7,0 ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> Taq DNA-Polymerase </td><td> 0,28 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 25,62 ul </td></tr><tr><td></td><td> Insgesamt 35 ul </td></tr></tbody></table> In 35 ul Colony PCR Master Mix in ein PCR-Tube. Wählen Sie einen weißen Bakterienkolonie von der Platte mit einer Pipettenspitze und wirbeln sie in die PCR-Reaktion. <ol start="6"><li> Verstärken mit Denaturierung für 10 Minuten bei 94 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 45 Sekunden bei 94 ° C, 30 Sekunden bei 57 ° C und 1 Minute bei 72 ° C und eine endgültige Dehnung 10 Minuten bei 72 ° C 4 ul Elektrophorese auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen. Senden ~ 30 ul des PCR-Produkts für die Sequenzierung. Hinweis: Oozyten, 5 Kolonie-PCR-Produkte sequenziert. </li><li> Sobald Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse sind, können Methylierungsmuster zu lesen. Jede Original-CG, die als CG blieb wurde methyliert, und jedes Original CG, die heute ein TG wurde nicht methyliert. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse In unserer Arbeit mit dem Aufdruck wir Assay-Methylierung in einzelnen Eizellen und Embryonen (Abbildung 1). Nach verschachtelten PCR-Amplifikation mit Primern konvertierter, ist es möglich, einen erfolgreichen Umwandlung durch Visualisierung einer korrekten Fragments die auf einem Agarosegel (2) zu bestätigen. Eine einzelne Eizellestellt einen elterlichen Allel, und in der Theorie, hat man aufgedruckten Methylierungsmuster. Als solches kann zweiten Runde PCR-Produkte für unbeabsichtigte Verunreinigungen geprüft werden. Ein Restriktionsenzym empfindlich auf DNA-Methylierung (wie HinfI oder DpnII) verwendet werden, um die zweite Runde PCR-Produkt verdauen zu beurteilen, ob ein methyliertes Allel oder unmethylierten (3) enthält. Ein methyliertes C innerhalb des Enzym-Erkennungssequenz gespalten wird, während ein unmethylierten C, die T umgewandelt wird nicht mehr durch das Enzym erkannt und ist nicht geschnitten. Jede Probe, die MII-Eizelle sowohl methylierter und nicht methylierter Allele sollte verworfen werden, da es indikativ für Cumulus Zellkontamination (Abbildung 3) ist. Nach Ligation und Transformation, kann eine erfolgreiche Kolonie PCR-Amplifikation werden auf einem Agarosegel visualisiert werden, um sicherzustellen, Proben mit dem richtigen Produkt zur Sequenzierung Größe gesendet werden (Abbildung 4). Schließlich wird die Sequenz von fünf einzelnen cldiejenigen aus einer MII Eizelle produzieren sollten fünf identische Methylierungsmuster und identisch nonCpG Conversion-Raten (Abbildung 5a). Alle Proben, die mehr als ein Muster enthalten, sollten verworfen werden (Abbildung 5b) werden. Seit ovulierten MII-Oozyten zwei Chromosom-Kopien oder eine angehängte Polkörper haben, gibt es eine Möglichkeit für den Erhalt von zwei ähnlichen Sequenz Muster (Abbildung 5c). Wir empfehlen Verwerfen von Daten aus Eizellen, die höchst unterschiedliche Methylierungsmuster haben seit Cumulus Zellkontamination kann nicht ausgeschlossen werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Einzel-Oocyte Bisulfit-Mutagenese-Assay. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus 2. Runde Verstärkung für Snrpn aus einer singenle MII Oozyte auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen. Spuren 1-4 sind vier Single-MII-Oozyten und Spur 5 ist eine Negativ-Kontrolle (keine Eizelle). Erwartete Fragmentlänge für Snrpn beträgt 420 bp. L, Leiter. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig3.jpg" /> 3. Repräsentative Ergebnisse von 2 Runde methylierungsspezifische Restriktionsverdau für Snrpn aus einer Eizelle MII auf einem 8% igen Acrylamidgel. HinfI diagnostischen Restriktionsverdau zeigt unmethyliert DNA, die ein T, das die Restriktionsstelle schafft trägt (420bp, Spur 1) oder methylierte DNA, die eine C innerhalb Erkennungsstelle enthält (Schnitt, 262, 103 und 54 bp, Spur 2). Die Verdauung in denen sowohl methylierter und nicht methylierter Restriktionsenzymstellen (Cut &amp; Uncut Bands, Spur 3) sind bezeichnend für Cumulus-Zell-Kontamination. L, Leiter. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig4.jpg" /> Abbildung 4. </strong&gt; Repräsentative Ergebnisse für Kolonie-PCR-Amplifikation für Snrpn aus einer Eizelle MII auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen. Voraussichtlich Fragmentlänge nach Ligation Snrpn in den pGEM-T Easy Vektor und unter Verwendung von M13 Vorwärts und Rückwärts-Primer ist 656 bp. Lane 1-8, 1-8 Amplikons aus Klonen. Clone 5 hat eine falsche Fragmentlänge und sollte nicht zum Sequenzieren geschickt werden. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig5.jpg" /> Abbildung 5. Vertreter Sequenzierung Ergebnisse für Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII. Snrpn wird in Oozyten methyliert. Schwarze Kreise zeigen methylierte CpG. Weiße Kreise zeigen unmethylierte CpGs. CpG Anzahl und die Platzierung ist repräsentativ für eine B6-Stamm weiblichen Maus. a) Erwartete Ergebnisse für die Sequenzierung Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII. Nur ein einzelner DNA-Strang ist in allen fünf Klone zu amplifizieren. Oozyten mit einem einzigen Methylierungsmuster und identische nicht-CpG-Konvertierung Geplappern sollten Auswertung einbezogen werden (prozentuale Umwandlung von nicht-CpG angegeben auf der rechten Seite wurde die Anzahl der nicht-CpG Cytosine, die, wie in Prozent der gesamten nicht-CpG Cytosine Thymin berechnet). b) Die Sequenzierung Ergebnisse für Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII mit Cumulus-Zell-Kontamination. Beachten Sie die Unähnlichkeit zwischen Methylierung Staaten und Muster, die Umwandlung Mehrfachsteckgliedern Verstärkung. c) Sequenzierung Ergebnisse für Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII mit beiden Chromosomen-Kopien oder Polkörper Eingliederung.

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese einzelne Eizelle Assay enthält viele Schritte mit einer Zahl, die kritisch sind und bedürfen einer besonderen Pflege. Die erste ist Oozyte Waschen. Es ist besonders wichtig zu waschen Jeder Oocyt mehrmals in frischem Medium fällt nach Hyaluronidase-Behandlung, so viele Kumuluszellen wie möglich zu entfernen. Darüber hinaus bei der Übertragung von Eizellen, um saure Tyrode-Lösung für Zona pellucida Entfernung sicherstellen umgebenden Medium ist klar, von Cumulus-Zellen. Die Eizelle ist sehr klebrig zona nach Entfer...

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td colspan="4"> Eizellenentnahme </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Saure Tyrode </td><td> Sigma </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> 10% IGEPAL </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Lysis Solution </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> Sigma </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> EDTA, pH 8,0 </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> LiDS </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS-Lysepuffer </td></tr><tr><td> TE pH 7,5 </td><td> Bioshop (Tris) Sigma (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Bisulfit-Konvertierung </td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Sigma </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydrogensulfit (Natriumbisulfit) </td><td> Sigma </td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td> Hydrochinon </td><td> Sigma </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> Niedrigen Schmelzpunkt (LMP) Agarose </td><td> Sigma </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> Mineralöl </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> M2 Medium </td><td> Sigma </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO destilliertes Wasser </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Autoklavierten doppelt destilliertes (dd) Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra Hot Start Mix RTG </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / ml Hefe-tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Grün GoTaq Reaktionspuffer </td><td> ProfiMega- </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> Innere und äußere verschachtelten Primern </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ligation </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T Easy Vektor </td><td> Fisher Scientific </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TA Cloning </td></tr><tr><td> Kompetente E. coli Zellen </td><td> Zymo Research Corp </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Lupen-Mikroskop </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 ° C und 90 ° C Hitze-Blöcke </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C und 50 ° C Wasserbäder (42 ° C für Transformationen) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rocker </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR-Maschine </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einzel oocyte bisulfit-mutagenese

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetik umfasst alle vererbbar und reversible Modifikationen an Chromatin, die alter-Gen Zugänglichkeit und damit die primären Mechanismen für die Regulierung der Gentranskription 1 sind. DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, die überwiegend fungiert als repressiv-Marke. Durch die kovalente Addition einer Methylgruppe an Cytosin in CpG-Dinukleotide, kann es zu rekrutieren weitere Proteine ​​und repressiven Histon-Modifikationen, um Prozesse in kondensierenden Chromatin und Abschaltung von Genen 2 beteiligt zu initiieren. DNA-Methylierung ist wichtig für die normale Entwicklung, da sie eine entscheidende Rolle in der Entwicklungsbiologie Programmierung, Zelldifferenzierung, Unterdrückung von retroviralen Elementen, X-Chromosom-Inaktivierung und genomische Prägung spielt. Eine der mächtigsten Methoden zur DNA-Methylierungs-Analyse ist Bisulfit-Mutagenese. Natriumbisulfit ist ein DNA-Mutagen, die Cytosine desaminiert in Uracile. Nach PCR-Amplifikation und seque<html> ncing werden diese Umwandlung Ereignisse wie Thymine erkannt. Methylierte Cytosine werden aus Desaminierung geschützt und damit als Cytosine bleiben, welche die Identifizierung von DNA-Methylierung bei der einzelne Nukleotid-Ebene 3. Die Entwicklung des Bisulfit-Mutagenese-Assay wurde von den ursprünglich gemeldeten 4-6 gegen diejenigen, die mehr sensitive und reproduzierbare 7 sind fortgeschritten. Ein wichtiger Fortschritt wurde Einbetten kleiner DNA-Mengen in einem Agarose-Kügelchen, wodurch Schutz der DNA vor der rauen Bisulfit-Behandlung 8. Damit konnte die Methylierungsanalyse auf Pools von Eizellen und Embryonen im Blastozysten-9 durchgeführt werden. Die anspruchsvollste Bisulfit-Mutagenese-Protokoll auf dem neuesten Stand ist für einzelne Blastozyste-Embryonen 10. Da jedoch Blastozysten im Durchschnitt 64 Zellen (mit einem Gehalt von 120 bis 720 pg genomischer DNA) haben, ist diese Methode nicht wirksam für die Methylierung Studien zu einzelnen Eizellen oder Embryonen-Spaltung. Zelt &quot;&gt; Aufnehmen von Hinweisen aus Agarose Einbettung von Minuten DNA-Mengen einschließlich Oozyten 11, hier präsentieren wir eine Methode, bei der Eizellen direkt in einem Agarose-Lyse-Lösung und Wulst unmittelbar nach der Abruf und die Entfernung der Zona pellucida von der Eizelle eingebettet sind. Dies ermöglicht uns, Bypass die beiden wichtigsten Herausforderungen der einzigen Eizelle Bisulfit-Mutagenese:. Schutz einer winzigen Menge von DNA vor dem Abbau und anschließende Verlust während der zahlreichen Schritte Protokoll Wichtig ist, wie Daten aus einzelnen Eizellen gewonnen werden, die Frage der PCR-Bias-Pools innerhalb Außerdem entfällt. , unbeabsichtigte Kontamination Cumulus-Zellen nachweisbar ist, durch diese Methode, da jede Probe mit mehr als einem Methylierungsmuster von der Analyse ausgeschlossen werden kann 12. Dieses Protokoll bietet ein verbessertes Verfahren für eine erfolgreiche und reproduzierbare Analyse der DNA-Methylierung in der Ebene einzelner Zellen und ist ideal geeignet, für die einzelnen Eizellen sowie Embryonen-Spaltung.

Bisulfit-Mutagenese ist der Goldstandard für die Analyse von DNA-Methylierung. Unsere modifizierte Protokoll ermöglicht DNA-Methylierungs-Analyse auf der Ebene einzelner Zellen und wurde speziell für die einzelnen Eizellen entwickelt. Es kann auch für die Spaltung-Embryonen verwendet werden.

Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

Die Epigenetik umfasst alle vererbbaren und reversiblen Modifikationen des Chromatins, welche die Genzugänglichkeit verändern und somit die primären Mechanismen für ... darstellen.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die DNA-Methylierung in einer einzelnen Oozyte zu analysieren. Dies wird zunächst erreicht, indem die Cumuluszellen und die Seifenpalita von den gesammelten Oozyten entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Oozyte in einer zwei zu eins-Aros-Lysepufferlösung einzubetten, um die geringe Menge an DNA vor Verlust oder Abbau zu schützen.Anschließend wird eine Bisulfit-Mutagenese durchgeführt, gefolgt von einer Amplifikation mittels nested Polymerase-Kettenreaktion. Der letzte Schritt besteht darin, das PCR-Produkt zu ligieren und zu klonen. Anschließend werden Klone ausgewählt, per PCR amplifiziert und zur Sequenzierung versandt.Schließlich wird die Bisulfit-Mutagenese in Kombination mit Sequenzierung verwendet, um die DNA-Methylierung an Cytosin-Phosphat-Guanin- oder CPG-Dinukleotiden eines Bereichs von Interesse in einer einzelnen Oozyte nachzuweisen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Bisulfit-Mutagenese mit großen Zellzahlen besteht darin, dass Daten aus einer einzelnen Oozyte gewonnen werden können, ohne dass eine Pooling-bedingte PCR-Verzerrung oder eine Kontamination durch somatische Zellen auftritt. Am Tag der Oozytengewinnung sollten frisch die im schriftlichen Protokoll aufgeführten Lösungen hergestellt werden; um die Wahrscheinlichkeit einer DNA-Kontamination zu verringern, sollten häufig die Handschuhe gewechselt und Filterpipettenspitzen verwendet werden. Außerdem sollten die Röhrchen beim Öffnen stets schräg gehalten und alle Röhrchen, wenn sie nicht benutzt werden, sofort wieder verschlossen werden.Beginnen Sie die OSI-Sammlung, indem Sie die dissezierten Maus-Ovidukte in M2-Medien geben und den M-Pulley zerreißen, um den Cumulus-Zellkomplex zu isolieren. Anschließend werden die Zellen mittels einer Lösung mit 0,3 Milligramm pro Milliliter Hyaluronidase in einem Tropfen von 30 Mikroliter M2-Medien vom Cumulus-Zellkomplex getrennt. Die Zellen sollten nur so lange in der Lösung verbleiben, wie es zum Entfernen der Cumuluszellen benötigt wird, da eine längere Einwirkung Schäden verursachen könnte.Spülen Sie die Oozyten durch Übertragung von Tropf zu Tropf in 30-Mikroliter-Tropfen M2-Medium. Entfernen Sie dabei regelmäßig die Cumuluszellen, insgesamt drei Spülgänge. Entfernen Sie die Zona pellucida mittels saurer Tyrode-Lösung.Legen Sie die Oozyten zuerst in einen Tropfen mit 30 Mikroliter Lösung und überführen Sie sie anschließend in einen weiteren Tropfen von 30 Mikrolitern. Jedes mitgeführte Medium würde die Säure verdünnen und ihre Wirksamkeit verringern. Belassen Sie die Zellen nur so lange in der Lösung, wie es zum Entfernen der Zona erforderlich ist, da eine längere Exposition sie beschädigen könnte.Nach dem Entfernen der Zona die Zellen erneut in einem Tropfen von 30 Mikrolitern M2-Medium waschen, um die Agarose-Einbettung durchzuführen. Stellen Sie zunächst die Lysepufferlösung auf einen 70 °C heißen Wärmeprobe. Geben Sie die vorgewärmte Niedrigschmelzpunkt-Agarose (LMP-Agarose) zur Lysepufferlösung hinzu, wodurch ein Verhältnis von zwei Teilen Agarose zu einem Teil Lysepuffer entsteht. Anschließend eine einzelne Oozyte in minimalem M2-Medium auf einen sauberen Objektträger geben.Der nächste Schritt besteht darin, die einzelne Zelle in die Agarose-Lyse-Lösung einzubetten. Dies muss schnell erfolgen, da die Agarose bei Temperaturen unter 65 Grad Celsius aushärtet. Pipettieren Sie unter dem Mikroskop 10 Mikroliter der Agarose-Lyse-Lösung in eine Pipettenspitze.Geben Sie vorsichtig etwa ein Mikroliter oder weniger der Agros-Lyse-Lösung auf den Objektträger, sodass sie sich mit dem minimalen Medium vermischt. Saugen Sie dann das Oozyte vorsichtig in die Pipettenspitze auf. Geben Sie danach das gesamte Volumen von 10 Mikrolitern in ein Eppendorf-Röhrchen mit 300 Mikrolitern Mineralspiritus, sodass die resultierende Tröpfchen eine kugelförmige Gestalt annimmt.Den Behälter 10 Minuten lang auf Eis inkubieren, um die Lyse durchzuführen. Entfernen Sie 300&nbsp;Mikroliter Mineralsöl und geben Sie 500&nbsp;Mikroliter Puffer mit SDS-Lysepuffer hinzu. Inkubieren Sie die Probe am zweiten Tag über Nacht in einem Wasserbad, das auf 50&nbsp;Grad Celsius eingestellt ist.Bereiten Sie die Bifulfid-Mutageneselösungen frisch gemäß der schriftlichen Anleitung vor. Beginnen Sie die Mutagenese, indem Sie vollständig 500 Mikroliter SDS-Lysepuffer entfernen. Beachten Sie, dass verbleibender Lysepuffer das Agros verdünnt, wenn es erhitzt wird, und die Perle in den nachfolgenden Schritten anfälliger für das Auflösen ist.Nach vollständiger Entfernung des Lysepuffers 300 Mikroliter Mineralöl hinzufügen. Die Probe 2,5 Minuten lang auf einem 90 °C heißen Block inkubieren. Darauf achten, dass keine Vermischung, Rührung, Verlängerung oder Temperaturschwankung erfolgt.Nach zweieinhalb Minuten inkubieren Sie die Probe 10 Minuten lang auf Eis. Zum Durchführen der Denaturierung entfernen Sie das Paraffinöl und geben ein Milliliter 0,1-molare Natriumhydroxidlösung zu dem Gefäß hinzu; schwenken und drehen Sie das Gefäß fünf bis sechs Mal um.Inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang in einem Wasserbad, das auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, und drehen Sie das Gefäß alle drei bis vier Minuten um. Die Perle sollte im Natriumhydroxid schwimmen. Beachten Sie, dass sich die Perle nicht mehr am Boden des Reaktionsgefäßes befindet.Um die Sulfittierung durchzuführen, zentrifugieren Sie das Gefäß vorsichtig, nachdem Sie das Natriumhydroxid entfernt haben. Geben Sie 300 Mikroliter Mineralöl und 500 Mikroliter BIS-Sulfitlösung hinzu. Achten Sie darauf, eine Belichtung mit Licht zu vermeiden, und inkubieren Sie das Gefäß dreiinhalb Stunden lang in einem 50 Grad Celsius warmen Wasserbad.Führen Sie nun die Desamination durch. Inkubieren Sie die Probe zuerst drei Minuten lang auf Eis, bevor Sie das Mineralsilikon und die BIS-Sulfitlösung entfernen. Nach einem vorsichtigen Schwenken geben Sie ein Milliliter 0,3-molare Natriumhydroxidlösung hinzu und schwenken das Gefäß fünf bis sechs Mal um. Die Probe 15 Minuten lang inkubieren. In einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius alle drei bis vier Minuten umdrehen; erneut sollte die Kugel vor Beginn der PCR im Natriumhydroxid schwimmen. Die Proben waschen, indem sie zuerst vorsichtig zentrifugiert werden.Entfernen Sie dann die Natronlauge und geben Sie ein Milliliter 1xTE, pH 7,5, hinzu. Schütteln Sie fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur. Nach einem zweiten vorsichtigen Zentrifugationsschritt entfernen Sie das 1xTE.Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zweimal. Anschließend ein Milliliter autoklaviertes, doppelt destilliertes Wasser hinzufügen. Fünf bis zehn Minuten bei Raumtemperatur schütteln, sanft zum dritten Mal abzentrifugieren und das Wasser entfernen.Wiederholen Sie die Spülung mit doppelt destilliertem Wasser zweimal. Entfernen Sie abschließend sämtlichen Überstand, sodass nur noch die Aros-Perle zurückbleibt. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert des Überstandes 5,0 beträgt.Falls das Überstand noch zu basisch ist, waschen Sie die Kügelchen erneut mit doppelt destilliertem Wasser. In der Zwischenzeit fügen Sie die PCR-Mischung der ersten Runde dem PCR-Gefäß gemäß der schriftlichen Anleitung hinzu. Bewegen Sie den festen Agro-Speed an den Rand des Einor-Gefäßes.Überführen Sie die Agro-Suspension dann vorsichtig in ein PCR-Röhrchen, erhitzen Sie sie eine Minute lang auf 70 Grad Celsius und mischen Sie sie anschließend; die Amplifikation wird gemäß des schriftlichen Protokolls durchgeführt. Bereiten Sie nach der ersten Amplifikationsrunde die PCR-Reaktion der zweiten Runde unter Verwendung von fünf Mikrolitern des Produkts der ersten Runde als Vorlage vor. Achten Sie darauf, unterhalb der Mineralschichtöl-Schicht zu pipettieren.Führen Sie die zweite Amplifikationsrunde wie im Text beschrieben als diagnostischen Test durch. Die Proben der zweiten Runde können mit einem restriktionsenzymatisch geschnitten werden, das methylierungs- oder stammspezifisch ist, und die Verdauungsprodukte werden mittels Elektrophorese auf einem 8 %igen Acrylamidgel analysiert. Heterogene Banden weisen auf mehr als eine Sequenz hin; klonen Sie das Produkt der zweiten Runde, indem Sie es in den Vektor ligieren, und führen Sie einen TA-Kloning gemäß der Beschreibung in der der vorliegenden Videoaufnahme beigefügten Publikation durch. Nach dem TA-Kloning wird die gesamte Reaktionsmischung auf eine Agar- und LB-Platte, ergänzt mit Ampicillin, X-Gal und IPTG, aufgebracht und die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert.Fügen Sie dann die Colony-PCR-Master-Mix-Lösung dem PCR-Röhrchen gemäß dem schriftlichen Protokoll hinzu. Wählen Sie eine weiße bakterielle Kolonie von der Platte mit einer Pipettenspitze aus und wirbeln Sie sie in 35 Mikroliter der Colony-PCR-Master-Mix-Lösung in einem PCR-Röhrchen auf. Fahren Sie fort, indem Sie die Suspension wie im Text beschrieben amplifizieren, und trennen Sie vier Mikroliter des PCR-Produkts mittels Elektrophorese an einem 1,5 %igen Agarosegel auf. Senden Sie abschließend etwa 30 Mikroliter des PCR-Produkts zur Sequenzierung von fünf Kolonie-PCR-Ansätzen pro Zelle. Sobald die Sequenzierungsresultate vorliegen, können die Methylierungsmuster analysiert werden: Jedes ursprüngliche Cytosin-Guanin, das als solches erhalten blieb, war methyliert. Umgekehrt war jedes ursprüngliche Cytosin-Guanin, das nun als Thymin-Guanin vorliegt, nach der nested PCR-Amplifikation unter Verwendung von Bisulfit-konvertierten Primern nicht methyliert.Es ist möglich, eine erfolgreiche Umwandlung zu bestätigen, indem eine korrekte Fragmentgröße auf einem Aros-Gel einzelner Metaphasen visualisiert wird. Zwei Oozyten repräsentieren ein elterliches Allel und weisen theoretisch ein geprägtes Methylierungsmuster auf. Solche PCR-Produkte der zweiten Runde können auf unbeabsichtigte Kontaminationen getestet werden.Ein Restriktionsenzym, das empfindlich gegenüber DNA-Methylierung ist, kann verwendet werden, um das PCR-Produkt der zweiten Runde zu verdauen, um zu bestimmen, ob es ein methyliertes oder unmethyliertes Allel enthält. Hierbei wird eine methylierte Cytosinbase innerhalb der Erkennungssequenz des Enzyms gespalten. Ein unmethyliertes Cytosin hingegen, das in Thymin umgewandelt wurde, wird vom Enzym nicht mehr erkannt und bleibt ungeschnitten. Jede Metaphase-Zwei-Oozyt-Probe, die sowohl methylierte als auch unmethylierte Allele enthält, sollte verworfen werden, da dies auf eine Kontamination mit Cumuluszellen oder den Einbezug eines Polkörperchens hinweist, nach Ligation und Transformation.Eine erfolgreiche Kolonie-PCR-Amplifikation kann auf einem AROS-Gel sichtbar gemacht werden, um sicherzustellen, dass Proben mit der korrekten Produktgröße zur Sequenzierung geschickt werden. Für dieses Beispiel beträgt die erwartete Amplikonlänge nach Ligierung hundertsechsundfünfzig Basenpaare. Hier weist Klon fünf eine falsche Amplikonlänge auf und sollte nicht zur Sequenzierung geschickt werden.Die Sequenz von fünf einzelnen Klonen aus einer Metaphase-zwei-Oozyte sollte fünf identische Methylierungsmuster und identische Nicht-CPG-Umwandlungsraten ergeben. Jegliche Proben, die mehr als ein Muster enthalten, sollten verworfen werden. Da ovulierte Metaphase-zwei-Zyten zwei Chromosomenkopien oder einen angehängten Polkörper enthalten, besteht die Möglichkeit, zwei ähnliche Sequenzmuster zu erhalten.Daten sollten von Zellen verworfen werden, die stark voneinander abweichende Methylierungsmuster aufweisen. Da eine Kontamination mit Cumuluszellen nicht ausgeschlossen werden kann, ist es wichtig, beim Durchführen dieses Verfahrens zunächst die Oozyten mehrfach in frischem Medium zu waschen, nach der HI-IDE-Behandlung, um so viele Cumuluszellen wie möglich zu entfernen. Zweitens verfestigt sich Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt bei Temperaturen unterhalb von 65 Grad Celsius, daher sollte sorgfältig, aber zügig gearbeitet werden.Und schließlich sind Natriumbisulfat und Hydrochinon lichtempfindlich, daher sollten Reaktionsgefäße und Lösungen mit Aluminiumfolie umwickelt werden.

Research

Forschung

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Biology

Biologie

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