Formulierungen für die Gefriertrocknung von Bakterien und deren Einfluss auf Zellebensdauer

Das Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Auswirkung verschiedener Gefriertrocknungsformulierungen auf das Zellüberleben zu beobachten. Zunächst werden unterschiedliche Formulierungen zur Gefriertrocknung von Zellkulturen hergestellt. Anschließend wird jeweils jede Formulierung mit der Zellkultur vermischt, gefriertrocknet, danach wieder rehydriert und anschließend die Überlebensraten gemessen.

Die Ergebnisse zeigen Unterschiede in den Überlebensraten, die auf die charakterisierten Eigenschaften zurückgeführt werden können. Diese Methode kann dabei helfen zu verstehen, welche physikalischen und strukturellen Eigenschaften einer Formulierung für das Zellüberleben während der Dehydrierung wichtig sind. Um eine Startkultur von Pseudomonas putter vorzubereiten, impfen Sie zunächst 100 Milliliter Triptisch-Soja-Brühe oder TSB mit einer Kolonie von Zellen an, die auf Agar, der mit Triptisch-Soja-Brühe oder TSB ergänzt wurde, kultiviert wurden. Inkubieren Sie die Kultur bei 30 Grad Celsius unter Schütteln bei 130 U/min für sieben Stunden.

Überführen Sie eine Aliquot aus der Kultur in frisches TSB und inkubieren Sie sie 16 Stunden lang. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie das Zellenpellet durch Resuspendierung in 150 Millimolar Natriumchlorid.

Zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie sie in Formulierungsmedium. Um Formulierungslösungen zur Gefriertrocknung von Zellen herzustellen.

Wiegen Sie die jeweiligen Matrixkomponenten ab und lösen Sie sie in Wasser, um isotonische Bedingungen zu erreichen. Stellen Sie die Lösung mit dem Hilfsstoff Natriumchlorid oder anderen zellverträglichen Lösungsmitteln ein. Um die Zellen homogen in einer Lösung mit niedriger Viskosität zu resuspendieren, wirbeln Sie sie in Lösungen mit hoher Viskosität.

Fügen Sie einen Rührstab hinzu und schütteln Sie die Mischung. Danach portionieren Sie die Formulierungen in vorab gewogene Gefriertrocknungsgefäße und wiegen Sie die Gefäße ab. Entnehmen Sie 100 Mikroliter aus jeder Probe und stellen Sie zehnfache Verdünnungsreihen her, plattieren Sie die gewünschten Verdünnungen und inkubieren Sie diese bei Raumtemperatur. Falls die Gefäße im Gefriertrockner versiegelt werden sollen, setzen Sie auf jedes Gefäß einen Gummistopfen von den plattierten Zellen.

Zählen Sie die Zellen in jeder Formulierung auf. Messen Sie mit der Ringmethode die Oberflächenspannung der unter Trockenheit befindlichen Bakterienmischungen. Reinigen Sie den Platining, indem Sie ihn in eine farblose Flamme halten, bis er rotglühend wird.

Spülen und wischen Sie den Messbehälter mit Aceton und einem fusselfreien Tuch und verbrennen Sie die Innenseite mit einer Flamme. Füllen Sie den Behälter mit der Lösung und lassen Sie die Oberfläche sich beruhigen, bevor Sie Messungen an Lösungen vornehmen, die Zeit benötigen, um das Gleichgewicht zu erreichen. Der hier verwendete Aufbau liefert qualitative Daten für Formulierungen mit hohen Viskositäten.

Verwenden Sie eine Lösung mit niedrigerer Konzentration, um die Oberflächenspannung zu messen, und extrapolieren Sie, dass die Gefriertrocknungsbedingungen an die physikalischen Eigenschaften der Formulierung angepasst werden müssen. Der wichtigste Parameter ist die Glasübergangstemperatur oder TG der Formulierung, bezeichnet als TG-Strich für die gefrierkonzentrierte Probe, was darauf hinweist, dass noch Wasser vorhanden ist. Um das Gefrierverhalten der Formulierung zu bestimmen, verschließen Sie fünf bis 10 Milligramm der Probe in einer Aluminiumpfanne für die differenzielle Scanning-Kalorimetrie (DSC) mit Deckel.

Bereiten Sie eine leere Schale als Referenz vor. Stellen Sie das DSC-Temperatur-Scan-Programm so ein, dass es den Einfriervorgang im Gefriertrocknungsprogramm nachahmt. Dies geschieht, weil die Abkühlkinetik die TG-Prime der ungefriergetrockneten Formulierungen vor Beginn des Heizscans beeinflussen kann.

Senken Sie die Temperatur deutlich unter die erwartete Tg ab. Wählen Sie für die untersuchten Formulierungen eine geeignete Heizrate. Das aufgezeichnete Wärmestromsignal wird in Watt ausgedrückt und hängt von der Heizrate ab.

Eine höhere Heizrate führt zu einem stärkeren Signal von TG-Prime; stellen Sie den Temperaturbereich so ein, dass sowohl TG-Prime als auch das Schmelzen der Formulierung abgedeckt werden. Sobald das Gefrierverhalten bestimmt wurde, passen Sie die Parameter des Gefriertrocknungsprozesses so an, dass die Temperatur der Probe stets unterhalb der TG der Probe liegt und der Kammerdruck eine schnelle Sublimation von Eis und restlichem Wasser in der Formulierung ermöglicht. Zum Schutz der getrockneten Produkte nach der Gefriertrocknung.

Steuern Sie die Probennatmosphäre, indem Sie die Proben im Gefriertrockner versiegeln, bevor am Ende des Gefriertrocknungszyklus das Vakuum abgelassen wird. Alternativ können die Vials mit einer bevorzugten Atmosphäre gefüllt werden. Es ist wichtig, die Proben keiner Umgebungsatmosphäre auszusetzen, da jegliche Feuchtigkeit oder Sauerstoff in der Lageratmosphäre die Überlebensfähigkeit der Zellen beeinflussen würden.

Wiegen Sie abschließend die Gefäße, um die Proben mittels Röntgenstrahlung zu analysieren. Geben Sie eine kleine Menge der bakteriellen Matrix auf einen Probenträger und befestigen Sie den Probenträger im Röntgenrefraktometer. Verwenden Sie die mit dem Röntgengerät kompatible Software, um kristalline Phasen in der Probe zu analysieren.

Um die bakterielle Matrix mittels Elektronenmikroskopie zu analysieren, bringen Sie eine kleine Menge auf Kohleband auf, das auf einem Scanning-EM-Stub befestigt ist. Laden Sie den SEM-Halter in einen Sputtercoater und beschichten Sie die Probe mit Gold und Palladium oder Platin, um die Probe abzubilden. Laden Sie den SEM-Halter in die Kammer und wählen Sie die geeigneten Bildgebungsparameter aus.

Beispielsweise verwenden wir an diesem Gerät eine Beschleunigungsspannung von fünf Kilovolt, eine Spotgröße von drei, einen Arbeitsabstand von fünf Millimetern und den Sekundärelektronendetektor. Diese Tabelle listet Daten für verschiedene Formulierungen auf, einschließlich thermischer Ereignisse, die mittels DSC während des Erhitzens der gefrorenen Formulierungen erfasst wurden, der Struktur der trockenen Proben sowie der Oberflächenspannung der Formulierungslösungen. Die Tg‘ von Saccharose liegt bei minus 40 Grad Celsius und kann bei Saccharosekonzentrationen unter 20 Gewichtsprozent schwer nachweisbar sein.

Das thermische Ereignis bei minus 35 Grad Celsius hängt vermutlich mit dem Beginn der Eisschmelze zusammen, wie hier gezeigt. Überlebensdaten für gramnegative P putter und grampositive a CHLOROPHYL cus, formuliert in verschiedenen auf Sacchariden basierenden Formulierungen. Beachten Sie, dass der Trend bezüglich der Wirksamkeit der Formulierungen bei der Unterstützung des Zellüberlebens für beide Bakterienspezies ähnlich ist.

Diese Darstellung veranschaulicht die Korrelation zwischen dem Überleben nach der Gefriertrocknung und den Oberflächenspannungen der Formulierungen, was darauf hinweist, dass höhere Oberflächenspannungen zu größeren Überlebensraten führen. Die hier gezeigten REM-Aufnahmen stellen getrocknete Formulierungen für vier verschiedene Polymere dar, deren Matrizen dem Aussehen von knusperpapierartigen oder miteinander verbundenen glatten Blättern ähneln, mit wellenförmigen Mustern eingebetteter Bakterien für fi, ccal und Saccharose. Die Blätter sind etwa einen Mikrometer dick und 10 bis 20 Mikrometer breit, wobei fi ccal eine glattere Oberfläche aufweist als HPMC und HEC, die deutlich dünnere Blätter bilden.

Und die Bakterien sind leichter sichtbar, möglicherweise weil das Verhältnis von Polymer zu Bakterien in diesen zellulosebasierten Formulierungen niedriger ist. Außerdem wurden Salzkristalle bei HEC und HPMC beobachtet, wobei letzteres eine größere Menge an Niederschlägen auf der Oberfläche der Polymerschichten zeigte. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Zellüberleben von den Eigenschaften der Formulierung abhängt, unter Verwendung der hier gezeigten Techniken.