Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, einen voroptimierten Eliza-Assay für TNF-Alpha-Zytokin auf die Xap-Plattform umzustellen und gleichzeitig alternative Antikörperpaare zu evaluieren. Dies wird erreicht, indem der Capture-Antikörper aus dem ELIZA-Kit zusammen mit drei anderen Capture-Antikörperkandidaten an vier verschiedene Mikrosphären- oder Bead-Sets gekoppelt wird, wenn er miteinander gemischt wird. Diese vier Sets ermöglichen die gleichzeitige Testung aller vier Kandidaten mit vier separaten Nachweisantikörpern, um das beste Antikörperpaar zu bestimmen.

Als nächstes werden zwei Xap-Assays mit den beiden optimalsten Antikörperpaaren konstruiert. Die Leistung der Assays wird dann mit der des ursprünglichen EISA-Assays in Bezug auf Signalstärke, Dynamikbereich und Empfindlichkeit verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass ähnliche Antikörper unter gleichen Bedingungen sehr unterschiedlich funktionieren können und dass mehrere Antikörper gleichzeitig mit dem Luminex Xap-Assay gescreent werden können, was zeigt, dass der Assay im Vergleich zu EISA eine erhöhte Sensitivität und einen erhöhten Dynamikbereich aufweist.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie EIS A besteht darin, dass xap-basierte Immunoassays es dem Forscher ermöglichen, mehrere Ziele zu testen oder, wie in diesem Fall, mehrere Antikörper gleichzeitig zu testen. Um den besten Antikörper zu identifizieren, der nachgewiesen wurde. Das Verfahren wird von Erica Lopez, einer assoziierten Wissenschaftlerin bei der Luminex Corporation, durchgeführt.

Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Auswahl und Vorbereitung von vier Capture-Antikörpern und vier Nachweisantikörpern, die spezifisch für humanes TNF alpha sind, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Bereiten Sie außerdem einen Bestätigungsantikörper vor, der spezifisch für die Wirtsspezies der Fängerantikörper ist. Bringen Sie die Reagenzien im Antikörper-Kopplungskit auf Raumtemperatur.

Beschriften Sie vier Reaktionsröhrchen mit den für die Kopplungsreaktion ausgewählten Nummern der Bead-Region. Übertragen Sie den Inhalt der vier Fläschchen mit den Magplex-Mikrosphären in die vier markierten Reaktionsgefäße. Waschen Sie jedes der Bead-Sets zweimal in 500 Mikrolitern Aktivierungspuffer und aktivieren Sie jedes Bead-Set mit den Sulf-ONHS- und EDC-Lösungen, wie im Antikörper-Kopplungskit beschrieben.

Benutzerhandbuch Wiederholen Sie nach einer 20-minütigen Inkubation auf einem Rotator den vorherigen Waschschritt mit den nun aktivierten Kügelchen insgesamt dreimal mit 500 Mikrolitern Aktivierungspuffer. Bereiten Sie für jede Wäsche vier separate 500-Mikroliter-Lösungen vor. Jeder enthält 7,5 Mikrogramm Gefangennahme-Antikörper-Inaktivierungspuffer.

Geben Sie diese vier Fänger-Antikörperlösungen in ihre jeweiligen Reaktionsröhrchen. Wirbeln Sie jedes Röhrchen sofort vor und inkubieren Sie es zwei Stunden lang auf einem Rotator. Wiederholen Sie den Waschschritt mit den nun gekoppelten Kügelchen insgesamt dreimal mit 500 Mikrolitern des Waschpuffers, der im Antikörper-Kopplungskit enthalten ist.

Nach dem letzten Waschschritt fügen Sie jedem Reaktionsröhrchen 500 Mikroliter Waschpuffer hinzu, um eine endgültige Stammkonzentration von 5 Millionen antikörpergekoppelten Kügelchen pro Milliliter Wirbel zu erreichen, und beschallen Sie dann die Reaktionsröhrchen, um die Kügelchen zu dispergieren. Zählen Sie die Anzahl der nach der Kopplungsreaktion zurückgewonnenen Kügelchen mit einem Zellzähler oder Hämozytometer. Die Wiederfindung aus der Kopplungsreaktion beträgt in der Regel über 90 %Bestätigen Sie, dass die Kopplungsreaktion erfolgreich war, indem Sie Testlösungen der gekoppelten Kügelchenmaterialien für jeden Satz mit einer Endkonzentration von 100 Kügelchen pro Mikroliter in Assay-Puffer vorbereiten und die Verdünnung der mit FICO-Erything markierten Antis-Spezies vorbereiten.

IgG-Bestätigungsantikörper in einer Dosis von vier Mikrogramm pro Milliliter im Assay-Puffer aliquotieren Sie 50 Mikroliter jeder Testlösung in vier Vertiefungen einer 96-Well-Platte mit rundem Boden, also insgesamt 16 Vertiefungen. Geben Sie dann 50 Mikroliter Assay-Puffer in acht der Vertiefungen, um den Hintergrund zu messen, und 50 Mikroliter verdünnten Bestätigungsantikörper in die acht verbleibenden Vertiefungen. Mischen Sie die Reaktionen schonend, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette mehrmals auf und ab pipettieren.

Den Teller abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenschüttler inkubieren lassen. Legen Sie die Platte für ein bis zwei Minuten auf einen magnetischen Plattenseparator, um die Kügelchen aus der Lösung zu ziehen. Entfernen Sie dann die Flüssigkeit, indem Sie die Platte gewaltsam umdrehen, während sie sich auf dem Separator über einem Abfallbehälter befindet.

Waschen Sie jede Vertiefung zweimal, indem Sie 100 Mikroliter Assay-Puffer hinzufügen und das SANE auf ähnliche Weise von der Platte entfernen. Mit dem magnetischen Plattenseparator resuspendieren Sie die Kügelchen in 100 Mikrolitern Assay-Puffer, indem Sie mit einer Mehrkanalpipette fünfmal vorsichtig auf und ab pipettieren. Analysieren Sie auf luminex xap Instrumenten, wie z.B. dem magix instrument.

Die Intensität des Fluoreszenzsignals dieser Reaktion ist direkt proportional zur Menge des Proteins auf der Oberfläche der Kügelchen, was eine schnelle Beurteilung der relativen Menge des an die Kügelchen gekoppelten Proteins ermöglicht. Um das effektivste Antikörperpaar im xap-Assay zu bestimmen, bereiten Sie eine erste Mischung aller vier Bead-Sets vor, indem Sie jeweils 10 Mikroliter zu 0,96 Millilitern Assay-Puffer hinzufügen. Bereiten Sie die Nachweis-Antikörperlösungen vor, indem Sie jeden Antikörper auf ein Mikrogramm pro Milliliter in Assay-Puffer verdünnen.

Auch ein Assay-Puffer. Bereiten Sie den TNF-Alpha-Proteinstandard des F- und E-Systems auf 2000 Pikogramm pro Milliliter vor und verdünnen Sie das Streptavidin R FICO-Eryn auf acht Mikrogramm pro Milliliter. Für den Screening-Assay werden 50 Mikroliter der antikörpergekoppelten Bead-Mischung in jede der 16 Vertiefungen einer CoStar-Platte mit rundem Boden und 96 Vertiefungen gegeben.

Geben Sie dann 50 Mikroliter Assay-Puffer in acht der 16 Wells, um den Hintergrund zu messen. Pipettieren Sie anschließend 50 Mikroliter des TNF-Alpha-Standards in die anderen acht Vertiefungen, um die Reaktion zu messen. Eine Stunde lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubieren, während auf einem Assay-Plattenschüttler geschüttelt werden.

Geben Sie dann 50 Mikroliter jedes der vier Nachweisantikörper in vier Vertiefungen, von denen zwei Hintergrundvertiefungen und zwei Response-Vertiefungen sind. 30 Minuten lang unter den gleichen Bedingungen inkubieren, nachdem 50 Mikroliter des SAPE-Reagenzes in alle Vertiefungen gegeben wurden. Inkubieren Sie erneut 15 Minuten lang unter den gleichen Bedingungen.

Legen Sie die Platte für eine Minute auf einen magnetischen Plattenseparator. Entfernen Sie dann die Flüssigkeit, indem Sie die Platte gewaltsam umdrehen, während sie sich auf dem Separator über einem Abfallbehälter befindet. Pipettieren Sie 100 Mikroliter Assay-Puffer in jede der 16 Vertiefungen.

Entfernen Sie dann die Flüssigkeit mit Hilfe einer magnetischen Trennung von den Kügelchen. Geben Sie anschließend 100 Mikroliter Assay-Puffer in jede der 16 Vertiefungen. Lesen Sie die Platte mit dem Luminex Mag-Picks-Instrument anhand der Bedienungsanleitung ab, um eine ordnungsgemäße Bedienung zu gewährleisten.

Wählen Sie ein Antikörperpaar aus, das die gewünschte Signalstärke erreicht. Nachdem Sie den besten Antikörper zum Einfangen ausgewählt haben, verdünnen Sie 100 Mikroliter dieses Antikörper-gekoppelten Beat-Materials auf 10 Milliliter mit Assay-Puffer. Geben Sie 50 Mikroliter der verdünnten Kügelchen in 78 Vertiefungen von zwei CoStar-Platten mit rundem Boden und 96 Vertiefungen.

Jede Platte wird verwendet, um die Leistung eines anderen Nachweisantikörpers zu bewerten. Bereiten Sie als Nächstes eine 12-Punkt-Standardkurve vor, die bei 8.000 Pikogramm pro Milliliter beginnt und bei vier Pikogramm pro Milliliter endet. Mit den F&E-Systemen.

Der TNF Alpha-Standard fügt jeder Platte sechs 50-Mikroliter-Replikate jeder Verdünnung hinzu, plus sechs Vertiefungen mit jeweils 50 Mikrolitern Assay-Puffer als Hintergrund, so dass insgesamt 78 Vertiefungen pro Platte vorhanden sind. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht, während Sie sie auf einem Assay-Plattenschüttler schütteln. Geben Sie dann 50 Mikroliter des ersten Nachweisantikörpers in alle 78 Vertiefungen der ersten Platte.

Wiederholen Sie den Vorgang für den zweiten Nachweisantikörper auf der zweiten Platte. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten lang unter den gleichen Bedingungen. Geben Sie dann die 50 Mikroliter des SAPE-Reagenzes in alle Vertiefungen jeder Platte.

Nachdem Sie die beiden Platten 15 Minuten lang lichtgeschützt geschüttelt haben, legen Sie die Platten eine Minute lang auf magnetische Plattenseparatoren. Entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie die Platte gewaltsam umdrehen, während sie sich auf dem Separator über einem Abfallbehälter befindet. Pipettieren Sie anschließend 100 Mikroliter Assay-Puffer in jede der 78 Vertiefungen auf den Platten, bevor Sie die Flüssigkeit aus den magnetischen Kügelchen entfernen.

Nachdem Sie den Beads in jedem der 78 Wells auf den Platten hundert Mikroliter Assay-Puffer zugesetzt haben, analysieren Sie die Platten auf dem Mag-Picks-Instrument anhand des Benutzerhandbuchs für den ordnungsgemäßen Betrieb. Befolgen Sie die Anweisungen, die mit den F&E-Systemen geliefert wurden, human TNF Alpha T NF SF one a DUO set ELI A Kit. Messen Sie die Antwort, die von dem mit dem Forschungs- und Entwicklungskit bereitgestellten Standard erzeugt wird.

Wiederholen Sie den ELI-a-Assay noch dreimal, wobei Sie die Erfassungs- und Nachweisantikörper des F- und E-Systems durch die Antikörper der anderen Anbieter ersetzen. Der Einfachheit halber kombinieren Sie die Antikörper nach Anbieter und bewerten Sie jedes Paar unabhängig voneinander, wie es das EISA-Format mit jedem der drei TNF-Alpha-Proteinstandards erfordert. Luminex Xap-Assays wurden als Multiplex durchgeführt, um alle vier Capture-Antikörper als Mischung zu bewerten, indem vier Sätze von TNF-alpha-Antikörpern kombiniert wurden, die an Mag PLX-Mikrosphären gekoppelt waren, wobei die Capture-Antikörper mit jedem der vier biotinylierten Nachweisantikörper einzeln bewertet wurden, so dass die Wechselwirkung eines Nachweisantikörpers mit jedem der vier Fangantikörper gleichzeitig bestimmt werden konnte.

Die Ergebnisse zeigten, dass das Antikörperpaar aus dem F&E-System DUO-Set am besten abschnitt, mit einer resultierenden Reaktion bei 6.183 medianen Fluoreszenzintensitätseinheiten oder MFI-Einheiten. Es wurde auch beobachtet, dass die Nachweisantikörper von Millipore und ABAM im XAP-Assay eine angemessene Reaktion zeigten, wenn sie mit den Capture-Antikörpern der RD-Systeme kombiniert wurden, während die Capture-Antikörper von Millipore, ACAM und Novus im XAP-Assay eine weniger wünschenswerte Reaktion hervorriefen. Das DUO-Set-Protokoll für F&E-Systeme wurde verwendet, um die vier Antikörperpaare in einem EISA-Format zu vergleichen.

Das F&E-Systemprotokoll wurde für alle Antikörperpaare verwendet, da es typische heute weit verbreitete EIA-Protokolle widerspiegelt und analog zu Protokollen ist, die mit der xap-Technologie verwendet werden. Die EISA-Tests zeigten, dass das Antikörperpaar aus dem F&E-System erneut die besten Ergebnisse lieferte. Das Antikörperpaar von Acam zeigte keine Reaktion, und die Antikörperpaare von Millipore und Novas zeigten bescheidene Reaktionen, um eine Variation der Antikörperreaktivität zu beurteilen.

Mit dem Standard wurden alle vier Antikörperpaare mit drei verschiedenen rekombinanten TNF-alpha-Proteinstandards von drei verschiedenen Anbietern getestet. Die Daten zeigen, dass die rekombinanten TNF-alpha-Proteinstandards der drei Anbieter gleichwertige Ergebnisse lieferten. Das TNF-alpha-Protein aus F- und E-Systemen wurde verwendet, um Standardkurven mit den ELSA- und XAP-Assays zu erstellen.

Während der ELI A-Assay mit dem Antikörperpaar des R&D-Systems durchgeführt wurde, wurde bei den xap-Assays der Capture-Antikörper des R&D-Systems und entweder der Detektionsantikörper aus R&D-Systemen oder Millipore verwendet. Das TNF-alpha-Protein aus F- und E-Systemen wurde verdünnt, um einen Konzentrationsbereich von 8.000 bis vier Pikogramm pro Milliliter zu erzeugen. Das Antikörperpaar aus r- und d-Systemen erzeugte das erwartete Ergebnis im Xap-Assay mit einer Reaktion von mehr als 20.000 MFI, wie gezeigt.

Wenn der Nachweisantikörper von Millipore mit dem Xap-Assay anstelle des Nachweisantikörpers des r und d-Systems verwendet wurde, betrug die Reaktion etwa 30 % der Reaktion, die mit dem Nachweisantikörper aus RD-Systemen erzielt wurde. Die grüne Linie in diesem Diagramm stellt die Standardkurve des ELA dar, die einen vom Hersteller empfohlenen TNF-alpha-Bereich von 16 bis 1000 Pikogramm pro Milliliter aufwies. Aufgrund der Begrenzung des Spektralphotometers war es nicht möglich, den Bereich des Eliza-Assays zu erhöhen.

Darüber hinaus wird der Dynamikbereich und die Empfindlichkeit beider Methoden besser veranschaulicht, wenn sie in einer logarithmischen Skala dargestellt werden. Eine klare Unterscheidung zwischen der Steigung der EISA-Reaktion und den Reaktionen der xap-Assays ist zu erkennen und deutet ferner auf eine stärker limitierende Fähigkeit zum Nachweis von TNF alpha mit dem EL iza sowohl bei höheren als auch bei niedrigeren Konzentrationen hin. Die Nachweisgrenzen oder LOD für die beiden funktionellen TNF-alpha-xap-Assays wurden approximiert, indem die niedrigste TNF-alpha-Konzentration mit einem beobachteten Ansprechpegel größer als der Hintergrund plus das Dreifache ihrer Standardabweichung oder SD von sechs Replikaten identifiziert wurde.

Hier kann beobachtet werden, dass bei Verwendung des f/d-Systempaares die niedrigste TNF-alpha-Konzentration bei 3,91 Pikogramm pro Milliliter eine Reaktion von 66 MFI erzeugte, was größer ist als die Reaktion für das Hintergrund-plus-Drei-SD-Treffen. Dieses Kriterium. Bei der Verwendung des Millipore-Nachweis-Antikörpers mit dem Erfassungsantikörper des F- und E-Systems lag die Nachweisgrenze bei weniger als 7,81 Pikogramm pro Milliliter.

In diesem Fall ist die zweitniedrigste TNF-alpha-Konzentration, die bei einer akzeptablen Reaktion von 17 MFI erzeugt wird, größer als die Reaktion der niedrigsten TNF-alpha-Konzentration plus dem Dreifachen ihrer Standardabweichung. In ähnlicher Weise wurde die Nachweisgrenze für das FuE-Duo-Set Eliza auf 63 bis 31 Pikogramm pro Milliliter geschätzt. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Schritte wie das Testen, verschiedene Probenmatrizen oder Konzentrationen von Antikörpern im Reporter durchgeführt werden, um den xap-Assay weiter zu optimieren.