Name: Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 48 s
Description: Lernen Sie die Umwandlung eines ELISA-Assays in ein Luminex xMAP-Verfahren zur Multiplex-Screening von Antikörperpaaren für TNF-Alpha. Diese Methode verbessert Sensitivität und Dynamikbereich erheblich.

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Diese Arbeit wurde von Luminex Corporation finanziert.

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<li>DuPont, N. C., Wang, K. H., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+comparison+of+Luminex+multiplex+cytokine+analysis+kits+with+ELISA%3A+Determinations+of+a+panel+of+nine+cytokines+in+clinical+sample+culture+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Validation and comparison of Luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: Determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants.</a> J. Reprod. Immunol. 66, 175-191 (2005).</li>
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<li>Rizzi, G., Zhang, Y. J., Latek, R., Weiner, R., Rhyne, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+development+of+a+Luminex-based+assay+for+the+detection+of+human+IL-23%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Characterization and development of a Luminex-based assay for the detection of human IL-23.</a> Bioanalysis. 2, 1561-1572 (2010).</li>
</ol>

Diese Arbeit wurde am Luminex Corporation mit Ausrüstung bei Luminex Corporation hergestellt getan. R &amp; D Systems &amp; EMD Millipore sind strategische Partner von Luminex Corporation, lizenziert zur Entwicklung und Vermarktung xMAP Multiplex Assays.

Die Umwandlung eines ELISA-Assays auf Basis der Luminex xMAP-Plattform kann so einfach sein wie Substitution Streptavidin Meerrettichperoxidase (SA-HRP) in einer typischen ELISA-Kit mit Streptavidin Phycoerythrin (SA-PE), und die Optimierung für die Leistung. Für diejenigen, die eine xMAP Immunoassay von Grund auf neu erstellen möchten, können dies mit einem einfachen Protokoll, das ermöglicht auch die schnelle, Multiplex-Auswertung der Antikörper-Paaren durchgeführt werden. Die Reagenzien für die xMAP Assay wurden leicht unter Verwendung des xMAP Antikörper Kupplungssatz zum Koppeln der Fänger-Antikörper bezeichnet, um MagPlex niedriger Konzentration Mikrokügelchen. Die Verwendung einer niedrigen Konzentration Mikrokügelchen verringert die Kosten der Assay-Entwicklung bei gleicher Testleistung höherer Konzentration Mikrokügelchen. Die Zeit, die erforderlich ist, um Mikrosphären gekoppelt MagPlex vorzubereiten, ist ca. 3 Stunden, das ist viel schneller als die 22 bis 24 Stunden erforderlich, um das Fell gut einer ELISA-Platte, gefolgt von einer Behandlungder beschichteten Vertiefungen. Die Leistung der xMAP-Versuch ist auch besser als der ELISA in Bezug auf die Nachweisgrenze (&lt;4 pg / ml vs&gt; 31 pg / ml) und der dynamische Bereich (&lt;4 pg / ml bis&gt; 8000 pg / ml vs 16 pg / ml bis 1000 pg / ml). Tafel Software haben eine begrenzte OD Bereich, der entweder 3 oder 4, OD, beschränken die obere Grenze des dynamischen Bereichs für einen Assay. Zweifellos wird nicht alle Antikörper in einem ELISA-Format zu arbeiten und nicht alle Antikörper, die gut funktionieren in einem ELISA sind leicht übertragbar auf die xMAP-Assay-Format. Da jedoch xMAP Assays können gemultiplext (dh, gleichzeitig ausgeführt werden), ist es möglich, mehrere Abscheidung und Nachweis-Antikörper-Kombinationen gleichzeitig zu evaluieren, das beste Paar zu identifizieren, für einen Assay zu verwenden. Dieses Verfahren spart erheblich Zeit und Reagenzien im Vergleich zu dem ELISA-Verfahren Entwicklung, die auf der Auswertung eines Paares in einer Zeit ist begrenzt. Wenn zwei oder mehr Antikörper-Paare ausführen äquivalent; andere Parameter des Assays könnenals Eignung des Paares (z. B. Verfügbarkeit, Kosten, usw.) zu bestimmen. Neben der verbesserten Assay-Performance und Flexibilität mit der xMAP-Assay, gibt es auch erhebliche Kosteneinsparungen. Die empfohlene Menge des Antikörpers zur Beschichtung eines einzigen Vertiefung eine ELISA-Platte ist 400 ng erforderlich ist, während die Menge der Kügelchen in einer Vertiefung einer xMAP Assay verwendet liegt bei ca. 7,5 ng. Somit wird die Menge des Antikörpers für ein ELISA benötigt auch wird mehr als 50 Testergebnisse, wenn es in einer xMAP Assay verwendet. Für Anwendungen mit wertvollen Proben, xMAP hat auch einen erheblichen Vorteil. Das Volumen der Probe für den ELISA empfohlen ist 100 ul während das Volumen für die xMAP-Assay erforderlich, dass die Hälfte oder weniger sein können. Zusammenfassend ist die Umwandlung eines ELISA-Assays auf Basis der Luminex xMAP-Plattform unkompliziert, effizient und Kosten sparend, während die Herstellung eines Assays mit überlegener Dynamik und Sensibilität.

<table border="1"><tbody><tr><td> Beschreibung </td><td> Verkäufer </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Menschliche TNF-α/TNFSF1A DuoSet ELISA-Kit </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY210 </td><td> Enthält monoklonale und polyklonale Biotin-gekoppelten Antikörpern und rekombinanten TNF-α-Protein-Standard </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab18696 </td><td> Fänger-Antikörper, Klon CH8820 </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> Abcam </td><td> Ab16166 </td><td> Biotin-gekoppelten Detektions-Antikörper, Klon AS1 </td></tr><tr><td> TNF-alpha-Protein </td><td> Abcam </td><td> Ab9642 </td><td> Rekombinanten TNF-α-Protein-Standard </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> NOVUS </td><td> NBP1-50115 </td><td> Fänger-Antikörper, Klon 4H31 </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> Novus </td><td> NB100-78162 </td><td> Biotin-gekoppelten Detektions-Antikörper, Klon MAb11 </td></tr><tr><td> TNF-alpha-Protein </td><td> Novus </td><td> NBC1-18460 </td><td> Rekombinanten TNF-α-Protein-Standard </td></tr><tr><td> Monoklonaler Antikörper gegen TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> MAB1141 </td><td> Fänger-Antikörper, klonen 3C7.2 </td></tr><tr><td> Polyklonalen Antikörper gegen TNF-α </td><td> EMD Millipore </td><td> 654250 </td><td> Kaninchen polyklonaler Antikörper-Erkennung </td></tr><tr><td> Streptavidin-Phycoerythrin </td><td> Moos </td><td> SAPE-001 </td><td> Fluoreszierenden Reporter-Reagenz für die Luminex xMAP-Test </td></tr><tr><td> MAGPIX w / Xponent Software </td><td> Luminex Corporation </td><td> MAGPIX-Xponent </td><td> Luminex-Gerät </td></tr><tr><td> xMAP Antikörper-Kupplung (AbC) Kit </td><td> Luminex Corporation </td><td> 40-50016 </td><td> Beinhaltet EDC-Reagenz, Sulfo-NHS-Reagenz, Aktivierung, Waschpuffer, 1,5 ml Reaktionsgefäße und Einwegpipetten </td></tr><tr><td> MagPlex Microspheres, geringe Konzentration </td><td> Luminex Corporation </td><td> MC10012-ID, MC10013-ID, MC10014-ID, MC10015-ID </td><td> Kügelchen mit niedriger Konzentration (bei ​​2,5 x 10 6 Kügelchen / ml) </td></tr><tr><td> EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin </td><td> Thermo Fisher </td><td> PI-21335 </td><td> Biotinylierungskit für unmodifizierte Detektionsantikörper </td></tr><tr><td> Tecan Infinite F200 Reader </td><td> Tecan </td><td></td><td> ELISA-Reader </td></tr><tr><td> Phosphate Buffered Saline </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P-3688 </td><td> 1% PBS-BSA, Assay-Puffer </td></tr><tr><td> One-Pint Kompakte Ultraschall-Reiniger, 115 VAC </td><td> Cole-Parmer </td><td> WU-08849-00 </td><td> Produzieren Sie eine effektive Betriebsfrequenz von 55 kHz </td></tr><tr><td> Magnetische Rohr Separator </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0288 bis 01 </td><td> Für einzelne 1,5 ml Röhrchen magnetische Trennung in Kopplung Waschschritte </td></tr><tr><td> Magnetische Plattenphasentrenner </td><td> Luminex Corporation </td><td> CN-0269 bis 01 </td><td> Für 96-Well-Platte magnetischen Trennung in Assay-Waschschritte </td></tr></tbody></table>

umbau eines capture-elisa zu einem luminex xmap assay unter verwendung eines multiplex-antikörper-screening-methode

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

Die Enzyme Linked Immuno Assay (ELISA) ist seit langem das wichtigste Werkzeug für den Nachweis von Analyten in biologischen Proben für die biowissenschaftliche Forschung und klinische Diagnostik. Jedoch hat ELISA Einschränkungen. Es wird typischerweise in einer 96-Well-Mikrotiterplatte durchgeführt, und die Vertiefungen werden mit Einfang-Antikörper beschichtet, die eine relativ große Menge an Probe, um ein Antigen von Interesse zu erfassen. Die große Oberfläche der Vertiefungen und die hydrophobe Bindung der Fänger-Antikörper können auch auf nicht-spezifische Bindung und erhöhten Hintergrund führen. Darüber hinaus verlassen sich die meisten ELISAs auf Enzym-vermittelte Verstärkung des Signals, um eine angemessene Empfindlichkeit zu erreichen. Eine solche Verstärkung ist nicht immer linear und kann somit die Ergebnisse verfälschen. In den vergangenen 15 Jahren hat eine neue Technologie bietet sich heraus, dass die Vorteile des ELISA, sondern ermöglicht auch einen höheren Durchsatz, höhere Flexibilität, geringere Probenvolumen und niedrigeren Kosten, mit einer ähnlichen WOrkflow 1, 2. Luminex xMAP-Technologie ist eine Mikrosphären (Perle) Array-Plattform ermöglicht sowohl Monoplex und Multiplex-Assays, die sowohl für Protein-und Nukleinsäure-Anwendungen 5.3 angewendet werden können. Die Perlen haben den Capture-Antikörper kovalent an eine kleinere Oberfläche immobilisiert, die weniger Capture-Antikörper und kleiner Probenvolumina, verglichen mit ELISA und nicht-spezifische Bindung wird deutlich reduziert. Kleinere Probenmengen sind wichtig bei der Arbeit mit Grenzmuster wie Cerebrospinalflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, etc. 6. Multiplexen der Test weiter reduziert Probenvolumen Anforderungen, so dass mehrere Ergebnisse aus einer einzigen Probe. Die jüngsten Verbesserungen von Luminex enthalten: die neue MAGPIX System, ein kleiner, billiger, einfacher zu bedienende Analysator; niedriger Konzentration Magnetic MagPlex Mikrokugeln, die den Bedarf an teuren Filterplatten eliminieren und kommen in einer Konzentration arbeiten besser für Assay-Entwicklung geeignet undLow-Throughput-Anwendungen, und die xMAP-Antikörper-Kupplung (AbC) Kit, das ein Protokoll, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien, die für Kupplung Perlen an den Fänger-Antikörper von Interesse enthält. (Siehe Abschnitt Materialien für eine detaillierte Liste der Inhalte der.) In diesem Experiment, setzen wir eine voroptimierte ELISA-Assay für TNF-alpha Zytokine an der xMAP-Plattform und die Performance der beiden Methoden 7-11. TNF-alpha als ein Biomarker bei der Messung von entzündlichen Reaktionen bei Patienten mit Autoimmunkrankheiten verwendet. Wir beginnen mit der Kupplung vier Kandidaten Fänger-Antikörper zu vier verschiedene Mikrosphären-Sets oder Regionen. Wenn sie miteinander vermischt, erlauben diese vier Sätze für die gleichzeitige Prüfung aller vier Kandidaten mit vier getrennten Nachweis von Antikörpern gegen die besten Antikörper Paar, spart Reagenzien, Probe und Zeit zu bestimmen. Zwei xMAP Assays werden dann mit den beiden optimale Antikörper-Paare ausgebildet und ihre Wirkung istim Vergleich zu der ursprünglichen ELISA-Test in Bezug auf Signalstärke, Dynamikbereich und Empfindlichkeit.

Ein ELISA kann leicht zu einem Luminex xMAP Assay umgewandelt werden und durch die Vorteile der Multiplexen mehrere Antikörper gleichzeitig gescreent werden, um eine optimale Antikörperpaar zu identifizieren, was zu einer erhöhten Empfindlichkeit und den Dynamikbereich, während reduzierenden Assay einsehbar.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

Der Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ist seit langem das primäre Instrument zum Nachweis interessanter Analyten in biologischen Proben sowohl für die Lebenswissenschaften ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, einen bereits optimierten Eliza-Assay für das Zytokin TNF Alpha auf die Xap-Plattform umzustellen und dabei alternative Antikörperpaare zu evaluieren. Dies wird erreicht, indem der Captur-Antikörper aus dem ELIZA-Kit zusammen mit drei weiteren in Betracht kommenden Captur-Antikörpern an vier verschiedene Mikrosphären- oder Partikelsets gekoppelt wird, die gemeinsam gemischt werden. Diese vier Sets ermöglichen es, alle vier Kandidaten gleichzeitig mit vier separaten Detektionsantikörpern zu testen, um das beste Antikörperpaar zu identifizieren.Als Nächstes werden zwei Xap-Assays mit den beiden optimalsten Antikörperpaaren aufgebaut. Die Leistung der Assays wird anschließend hinsichtlich Signalstärke, dynamischem Bereich und Empfindlichkeit mit der des ursprünglichen EISA-Assays verglichen. Die Ergebnisse zeigen, dass ähnliche Antikörper unter gleichen Bedingungen sehr unterschiedlich abschneiden können und dass mehrere Antikörper gleichzeitig mittels des Luminex-Xap-Assays getestet werden können, wodurch sich eine höhere Empfindlichkeit und ein größerer dynamischer Bereich im Vergleich zum EISA-Assay ergeben.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie EIS A besteht darin, dass xap-basierte Immunoassays dem Forscher ermöglichen, mehrere Zielstrukturen zu testen oder, wie in diesem Fall, mehrere Antikörper gleichzeitig zu untersuchen, um den besten Antikörper nachzuweisen. Das Verfahren wird von Erica Lopez, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin bei Luminex Corporation, durchgeführt.Beginnen Sie dieses Protokoll mit der Auswahl und Vorbereitung von vier Erfassungsantikörpern und vier Nachweisantikörpern, die spezifisch für humanes TNF-alpha sind, wie im schriftlichen Protokoll beschrieben. Bereiten Sie außerdem einen Bestätigungsantikörper vor, der spezifisch für die Wirtsart der Erfassungsantikörper ist. Bringen Sie die Reagenzien aus dem Antikörper-Kupplungs-Kit auf Raumtemperatur. Etikettieren Sie vier Reaktionsgefäße mit den für die Kopplungsreaktion ausgewählten Bead-Regionsnummern. Überführen Sie den Inhalt der vier Vials mit Mag-Plex-Mikrokugeln in die vier beschrifteten Reaktionsgefäße. Waschen Sie jeden Bead-Satz zweimal mit jeweils 500 Mikrolitern Aktivierungspuffer und aktivieren Sie jeden Bead-Satz mit den Sulf-NHS- und EDC-Lösungen gemäß der Anleitung im Antikörper-Kopplungs-Kit.Bedienungsanleitung: Nach einer 20-minütigen Inkubation auf einem Rotator den vorherigen Waschschritt insgesamt dreimal mit den nun aktivierten Perlen wiederholen, jeweils mit 500 µL Aktivierungspuffer. Für jede Wäsche vier separate Lösungen à 500 µL herstellen, wobei jede 7,5 µg Capture-Antikörper im Inaktivierungspuffer enthält.Fügen Sie diese vier Lösungen mit Fangantikörpern jeweils den entsprechenden Reaktionsgefäßen hinzu. Vortexen Sie jedes Gefäß unmittelbar danach und inkubieren Sie zwei Stunden auf einem Rotator. Wiederholen Sie den Waschschritt mit den nun gekoppelten Perlen insgesamt dreimal mit jeweils 500 µL des im Antikörperkoppelkit enthaltenen Waschpuffers.Nach dem letzten Waschschritt 500 µL Waschpuffer zu jedem Reaktionsröhrchen hinzufügen, um eine endgültige Stammlösungskonzentration von 5 Millionen Antikörper-gebundenen Perlen pro Milliliter zu erreichen; anschließend die Reaktionsröhrchen vortexen und danach sonifizieren, um die Perlen zu dispergieren. Die Anzahl der nach der Kopplungsreaktion gewonnenen Perlen mit einem Zellzähler oder Hämocytometer bestimmen. Die Ausbeute aus der Kopplungsreaktion liegt typischerweise über 90 %. Bestätigen Sie den erfolgreichen Abschluss der Kopplungsreaktion, indem Sie Testlösungen der gekoppelten Perlen-Stammlösungen für jeden Satz mit einer Endkonzentration von 100 Perlen pro µL im Assaypuffer herstellen und eine Verdünnung des mit FICO-erything markierten Antispezies-Antikörpers vorbereiten.Bestätigungsserum für IgG bei vier Mikrogramm pro Milliliter in Assaypuffer; aliquotieren Sie jeweils 50 Mikroliter jeder Testlösung in vier Vertiefungen einer runden 96-Loch-Platte, insgesamt 16 Vertiefungen. Geben Sie anschließend 50 Mikroliter Assaypuffer in acht der Vertiefungen zur Hintergrundmessung und 50 Mikroliter des verdünnten Bestätigungsserums in die verbleibenden acht Vertiefungen. Mischen Sie die Ansätze vorsichtig durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren mit einem Mehrkanalpipettiergerät.Decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Plattenrührer. Stellen Sie die Platte anschließend für eine bis zwei Minuten auf einen magnetischen Plattenabscheider, um die Perlen aus der Lösung zu ziehen. Entfernen Sie dann die Flüssigkeit, indem Sie die Platte kräftig über einem Abfallbehälter auf dem Abscheider umdrehen.Waschen Sie jede Vertiefung zweimal, indem Sie 100 Mikroliter Assaypuffer hinzufügen und das SANE auf ähnliche Weise von der Platte entfernen. Suspendieren Sie die Beads mithilfe des magnetischen Plattenabscheiders in 100 Mikroliter Assaypuffer erneut, indem Sie sie fünfmal vorsichtig mit einem Mehrkanalpipettiergerät auf- und abpipettieren. Analysieren Sie an einem Luminex-xap-Instrument, beispielsweise dem Magix-Instrument. Die Intensität des fluoreszierenden Signals dieser Reaktion ist direkt proportional zur Menge des Proteins auf der Oberfläche der Kügelchen und ermöglicht so eine schnelle Beurteilung der relativen Menge des an die Kügelchen gekoppelten Proteins. Um das wirksamste Antikörperpaar im xap-Assay zu bestimmen, bereiten Sie eine Anfangsmischung aller vier Kügelchensorten vor, indem Sie jeweils 10 µL zu 0,96 mL Assaypuffer hinzufügen. Bereiten Sie die Detektionsantikörperlösungen vor, indem Sie jeden Antikörper auf eine Konzentration von einem µg pro mL in Assaypuffer verdünnen.Außerdem ein Assaypuffer. Bereiten Sie den TNF-alpha-Proteinstandard des r- und d-Systems bei 2000 Pikogramm pro Milliliter vor und verdünnen Sie das Streptavidin-R-Phycoerythrin auf acht Mikrogramm pro Milliliter. Geben Sie 50 Mikroliter der Antikörper-gekoppelten Bead-Mischung in jede der 16 Vertiefungen einer CoStar-Rundboden-96-Loch-Platte für den Screening-Assay.Anschießend 50 µL Assaypuffer in acht der 16 Vertiefungen hinzufügen, um die Grundaktivität zu bestimmen. Danach 50 µL der TNF-alpha-Standardlösung in die anderen acht Vertiefungen pipettieren, um die Reaktion zu messen. Eine Stunde bei Raumtemperatur unter Schutz vor Licht und mit Schütteln auf einem Plattenschüttler inkubieren.Danach 50 µL von jeweils einem der vier Detektionsantikörper in vier Vertiefungen geben, von denen zwei Hintergrundvertiefungen und zwei Reaktionsvertiefungen sind. 30 Minuten unter den gleichen Bedingungen inkubieren, nachdem 50 µL des SAPE-Reagenz zu allen Vertiefungen hinzugefügt wurden. Anschließend erneut 15 Minuten unter den gleichen Bedingungen inkubieren.Stellen Sie die Platte eine Minute lang auf einen magnetischen Plattenabscheider. Entfernen Sie dann die Flüssigkeit, indem Sie die Platte kräftig über einem Abfallbehälter auf dem Abscheider umdrehen. Geben Sie 100 Mikroliter Assaypuffer in jede der 16 Vertiefungen. Entfernen Sie anschließend die Flüssigkeit von den Perlen mittels magnetischer Trennung. Geben Sie danach 100 Mikroliter Assaypuffer in jede der 16 Vertiefungen. Lesen Sie die Platte mit dem Luminex mag picks-Gerät, wobei Sie die Bedienungsanleitung für den korrekten Betrieb heranziehen.Wählen Sie ein Antikörpapaar aus, das die gewünschte Signalstärke aufweist. Nach der Auswahl des besten Erfassungsantikörpers verdünnen Sie 100 Mikroliter des mit Antikörpern beladenen Bead-Stamms auf 10 Milliliter mit Assay-Puffer. Geben Sie 50 Mikroliter der verdünnten Beads in 78 Vertiefungen zweier CoStar Rundboden-96-Well-Platten.Jede Platte wird verwendet, um die Leistung eines anderen Detektionsantikörpers zu bewerten. Bereiten Sie anschließend eine 12-Punkte-Standardkurve vor, beginnend bei 8.000 Pikogramm pro Milliliter und endend bei vier Pikogramm pro Milliliter. Mit den r- und d-Systemen.Fügen Sie sechs 50 µL-Wiederholungen jeder Verdünnung des TNF-Alpha-Standards sowie sechs Vertiefungen mit jeweils 50 µL Assaypuffer als Hintergrundkontrolle zu jeder Platte hinzu, insgesamt 78 Vertiefungen pro Platte. Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Lichtschutz mit Schütteln auf einem Plattenschüttler. Geben Sie anschließend 50 µL des ersten Detektionsantikörpers zu allen 78 Vertiefungen der ersten Platte hinzu.Wiederholen Sie dies für den zweiten Detektionsantikörper auf der zweiten Platte. Inkubieren Sie die Platten 30 Minuten unter denselben Bedingungen. Geben Sie dann 50 µL des SAPE-Reagenz in alle Vertiefungen jeder Platte.Nachdem die beiden Platten 15 Minuten lang geschützt vor Licht geschüttelt wurden, stellen Sie die Platten eine Minute lang auf magnetische Plattenabscheider. Entfernen Sie die Flüssigkeit, indem Sie die Platte über einem Abfallbehälter kräftig umdrehen, während sie sich auf dem Abscheider befindet. Danach pipettieren Sie 100 Mikroliter Assaypuffer in jede der 78 Vertiefungen der Platten, bevor die Flüssigkeit von den magnetischen Perlen wie zuvor entfernt wird.Nach Zugabe von hundert Mikrolitern Assaypuffer zu den Kügelchen in jedem der 78 Wells auf den Platten analysieren Sie die Platten mit dem Mag-Picks-Gerät, wobei Sie sich zur korrekten Bedienung auf die Bedienungsanleitung beziehen. Befolgen Sie die mit dem R and D Systems Human TNF Alpha TNFSF1A DUO Set ELISA Kit beigefügten Anweisungen. Messen Sie die Reaktion, die durch den mit dem R and D Kit bereitgestellten Standard erzeugt wird.Wiederholen Sie den ELISA-Assay dreimal, wobei Sie die Capture- und Detektionsantikörper des r- und d-Systems durch die Antikörper der anderen Hersteller ersetzen. Der Einfachheit halber sollten die Antikörper nach Hersteller gepaart und jedes Paar unabhängig gemäß dem EISA-Format mit jedem der drei TNF-alpha-Proteinstandards bewertet werden. Die Luminex-Xap-Assays wurden als Multiplex durchgeführt, um alle vier Capture-Antikörper gleichzeitig als Gemisch zu bewerten, indem vier Sätze von TNF-alpha-Antikörpern mit Mag-PLX-Mikrokügelchen gekoppelt wurden; die Capture-Antikörper wurden anschließend einzeln mit jedem der vier biotinylierten Detektionsantikörper getestet, sodass die Wechselwirkung eines Detektionsantikörpers mit jedem der vier Capture-Antikörper simultan bestimmt werden konnte.Die Ergebnisse zeigten, dass das Antikörperein aus dem r- und d-Systems-DUO-Set die beste Leistung erzielte und eine resultierende Reaktion von 6.183 medianen Fluoreszenzintensitätseinheiten oder MFI-Einheiten aufwies. Es wurde außerdem beobachtet, dass die Detektionsantikörper von Millipore und ABAM eine akzeptable Reaktion im XAP-Assay zeigten, wenn sie mit dem Capturing-Antikörper von RD-Systems kombiniert wurden. Dagegen führten die Capturing-Antikörper von Millipore, ACAM und Novus im XAP-Assay zu weniger befriedigenden Ergebnissen. Der Protokollansatz des r- und d-Systems-DUO-Sets wurde verwendet, um die vier Antikörpereinheiten im EISA-Format zu vergleichen.Das Protokoll von r und d systems wurde mit allen Antikörper-Paaren verwendet, da es typischen, heute weit verbreiteten EIA-Protokollen entspricht und Protokollen mit xap-Technologie analog ist. Die EISA-Tests zeigten, dass das Antikörper-Paar von r und d systems erneut die besten Ergebnisse lieferte. Das Antikörper-Paar von Acam zeigte keine Reaktion, und die Antikörper-Paare von Millipore und Novas zeigten bescheidene Reaktionen, um mögliche Unterschiede in der Antikörper-Reaktivität zu bewerten.Mit dem Standard wurden alle vier Antikörper-Paare mit drei verschiedenen rekombinanten TNF-alpha-Proteinstandards von drei verschiedenen Anbietern getestet. Die Daten zeigen, dass die rekombinanten TNF-alpha-Proteinstandards der drei Anbieter äquivalente Ergebnisse lieferten. Das TNF-alpha-Protein von r und d Systemen wurde zur Erstellung von Standardkurven mit den ELISA- und den XAP-Assays verwendet.Während der ELI A-Assay mit dem Antikörpapaar von r und d system durchgeführt wurde, verwendeten die Xap-Assays den immobilisierenden Antikörper von r und d system sowie entweder den detektierenden Antikörper von r und d systems oder von Millipore. Das TNF-alpha-Protein von r und d systems wurde verdünnt, um eine Konzentrationsreihe von 8.000 bis vier Pikogramm pro Milliliter zu erzeugen. Das Antikörpapaar von r und d systems führte im Xap-Assay zum erwarteten Ergebnis mit einer Antwort von über 20.000 MFI, wie dargestellt.Wenn der Detektionsantikörper von Millipore im Xap-Assay anstelle des Detektionsantikörpers von RD Systems verwendet wurde, betrug die Reaktion etwa 30 % der mit dem Detektionsantikörper von RD Systems erzielten Reaktion. Die grüne Linie in diesem Diagramm stellt die Standardkurve des ELA dar, deren vom Hersteller empfohlener TNF-alpha-Bereich zwischen 16 und 1000 Pikogramm pro Milliliter lag. Aufgrund der Begrenzung des Spektrofotometers war es nicht möglich, den Messbereich des ELISA-Assays zu erweitern.Weiterhin wird die Dynamik und Empfindlichkeit beider Methoden deutlicher, wenn sie in einer logarithmischen Skala dargestellt werden. Ein klarer Unterschied zwischen der Steigung der EISA-Antwort und den Antworten der xap-Assays ist erkennbar und weist darauf hin, dass die EL iza bei höheren und niedrigeren Konzentrationen eine eingeschränktere Nachweisfähigkeit für TNF-alpha aufweist. Die Nachweisgrenzen oder LOD für die beiden funktionalen TNF-alpha-xap-Assays wurden angenähert, indem die niedrigste TNF-alpha-Konzentration identifiziert wurde, bei der ein beobachtetes Antwortsignal über dem Hintergrund lag und zusätzlich das Dreifache der Standardabweichung (SD) aus sechs Wiederholungen betrug.Hier ist zu beobachten, dass bei Verwendung des R- und D-Systems-Paares die niedrigste TNF-alpha-Konzentration von 3,91 Pikogramm pro Milliliter eine Antwort von 66 MFI hervorrief, was über der Antwort für den Hintergrund plus dreifacher Standardabweichung liegt, gemäß diesem Kriterium. Wenn der Millipore-Nachweisantikörper zusammen mit dem Erfassungsantikörper des R- und D-Systems verwendet wurde, betrug die Nachweisgrenze weniger als 7,81 Pikogramm pro Milliliter.In diesem Fall zeigte die zweitniedrigste TNF-alpha-Konzentration eine akzeptable Reaktion mit 17 MFI, was über der Reaktion der niedrigsten TNF-alpha-Konzentration plus dem Dreifachen ihrer Standardabweichung lag. Ebenso wurde die Nachweisgrenze für das r- und d-System-Duo-Set Eliza auf zwischen 63 und 31 Pikogramm pro Milliliter geschätzt. Nach diesem Verfahren können weitere Schritte wie Tests, verschiedene Probenmatrizes oder Antikörperkonzentrationen im Reporter durchgeführt werden, um den Xap-Assay weiter zu optimieren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Mit Luminex Corporation xMAP-Mikrokugel-Technologie haben wir die Multiplex Fluorometric Immunoassay (MFIA) für serologischen Überwachung von verschiedenen Labors Tierarten entwickelt. Die MFIA ist eine Suspension Microarray, wo Antigen, Gewebekontrolle oder Immunglobuline kovalent an farbkodierten Polystyrol-Mikrokügelchen verbunden sind. Die MFIA Prüfverfahren sowie verschiedene Themen zur Fehlerbehebung adressiert ist.

Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

Das Video zeigt die Implementierung der Snap-Chip-Technologie für kreuzreaktivitätsfreie Multiplex-Sandwich-Immunoassays. Die einfache Aktion des Einrastens von zwei Microarray-Objektträgern, die jeweils unterschiedliche Reagenzien enthalten, gewährleistet einen Reagenzientransfer ohne Kreuzkontamination und hilft beim Nachweis mehrerer Proteine mit Hilfe eines Sandwich-Immunoassays.

Eine Snap-Chip-Technologie für einen kreuzreaktivitätsfreien Multiplex-Sandwich-Immunoassay

Dieses Video demonstriert den quantitativen Multiplex-Bakteriennachweis mit carboxylierten magnetischen Polystyrol-Mikrosphären, die in unterschiedliche Sätze eingefärbt sind. Das Verfahren umfasst die Bildung von Kügelchen-Bakterien-Komplexen, die magnetische Trennung und die flussbasierte Analyse, die eine präzise und gleichzeitige Quantifizierung mehrerer Bakterien in derselben Reaktionsvertiefung ermöglicht.

Quantitativer Multiplex-Bakteriennachweis mit Farbstoff-markierten magnetischen Mikrosphären

Messung von Biomarkern in komplexen biologischen Proben wird zunehmend Führung klinische Entscheidungsfindung. Wir beschreiben eine sehr empfindliche Methode, um gleichzeitig die Herzmyosin bindendes Protein-C, Creatin-Kinase-MB und Troponin I im Serum von Patienten mit Myokardinfarkt und gesunden Kontrollpersonen.

Eine empfindliche und spezifische Quantifizierung Methode zur Bestimmung der Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C durch Elektrochemilumineszenz Immunoassay

Im aktuellen Klima knapper Ressourcen entstehen neue Technologien, die es Forschern ermöglichen, Studien billiger, schneller und präziser durchzuführen. Hier beschreiben wir die Entwicklung eines bead-basierten Speichel-Antikörper-Multiplex-Immunoassays zur gleichzeitigen Messung der Exposition des Menschen gegenüber mehreren Umweltpathogenen.

eine Speichel- Antikörper Multiplex-Immunoassay Entwicklung der Humanexposition Umwelt Pathogens zu messen

Wir zeigen eine Snap-Chip-Technologie für die Durchführung von cross-reactivity-freie gemultiplexten Sandwich Immunoassays durch Einrasten einfach zwei Folien. Ein Snap-Apparat dient zur Übertragung von zuverlässig Reagenzien von Microarray-Microarray. Die Snap-Chip kann für jede biochemischen Reaktionen erfordern NS1 der verschiedenen Reagenzien ohne Cross-Kontamination verwendet werden.

Snap Chip für Cross-reactivity frei und Spotter Multiplex Sandwich Immunoassays

Wir modellieren einen einfachen Multiplex-ECL-Assay, der 7 Autoantikörper-Assays miteinander kombiniert. Der Test ist in der Lage, gleichzeitig auf T1D und mehrere andere Autoimmunerkrankungen zu untersuchen, einschließlich Zöliakie, Autoimmunerkrankungen der Schilddrüse und autoimmunes polyglanduläres Syndrom 1.

Ein Hochdurchsatz-Elektrochemilumineszenz-7-Plex-Assay zum gleichzeitigen Screening auf Typ-1-Diabetes und mehrere Autoimmunerkrankungen

Ein Flow-Analysesystem für perlenbasierte Multiplex-Assays, das eine Zwei-Reporter-Ablesung ermöglicht, wurde für die Entwicklung von multiplex-serologischen und Antikörper-Neutralisationsassays verwendet, die gleichzeitig neutralisierende IgG- und IgM-Antikörper für SARS-CoV-2 messen können.

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Im Einklang mit dem dringenden Bedarf an Screening auf Typ-1-Diabetes, Zöliakie und Coronavirus-Krankheit 2019 haben wir einen 6-Plex-Elektrochemilumineszenz-Assay mit hohem Durchsatz entwickelt, um alle vier Inselautoantikörper, Gewebetransglutaminase-Autoantikörper und Antikörper gegen die Rezeptorbindungsdomäne des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 gleichzeitig nachzuweisen.

Ein Hochdurchsatz-Multiplex-Screening auf Typ-1-Diabetes, Zöliakie und COVID-19

Ein Dreikanal-Dual-Reporter-Fluoreszenz-Flussanalysesystem wurde verwendet, um einen Bead-basierten Multiplex-Immunoassay zu entwickeln, der gleichzeitig Serumproben auf IgG und IgM auswertet, die gegen mehrere Antigene verschiedener Borrelienspezies extrahiert wurden, die die Lyme-Borreliose in Europa und Nordamerika verursachen.

Gleichzeitiger Nachweis verschiedener Antikörperklassen in einem serologischen Multiplex-Test

Lernen Sie die Umwandlung eines ELISA-Assays in ein Luminex xMAP-Verfahren zur Multiplex-Screening von Antikörperpaaren für TNF-Alpha. Diese Methode verbessert Sensitivität und Dynamikbereich erheblich.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

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